无创产前检测技术在产前诊断中的临床应用与面临的问题

作者:陈琦 包美静 王冠群 褚雨晴 林杨
作者单位:吉林大学第二医院妇产科 2022-10-08

林杨,副教授、副主任医师、博士研究生导师、医学博士、吉林大学第二医院妇产科副主任。主要擅长领域:妇产科常见疾病的诊疗,阴道镜下早期发现诊断宫颈与下生殖道阴道癌前病变,HPV感染相关疾病的基础与临床研究。学术任职:中国医药教育协会妇科专业委员会宫颈病变分会常委、中国宫颈疾病与宫颈癌防治专业委员会委员、中国优生科学协会阴道镜和宫颈病理学协会(CSCCP)委员、吉林省妇产科质控中心副主任委员、吉林省妇科肿瘤专业委员会常委。科研方面:参与国家级及省级项目20余项,作为负责人主持国自然青年项目、省级项目8项;发表文章40余篇,作为第一作者/通讯作者发表SCI文章13篇。参与编写论著8部。


陈琦,吉林大学第二医院妇产科学在读硕士研究生,师从林杨教授。研究方向:阴道镜下早期发现诊断宫颈与下生殖道阴道癌前病变,HPV感染相关疾病的基础与临床研究。


【摘要】产前诊断是降低出生缺陷发生率的重要手段,目前作为金标准的侵入性诊断方法存在导致羊膜腔感染、流产等严重后果的风险。近年来,产前检查的趋势逐步向非侵入性检查转变,无创产前检测(NIPT)可减少非必要的侵入性检查,并对血清学筛查不明确者及侵入性产前诊断禁忌症者等都具有极大意义,现在不同国家得到越来越多的应用。本综述旨在阐述NIPT的技术流程以及该技术目前的临床应用和尚存问题。


【关键词】无创产前检测;产前诊断;染色体异常


产前诊断是指在胎儿出生前应用各种检测技术对胎儿有无结构畸形、遗传病或先天性疾病作出诊断,是降低出生缺陷发生率的重要手段[1]。染色体异常是常见的婴儿机体发育异常原因之一,传统的诊断方法通过羊膜腔穿刺取样,对羊水中胎儿脱落细胞培养以及进行染色体核型分析[2],是染色体病变产前诊断的金标准,但侵入性诊断方法在取样的过程中可能导致胎膜早破、羊膜腔感染及流产发生,根据国际已有的临床资料统计,操作相关性胎儿丢失率在0.4%到1.1%[3]。无创产前检测(non-invasive prenatal testing,NIPT)是基于新一代DNA测序技术对母体外周血浆中的胎儿游离DNA片段进行测序,并将测序结果进行生物信息分析,可以从中得到胎儿的遗传信息,判断胎儿是否存在染色体异常,避免了传统有创技术带来的相关风险。随着近年来分子生物学技术的不断发展,NIPT在产前诊断中发挥着越来越重要的作用,例如,荷兰已将NIPT列入了常规产前筛查程序,而我国经济水平较高地区也将其应用于一线产前筛查。本文将着重从实验室技术、临床应用及其尚存问题等方面对目前NIPT在产前诊断中的应用的研究进展进行论述。


一、NIPT的实验室技术及质量控制


1. NIPT的实验室技术:NIPT实验室应当合理规划实验区域,按照一般实验顺序,必要包含以下四个分区:试剂准备区、标本与文库制备区、文库扩增与检测区、测序区;各区功能相互承接,首先应在试剂准备区进行所需试剂的储存、配制的前置工作;之后在标本与文库制备区对样本进行血浆分离、DNA提取、末端修复、接头连接与纯化;如血浆提取2次仍不符合质量标准,应当与采血机构充分沟通后重新采血或决定其他后续处理。分离完的血浆样本可在-20℃暂存1周,为避免反复冻融,可在-70℃以下长期保存并将剩余血浆标本在-70℃以下保存3年或以上[4]。血浆DNA提取完成后在文库扩增与检测区继续进行PCR扩增与纯化、文库QC、混合文库、混合文库QC;完成上述样本准备后,在测序区进行测序前准备并上机测序,完成测序得到样本结果进行信息分析,对样本报告审核无误后发放[5]。


1997年,Dennis Lo等研究发现了孕妇的外周血浆中有胎儿游离DNA(cell free fetal DNA,cff-DNA)的存在[6],这一重大发现使得NIPT筛查胎儿染色体病成为了可能,随着新一代分子生物学技术突飞猛进的发展,当今NIPT有了新的突破和更为广泛的临床应用。目前临床上使用无创产前基因检测的一般技术流程如下:抽取孕妇外周静脉血3~5mL,行血浆胎儿DNA筛查,后进行常规分离血浆、提取外周血DNA片段、制备文库,使用高通量模式上机测序,将获得的原始数据直接传至大型测序仪;通过比对Ensemble数据库中人类基因组参考序列来确定每一个测序的读长(Reads),从而判断胎儿是否存在染色体异常[7, 8]。


2. NIPT的质量控制指标:在NIPT检测结果的质量控制中,对T21、T18、T13三体的各项质控指标参考国卫办妇幼发〔2016〕45号文件[4]:T21、T18、T13三体综合征检出率分别不得低于95%、85%、70%;T21、T18、T13的复合假阳性率不得高于0.5%,复合阳性预测值不得低于50%。其他目标疾病的复合检出率不低于70%。致病性拷贝数变异(pathogenicity copy number variation,pCNV)的假阳性率不高于0.5%。总体pCNV的复合阳性预测值不低于30%,检测失败率不超过5%[9]。


二、NIPT的临床应用现状


1. NIPT筛查常染色体非整倍体疾病:21三体综合征,即唐氏综合征(Down syndrome,DS),是最早被确定的染色体异常性遗传病,也是目前临床最常见的染色体病,是由于第21号染色体异常而引起的胎儿发育迟缓、畸形,甚至早期即在宫内夭折。相比于18三体综合征(Edwards syndrome,ES)和13三体综合征(Patau syndrome,PS),其发病率更高,约为1/800活产儿,并随母亲年龄增长而增加[10];ES的发病率约为1/7500活产儿,PS在活产儿的发病率则更低,约为1/15000。因此,唐氏综合征的产前筛查一直尤为重要[11, 12]。有研究指出,相较于传统的唐氏筛查,NIPT具有更高的敏感性及特异性,一篇2017年发表的meta数据分析得出,应用NIPT检测T21、T18、T13的敏感性及特异性均大于99%,远高于血清学筛查70%的准确率[13],显著减少了非必要的侵入性产前诊断,极大程度上避免了侵入性产前检查所导致的流产和胎儿宫内感染等严重后果的风险。《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》于2016年将T21、T18和T13三体综合征这3种常见胎儿染色体非整倍体异常导致的染色体病列为NIPT的目标疾病。综上,NIPT对胎儿常染色体非整倍体疾病的检测具有诊断准确率高、敏感性高、无创伤、低风险的优点,值得临床应用和进一步推广。但国内外现有研究报道,目前于临床而言,NIPT仍是一种筛查手段,还不能作为最终确诊的方法,由于其假阳性结果的存在,在NIPT筛查T21、T18和T13三体高风险情况时,仍然需要侵入性诊断加以确诊。


2. NIPT筛查胎儿性染色体非整倍体疾病(SCAs):除了检测常见的常染色体非整倍体综合征外,NIPT技术对性染色体非整倍体疾病(sex chromosome aneuploidies,SCAs)的检测也有较高的准确性[14, 15],扩宽了筛查的疾病谱。SCAs在新生儿中的发病率为1/1200至1/400,在胎儿期则高达1/435,近为21三体(发病率约1/800)的2倍。SCAs主要包括先天性卵巢发育不全(又称Turner综合征,45,X)、超雌综合征(47,XXX)、超雄综合征(47,XYY)、克氏综合征(47,XXY)[16]。其中Turner综合征最为常见,可导致胎儿在孕期自然流产,其他SCAs胎儿因难以由B超检查发现而常致漏诊[17]。NIPT作为一种高精度无创筛查方法,可以有效筛查出胎儿SCA病例[18],Zhang等[19]及罗玉琴等[20]实验室运用NIPT技术发现性染色体非整倍体的阳性预测值基本一致,分别为55%和57.25%,魏凤香等[21]研究结果也提示,NIPT作为一线筛查技术,可以有效筛检传统血清学筛查漏筛的产前SCA病例,阳性预测值在47,XXX为21.3%、47,XXY为33.1%、47,XYY为24.3%,均高于45,X的16.7%,可能因为X染色体含有较多的GC碱基对而增加了测序难度,另有研究认为与孕妇年龄有关[22]。因此,筛查前应告知受检孕妇,目前NIPT的筛查范围可以扩大到性染色体非整倍体疾病,但出现假阳性的可能性较筛查常染色体非整倍体疾病增加,特别是Turner综合征,必须行有创产前诊断确诊。


3. NIPT筛查致病性拷贝数变异(pCNV):拷贝数变异(copy number variations,CNV)是由基因组发生重排而导致的,一般指长度在1kb至3kb之间的基因组大片段的拷贝数的增加或减少,主要表现为亚显微水平的缺失和重复,致病性CNV(pCNV)引起的基因组疾病是胎儿各种出生缺陷的重要遗传学病因之一,而该类疾病也在NIPT技术的检测范围之内。国外研究表明,胎儿携带pCNV的比例在孕妇中达1.6%~1.7%[23]。近几年,基于对人类全基因组CNV的分析,在不需要培养细胞的情况下,染色体-微阵列分析方法(chro-mosome microarray analysis,CMA)作为一种新的染色体检测技术,在产前诊断方面发展迅速,它已逐步应用于产前诊断,现已成为产前诊断细胞遗传学检测中的常规项目[24-26]。2021年,《孕妇外周血浆胎儿游离DNA高通量测序筛查致病性拷贝数变异的技术标准共识》[9]将22q11.2微缺失综合征、PWS/AS综合征、Smith-Magenis综合征、Wolf-Hirschhor综合征等10种染色体或pCNV疾病纳入基于NIPT高通量测序无创筛查胎儿pCNV的目标疾病。童珂雅等[27]研究也提示NIPT是筛查羊水染色体异常的有效手段,并能通过运用CMA技术检测出NIPT结果高风险中严重危害胎儿生长健康的pCNVs。同时,应该明确的是,无创产前检测是一种筛查技术而不是产前诊断。可能存在胎盘和胎儿DNA不一致的情况[28],从而导致假阳性风险,且NIPT筛查pCNV效能不如筛查T21的效能高。


三、NIPT面临的问题与前景展望


综上所述,NIPT在应用于临床时所存在的假阳性率是其还不能作为产前诊断手段和限制其临床有效性和实用性的重要原因,也是该技术面临的首要问题。现有研究报道,由于大多数游离DNA来自母体,母体基因组中的拷贝数变异(mCNV)会导致检测结果偏差从而降低NIPT的特异性,即母体拷贝数变异(mCNV)是NIPT假阳性结果的主要来源[29]。Kaseniit等[30]实验室通过针对mCNV的新算法,使mCNV引起的假阳性率降低到了1/520000以下,较传统算法减少了600倍。这意味着随着技术进一步发展,即使存在范围广泛的mCNV,NIPT的高特异性也是可能的。另外,NIPT是否可以在所有地区作为一线筛查技术,应用于所有孕妇,还需考虑该筛查技术在不同地区的覆盖度、孕妇接受度以及服务价格等多方面综合因素。

虽然NIPT目前并不能取代侵入性穿刺采样检查作为诊断手段,但其为染色体病的精准预防提供了可能性,另有研究表明,NIPT对于单基因疾病(single-gene disorders,SGD)的筛查也具有一定的潜力[31]。近年来,产前检查的趋势正逐步从大规模侵入性检查向非侵入性检查转变,基于NIPT结果诊疗方案可在最大程度上减少非必要的有创检查[32],并且NIPT对血清学筛查不明确者及介入性产前诊断禁忌症者等都具有极大意义,相信未来会通过进一步升级测序技术流程,提高生物信息学分析算法和文库构建,高精度采集胎儿游离DNA,同时结合超声、血清学检查,提高结果的准确性及应用的广泛性,更好地发挥NIPT的优势,实现染色体异常疾病、单基因疾病的精准检测,从而尽可能避免使用侵入性采样诊断。


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2022年9月:妊娠产前诊断与新生儿筛查