小儿HIV感染实验室诊断检测方法与治疗监测

朱渝，主任医师，博士研究生，硕士生导师。现任四川大学华西第二医院小儿感染科科主任。专业研究方向为儿童感染性疾病、传染病及流行病学，在四川大学华西第二医院儿童感染病领域工作十多年。擅长儿童各类细菌、真菌及病毒感染性疾病的预防、诊断、治疗，尤其对儿童结核病、肝病有丰富的临床经验。已发表四十篇儿科感染相关文章，主研国家、省部级科研课题5项，参与编写国家级专著数本。学术任职：中华医学会结核病分会儿童结核病学组副主任委员，中华医学会儿科学分会流行病学组筹委会委员，中华医学会感染病分会儿童感染与肝病学组委员，中华妇幼保健促进会儿童疾病和保健分会儿童感染性疾病与保健学组副组长。承担“十三五”科技部传染病重大专项子课题项目，发表儿童感染及结核病相关SCI论文40余篇。

黄春燕，重庆医科大学学士学位，现于四川大学攻读硕士学位。从事儿科临床工作数载，具有丰富的临床经验，擅长儿科常见病、多发病的诊疗。

【摘要】小儿HIV感染是全球面临的重大公共卫生问题，HIV患儿的及时及正确检测对提高患儿的疗效至关重要。目前我国的HIV患儿及时诊断和治疗监控存在很大的不足，在医疗资源有限的地区尤其突出。传统的HIV实验室检测方法已无法满足临床的实际需求，亟待发展新的检测技术。近年来随着分子生物学技术发展，涌现出一批分子检测产品。本文对小儿HIV感染的主要实验室检测方法进行回顾与总结。

【关键词】小儿；HIV；感染；实验室；检测；母传抗体

在检测和阻断治疗及时的国家和地区，母婴传播的HIV已显著减少，据估计2019年85%的HIV感染孕妇获得抗病毒治疗，而2010年这个比例约为45%。尽管获得了令人瞩目的成就，但世界卫生组织（WHO）报告2019年约有150,000新发HIV感染儿童病例。

对18月龄以下的婴幼儿HIV感染的明确诊断需要进行病毒学核酸检测，阳性为感染者。18月龄以上的儿童可以行HIV抗体筛查和确诊试验，阳性为感染者。儿童HIV感染者临床表现差异很大，特别是婴幼儿可能是无症状的，或者非特异性症状，很难从临床症状考虑到HIV感染。儿童HIV感染的症状还与成人不同，最常见的症状有：生长迟缓、营养不良、反复发作性口腔溃疡、频繁各类感染，如：呼吸道感染、持续性腹泻、持续性口腔念珠菌感染；症状性淋巴细胞间质性肺炎；进入临床4阶段出现各类严重或罕见感染，如：卡氏肺囊孢子菌肺炎，反复发作的严重细菌感染（如脓胸，化脓性肌炎，骨或关节感染，脑膜炎）；慢性单纯疱疹感染；念珠菌性食管炎（或气管、支气管、肺念珠菌感染）；中枢神经系统弓形虫病（非新生儿期）；巨细胞病毒感染，出现在出生＞1个月视网膜炎或巨细胞病毒感染影响其他器官；肺外隐球菌病（包括脑膜炎）；播散性地方性真菌病（如肺外组织胞浆菌病），慢性隐孢子虫病（伴腹泻），播散性非结核性分枝杆菌感染。

儿童期HIV感染的防治最重要是阻断母婴传播，积极进行母亲的感染治疗，科学喂养，以及出生后及时筛查和药物阻断是关键的措施。青少年应加强健康宣传教育防止HIV感染发生，包括性教育，防止药物滥用，以及避免不安全的医疗、口腔保健、美容等[1]。同时小儿HIV感染的及时诊断和治疗对于患儿预后有非常重要的意义，目前小儿HIV感染诊断和治疗监测的检测方法有细胞学检测、血清学检测、核酸检测和耐药检测等。

一、细胞学检测方法

CD4+T淋巴细胞计数是判断小儿HIV感染的疾病进展、临床用药、疗效和预后的重要指标。CD4+T淋巴细胞亚群常用的检测方法为流式细胞技术，可直接获得CD4+T淋巴细胞数绝对值，或通过白细胞分类计数后换算为CD4+T淋巴细胞绝对数[1]。在治疗前进行1次检测，启动治疗3个月后进行1次检测，治疗后2年以内每3～6个月检测1次（如果基线CD4+T淋巴细胞计数＜200～300/ul，建议每3个月检测1次；如果基线CD4+T淋巴细胞计数＞300/ul，建议每6个月检测1次）。正常的CD4细胞计数在500-1500个/µl之间。CD4计数为200个细胞/µl或更低，可诊断为艾滋病。

二、血清学检测方法

1. 抗体检测方法：一般情况下，HIV 1/2抗体检测（见表1）仍然是小儿HIV感染诊断的金标准[2]。HIV 1/2抗体筛查方法包括酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）、化学发光或免疫荧光试验、快速试验（斑点ELISA和斑点免疫胶体金或胶体硒、免疫层析等）、简单试验（明胶颗粒凝集试验）等。抗体补充试验方法为抗体确证试验（免疫印迹法、条带／线性免疫试验和快速试验）[3]。

酶联免疫吸附试验：ELISA是国际上应用最早、发展最快、应用最广的一种HIV检测方法。快速检测试验操作简便，在较短时间（约10-30分钟）内可以得到实验结果，并且敏感性和特异性较好。从1985年第一代HIV抗体筛查试剂问世以来，已经发展到第四代，在诊断的敏感度和特异度两方面都有了巨大的进步，第四代试剂与前三代试剂相比，增加了对p24抗原的检测，理论上窗口期更短。这类试验可使用血液（包含血清、血浆和干血斑）、尿液样本，既可检测HIV抗体，也可联合检测HIV抗体抗原（同时检测血液中HIV-1 p24抗原和HIV-1/2抗体）。HIV抗原/抗体包被于固相载体，加入待检样本和酶标记的HIV抗原/抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒说明书规定[4]。

免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固定在膜上，待检样本沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。反应时间在30分钟以内。抗体抗原快速检测法是待检样本中的HIV抗体、HIV-1 p24抗原分别与样本垫中的HIV-1/HIV-2抗原、HIV-1 p24单克隆抗体结合形成复合物，在毛细作用下沿着硝酸纤维膜向上移动，至相关抗体、抗原包被区域后，分别与之结合，组成有色复合物线条。质控线用于检测过程质量控制，肉眼判读检测结果[4]。

免疫印迹试验（Western Blot，WB）：WB可使用血清、血浆和干血斑样本，采用间接法检测样本中的抗 HIV-1/HIV-2特异性抗体。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳把分子量大小不等的HIV-1蛋白分离开来，然后再把这些分离的不同蛋白带转移到硝酸纤维素膜上（或PVDF膜）。将此膜切割成条状，每一膜条上均含有经电泳分离过的HIV抗原。待测样本经适当稀释后，加至硝酸纤维素膜上，恒温振荡，使其充分接触反应，血清中若含有HIV抗体，就会与膜条上抗原带相结合。加入抗人-IgG酶结合物和底物后，根据出现条带情况, 按照试剂盒说明书的判定标准，判断待测样本为HIV抗体阳性、阴性或不确定[4]。WB近年来也逐渐地被更特异的酶联方法以及分子生物学方法所取代。

2. 抗原检测方法：HIV主要核心蛋白（p24）出现于HIV-1感染的早期，一般用于HIV-1感染窗口期、HIV-1抗体不确定或HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。全血、血清、血浆、病毒培养上清液以及血液制品原料样本均可用于HIV-1 P24抗原检测。目前检测HIV-1 P24抗原最常用的方法是ELISA法、酶联荧光分析法、电化学发光法等。其中ELISA法最成熟，应用最广泛。原理是用已知抗体包被固相载体，加入待测血清，若待测样本中含有P24抗原，则与包被抗体结合形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记抗体与抗原结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加底物显色，酶标仪读取结果[4]。

3. 抗体和抗原共同检测方法：HIV抗原和抗体共同检测方法是通过重组抗原检测IgG和IgM，同时通过单克隆抗体检测p24抗原。p24抗原检测可以在HIV-1感染血清转化前检测出HIV感染，能在一定程度上缩短HIV感染后检测的窗口期。目前主要的HIV抗原和抗体共同检测试剂盒有Bio-Rad GS HIV combo Ag/Ab酶联免疫吸附测定和Abbott Architect HIV Ag/Ab combo化学发光试验等，这都属于第四代免疫试验，都能检测lgG、lgM抗体和p24抗原，主要用于筛查[5]。

三、核酸检测

HIV-1核酸检测是指检测病毒RNA或前病毒DNA，是一种儿童艾滋病诊断中使用最广泛的检测方法。这是因为病毒核酸可能以非常小的量存在于样本中，核酸检测方法可通过扩增技术增加HIV-1前病毒的DNA或HIV-1 RNA数量或阳性信号的量，从而准确检测到样本中HIV-1核酸。此外，在新生儿及小龄儿童中，母体HIV抗体可以在婴儿体内存在一定时间，这时采用病毒核酸检测则可以避免假阳性。HIV-1核酸检测是目前最敏感的HIV检测方法，可分成HIV-1 DNA和HIV-1 RNA检测。根据其测定方式，可分为核酸序列依赖性扩增试验、分支DNA信号扩大系统、转录介导恒温扩增技术和实时定量PCR等[5]。目前常用的HIV核酸检测试剂盒主要是基于转录介导恒温扩增技术如Aptima HIV-1 RNA定量和定性试剂盒，和基于实时定量PCR技术如Roche Cobas HIV-1 RNA定量和定性试剂盒、Abbott RealTime HIV-1 RNA定量和定性试剂盒 、Cepheid Xpert HIV-1 RNA定量和定性试剂盒等（见表2）。

核酸靶向基因检测：核酸靶向基因检测常用的方法有HIV-1 DNA定性检测、HIV-1 RNA定性检测、HIV RNA定量检测等。

1. HIV-1 DNA定性检测：HIV-1 DNA定性检测采用PCR方法扩增HIV-1基因组的保守区，从而测定外周血单个核细胞中HIV-1前病毒的DNA，目前被广泛用作诊断婴儿HIV感染标准方法，也是通常作为研究中与其他检测方法比对的方法[6]。由于抗逆转录病毒疗法不能治愈HIV感染，且HIV前病毒DNA是整合在细胞基因组中，因此，HIV-1 DNA会一直存在HIV感染儿童的外周血单个核细胞和淋巴组织。HIV-1 DNA定性方法能够检测到HIV-1 DNA，而HIV-1 RNA方法检测不到病毒复制。因此HIV-1 DNA定性检测也是诊断儿童HIV感染最敏感的方法之一 [7, 8]。过去Roche Amplicor Qualitative DNA assay作为婴儿和幼儿HIV感染诊断HIV-1的金标准，在干血斑中灵敏度可达到96.7%，在大于400 copies/ml的样本中灵敏度是98.8%[9]。由于干血斑易于保存和运输，比较适合偏远地区幼儿样本采集和运送后的HIV检测，但该方法正在逐步淘汰[10]。

2. HIV-1 RNA定性检测：HIV-1 RNA定性检测试剂盒可以检测干血斑、血浆、血清和全血中的HIV病毒RNA，主要用于HIV急性感染、早期婴儿感染和确证试验结果不确定者的排查。目前HIV-1 RNA定性检测是诊断≤18月龄儿童HIV-1感染的首选方法[6]。目前市场上商品化试剂盒有Cepheid Xpert HIV-1 Qual Assay、Cepheid Xpert HIV-1 Qual XC Assay 、Roche Cobas HIV-1/HIV-2 Qualitative Assay、Hologic Aptima HIV-1 RNA Qualitative Assay、Abbott Realtime HIV-1 Qualitative Assay等（见表2） 。

Cepheid Xpert HIV-1 Qual Assay是GeneXpert平台上的HIV定性检测产品，检测靶标是LTR，可应用于100ul全血或者干血斑标本，检测时间约90分钟，该产品是采用全自动化全封闭系统实时定量PCR检测技术，其特点是使用简单、检测速度快、安全可靠和结果准确，从2016年就开始在肯尼亚用于婴儿HIV诊断[11]。Xpert HIV-1 Qual XC Assay是下一代HIV定性检测产品，增加了检测靶标Pol，检测标本类型和检测时间没有变化。一项Xpert HIV-1 Qual XC Assay使用干血斑在婴儿早期诊断的研究发现，在265名HIV感染患儿干血斑中，与Roche CAP/CTM HIV-1 Qualitative Assay相比，Xpert HIV-1 Qual XC Assay检测的灵敏度、特异度和准确性都是100%，且该试剂盒具有简单的工作流程，易于使用，测试结果易于解释，分析检测量足以满足临床工作量[12]。在224名婴儿研究中，使用两种分子POCT检测方法—Xpert HIV-1 Qual XC和Xpert HIV-1 Qual 对HIV患儿的干血斑标本进行定性检测，并与标准护理检测方法—Cobas HIV-1/HIV-2 Qualitative Assay比较。研究发现两种分子POCT检测与标准护理检测方法在224名新生儿的HIV感染检测中未发现差异。POCT检测到100%样本结果，而标准护理检测仅获得95%的检测结果，两者具有显著差异。同时Xpert HIV-1 Qual XC检测中循环阈值是3种检测方法中最低的。因此，Xpert HIV-1 Qual XC试剂盒将有可能改善早期婴儿诊断，并有助于识别具有最低HIV总核酸水平和最高HIV治愈潜力的依从联合抗逆转录病毒早期治疗的儿童，从而改善结果[13]。

Roche Cobas HIV-1/HIV-2 Qualitative Assay是在Cobas 6800/8800系统上是第一个用于定性检测和区分HIV-1和HIV-2的获得欧盟认证的聚合酶链反应检测试剂盒。根据研究表明，Cobas HIV-1/HIV-2 Qualitative Assay在血清、血浆和儿童干血斑三种样本中的检测结果与对照血清学检测和Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan检测的一致性≥99.6%，对所有HIV基因型的反应率为100%。其在HIV-1 M组、HIV-1 O组和HIV-2组血浆样品中的检出限分别为14.8、12.6和27.9 copies/ml，血清样品中的结果相似。其在干血斑中检测HIV-1、HIV-2的检出限分别为255 copies/mL、984 copies/mL。其检测HIV感染时间分别比确证实验和血清学检测提前18.9天和8.5天，与核酸扩增检测时间相似。因此，Cobas HIV-1/HIV-2 Qualitative Assay可早期准确诊断成人和儿童不同样本类型的HIV-1和HIV-2感染，有助于避免急性艾滋病毒传播，简化艾滋病毒诊断算法，并提高感染艾滋病毒儿童的存活率[14]。

Hologic Aptima HIV-1 RNA Qualitative Assay是FDA批准的唯一用于诊断急性HIV-1感染的核酸扩增检测，它是利用转录介导的扩增，并用0.5ml血浆检测到的30copies/mL HIV-1 RNA[15]。在一项使用394份来自HIV感染和未感染婴儿和儿童的血浆样本（0.2至0.5ml）研究中发现Aptima HIV-1 RNA Qualitative Assay的灵敏度为99.5%，特异度为99.5%，重复性为100%，检出限为14 copies/ml，说明该方法适用于HIV-1的早期婴儿诊断[16]。

Abbott Realtime HIV-1 Qualitative Assay是一种体外实时PCR检测方法，用于检测人体血浆和干血斑中的HIV-1核酸，可用于儿童和成人患者的HIV-1感染诊断，适用于资源有限的环境中。在肯尼亚200人份干血斑样本的研究中，与CAPCTM Qual检测相比，Abbott Realtime HIV-1 Qualitative Assay的敏感性和特异性分别为99.0%和100.0%，其检出限为56.5 copies/ml，高于CAPCTM Qual检出限。研究表明，Abbott Realtime HIV-1 Qualitative Assay也是及时诊断婴儿艾滋病感染的一种实用选择[17]。同时该试剂盒在检测HIV-1阳性母亲所生的6周龄至18个月龄婴儿的样本（干血斑和血浆）的检测结果与Roche Amplicor HIV-1 DNA Test version 1.5一致，其中干血斑的一致性为95.5%，血浆的一致性为97.8%[18]，这说明该方法也适用于儿童HIV-1感染的诊断。

3. HIV RNA定量检测：HIV RNA定量检测是指检查标本中的HIV病毒载量，主要用于儿童和成人HIV早期感染的诊断、病程评估及抗病毒治疗效果监测。目前市场上商品化试剂盒有Cepheid Xpert HIV-1 Viral Load Assay、Cepheid Xpert HIV-1 Viral Load XC Assay、Roche Cobas HIV-1 quantitative Assay、Abbott Realtime HIV-1 Assay、Hologic Aptima HIV-1 Quant Dx Assay等等。Cepheid Xpert HIV-1 Viral Load Assay是基于GeneXpert系统的一种简单化、全自动化、一次性定量分析HIV定量检测试剂盒，其检测样本为1ml EDTA血浆，时间仅需90分钟，检出限为18.3 copies/ml，线性范围为40-10*7 copies/ml。研究发现Xpert HIV-1 VL和Abbott检测结果之间存在高度相关性，总体平均差异为0.34log 10 copies/ml，且两种方法对HIV-1 RNA的检测一致率为97.1%，灵敏度为99.6%，这说明Xpert HIV-1 VL与HIV-1 RNA传统实验室检测方法显示高度一致性和准确性。由于Xpert HIV-1 VL检测属于分子POCT，在南非资源有限的地区，可用于常规监测HIV患者的病毒载量，评估治疗效果[19]。同时一项meta分析结果显示12项研究结果中Xpert HIV-1 VL与参考方法检测结果的相关系数很高，8项研究的Pearson相关系数为0.94，3项研究的Spearman相关系数为0.96。11项研究的Bland Altman指标均在0.35 log copies/ml范围内。总体而言，与当前的参考方法相比，Xpert HIV-1 VL表现良好。Xpert HIV-1 VL检测的最低培训和基础设施要求使其在资源受限的环境中具有非常好的吸引力[20]，便于偏远地区HIV患儿诊断和病毒载量的监测。

Cepheid Xpert HIV-1 Viral Load XC Assay是下一代HIV定量检测产品，检测LTR和POL两个靶标，检测样本为1ml EDTA血浆，检测时间为91分钟。Xpert HIV-1 Viral Load XC Assay在536例HIV患者的新鲜和冰冻标本中获得98.5%有效结果，在80个Alinity m HIV-1检测方法未检测到病毒载量或病毒载量小于≤1.7log copies/mL的新鲜样本中有高灵敏度。Xpert HIV-1 VL XC定量样本与Abbott检验结果具有高度一致性，且整合酶抗性相关的突变对结果没有影响。在B、CRF06_cpx和CRF02_AG亚型样本中，Xpert HIV-1 VL XC具有良好的线性和重复性。这表明Xpert HIV-1 VL XC与Abbott检测在所有检测的HIV-1亚型中显示出良好的相关性，且在治疗相关病毒载量范围内，灵敏度、线性和准确性较高[21]。与cobas 6800 HIV-1参考方法相比，Xpert HIV-1 Viral Load XC在1000 copies/ml时，其敏感性和特异性分别为97%和98%；在50 copies/ml时，其敏感性和特异性分别为93%和96%，其平均偏差为-0.10log 10 copies/mL[22]。这表明Xpert HIV-1 VL XC检测准确度高，是儿童HIV-1感染患者病毒载量监测的一种安全、可靠和快速的选择。

Roche Cobas HIV-1 quantitative Assay是基于Cobas 6800/8800系统的HIV-1定量检测试剂盒，检测靶标是gag基因和LTR区域，需要至少0.65ml样本，可报告20至10000000 copies/ml定量结果。在1018份临床样本研究中，Cobas HIV-1 quantitative Assay与Aptima HIV-1 Quant Dx试剂盒和Real Time m2000试剂盒具有高度一致的结果，平均差异≤0.2log copies/ml。但在低浓度下，Cobas分析不太精确，大多数样品都没有达到5σ标准。Cobas检测结果在接近临床相关临界值时似乎不太可靠，应更加谨慎地解释[23]。同时CobasHIV-1 quantitative Assay与CAP/CTM HIV-1 quantitative检测结果也有很好的相关性[24]。

Abbott Realtime HIV-1 Assay是基于自动化m2000系统的HIV-1定量检测试剂盒，该试剂盒是以Pol整合酶区域为靶点，可用0.2、0.5、0.6或1.0ml样本，其线性范围为40至10000000 copies/ml。根据研究发现，Real Time HIV-1 Quant Dx Assay与Roche COBAS Amplicor HIV-1 Monitor Test有很强相关性，两者一致性为94.4%，其Abbott的灵敏度比Roche更高，可考虑在资源有限的环境中进行HIV-1病毒载量检测[25]。

Hologic Aptima HIV-1 Quant Dx Assay是基于全自动Panther系统的HIV-1定量检测试剂盒，其靶标是针对Pol和LTR区域，所需的最小样本量为0.7ml样本，可报告的定量结果范围为30至10000000 copies/ml。在一项研究中发现Aptima HIV-1 Quant Dx Assay 95%的检测限为17.6IU/ml，其特异性为99.83%。其与Roche COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan HIV-1 test v2.0在50和100 copies/ml时，两者标准偏差和变异系数分别为0.14 log copies/ml（8.67%CV）和0.18 log copies/mL（9.91%CV），说明Aptima法是一种灵敏、特异、准确的检测HIV-1病毒载量的方法[26]。在134名儿童HIV-1患者研究中，Aptima HIV-1 Quant Dx Assay和Abbott Real Time HIV-1 assay的总体一致性为83%，两种方法的平均差值为0.10 Log copies/mL。所有Aptima测量值在动态范围内均为线性。Aptima和Aptima RNA Qual检测结果一致性为100%，同时减少了70%的实际操作时间，说明Aptima HIV-1 Quant Dx Assay是对儿童患者（包括24个月以下的儿童）进行HIV-1定量检测的最佳选择[27]。

四、耐药性检测

高效抗逆转录病毒治疗的应用有效地控制了艾滋病患者的病情，延长了患者的生命，大大地降低了HIV相关的发病率和死亡率。但是HIV耐药性的出现却极大地限制了抗病毒治疗的效果。选择一个能最大限度地抑制HIV-1复制的方案已成为一个极具挑战性的任务。接受过抗病毒治疗的病人，不但可能对使用的药物产生耐药，而且对其他药物亦会产生潜在的交叉耐药，因此耐药性的产生对救援治疗方案的效力亦具有很大的影响。即使未经抗病毒治疗的患者，耐药病毒的感染也会限制初期联合抗病毒方案的病毒学和免疫学效力。因此，及时检测HIV耐药性对于艾滋病患者的治疗和整个艾滋病疫情的控制是特别重要。目前HIV耐药性检测方法主要有2种：表型耐药检测和基因型耐药检测 [28]。

1. 表型耐药检测：表型耐药检测是通过体外药敏分析方法检测细胞培养中抗逆转录病毒敏感性，其敏感性通常用抑制50% HIV-1复制的抗逆转录病毒浓度（IC50）表达。将患者病毒的IC50与药物敏感参考株的IC50进行比较，通过其倍数变化来评估其耐药程度。目前表型耐药检测主要是用重组病毒方式进行，它通过将PCR扩增的患者病毒基因片段（蛋白酶/逆转录酶、整合酶、包膜等）插入野生型病毒载体中而创建重组病毒方式进行表型耐药检测。重组病毒检测很大程度地简化了检测步骤，提高了检测的可重复性，但并未明显地降低检测的周期[29]。该方法特点是成本和周转时间长，表型耐药检测方法主要用于药物开发、耐药性研究或复杂的临床病例。表型耐药检测能够直接测量每种抑制剂的耐药水平或敏感性，而无需事先了解HIV-1毒株的突变，更容易解释涉及到具有异常突变或复杂突变组合模式的耐药。因此，表型耐药检测可为儿童HIV-1感染患者，尤其是接触抗病毒药物的患者提供药物使用的精确指导[30]。

2. 基因型耐药检测：基因型耐药检测基于分子生物学方法，通过DNA测序检测HIV-1靶基因中的特定耐药性相关突变，在线利用数据库进行结果解释，操作简单，所用时间短，容易执行和低成本，比表型耐药更常用。但当涉及到具有异常突变或复杂突变组合模式的序列时，基因型分析可能很难解释耐药水平。标准的基因型耐药检测的对象主要是蛋白酶和逆转录酶区域，随着更多不同靶向药物如整合酶抑制剂、CCR5 拮抗剂等的应用，检测范围也在不断拓展。目前常用基因型耐药检测方法就是Sanger测序法和下一代测序法[31]。

3. Sanger测序法：Sanger测序法是通过DNA测序检测蛋白酶、逆转录酶和/或整合酶区域来识别已建立的具有临床意义的耐药基因突变，该方法是从血浆RNA逆转录的cDNA直接扩增的PCR产物进行的。由于个体中的病毒群通常是异质的，因此在Sanger序列电泳图的给定位置通常存在一个以上的核苷酸。通过使用软件工具，采用一致的方法识别混合碱基和评估序列质量，可促进耐药研究实验室之间的标准化。事实上，电泳图中的信息提供了内在质量控制数据，包括背景“噪声”水平，如低信号强度和许多不明确的峰。此外，在核苷酸序列中观察到的大量电泳混合物和非典型突变可能是质量控制问题的信号。此外，测序的系统分析和距离测量可用于检测采集点可能的实验室污染或样本标记错误[32, 33]。一般Sanger检测下限约为20%，但点突变分析和下一代测序技术通常都能检测到远低于20%阈值的耐药变体。随着测序技术不断深入各级实验室，许多分子生物实验室具备sanger测序的条件，其价格合理，且可用于自建方法对比公共序列库进行分析，该方法已经作为HIV-1耐药基因检测的主要技术平台和金标准，在临床和科研中均已被采用[34]。

下一代测序

随着测序技术的快速发展，下一代测序（Next Generation Sequence，NGS）检测通量高，已在很多国家广泛应用于HIV-1耐药检测。该方法可精确检测到只发生在1%的HIV-1毒株中的耐药性突变，极大程度提高了检测的灵敏度。几项研究表明，基于NGS的HIV耐药检测在20%检测阈值时与Sanger测序高度一致。因此，利用潜在的改进效率，增加可扩展性、降低成本和提高灵敏度，许多实验室正在转向用NGS检测HIV耐药性。随着NGS技术变得更具成本效益，在实验室方案、数据处理和报告的标准化是很有必要的。尽管NGS有可能潜在地提高低于20%阈值耐药突变的检测能力[35]，但这种敏感性增加的临床相关性尚不清楚。此外，不同阈值的不同低丰度耐药变体相关的失败时间需要评估，避免过早或不必要的抗逆转录病毒药物转换，特别是在低收入和中等收入国家，因为这些国家的治疗方案有限。一项荟萃分析表明，研究设计和方法的高度异质性使低丰度HIV耐药突变体对临床影响的标准化和测量变得复杂[36]。也有研究表明，5%的阈值可以提供与治疗结果具有可重复的临床相关性[37, 38]。

下一代测序检测HIV耐药已有商品化产品，来自新加坡VelaDx公司研发的Sentosa方法已经获得美国FDA批准应用于临床[39, 40]。近年来NGS技术已出现多种平台，其成本也已逐渐降低，但对于低收入国家来说仍难以负担。此外，该技术前期手工操作步骤多，上机收集的数据量大，目前仍缺乏简单便捷的生物信息学分析流程。因此，NGS尚不能在各实验室广泛开展应用于HIV-1耐药检测分析[41, 42]。

小结：目前对于小儿HIV感染诊断和治疗监控的检测方法有CD4+T细胞检测、HIV抗体检测、HIV抗原检测、HIV核酸检测、耐药性检测等，每一种检测方法都有一定的应用价值。灵敏度及特异度高的HIV检测方法有助于小儿HIV感染的早期诊断和治疗监测。同时随着小儿HIV抗病毒治疗的不断深入，及时、准确的耐药性检测变得越来越重要，有助于患儿的治疗监测和预后评估。随着对HIV研究的不断深入及分子生物学技术的飞速发展，HIV实验室检测方法会不断提高灵敏度和特异度，向着快速、简便、准确、敏感及自动化方向发展。

参考文献

Van de Perre P, Goga A, Ngandu N, et al. Eliminating postnatal HIV transmission in high incidence areas: need for complementary biomedical interventions. Lancet. 2021 Apr 3; 397(10281): 1316-1324. doi: 10.1016/S0140-6736(21)00570-5. PMID: 33812490.

Palma P, McManus M, Cotugno N,et al. The HIV-1 antibody response: a footprint of the viral reservoir in children vertically infected with HIV. Lancet HIV. 2020 May; 7(5): e359-e365. doi: 10.1016/S2352-3018(20)30100-4. PMID: 32386722; PMCID: PMC7593885.

中华医学会感染病学分会艾滋病丙型肝炎学组, 中国疾病预防控制中心. 中国艾滋病诊疗指南(2021年版). 中华传染病杂志, 2021, 39(12): 715-735.

中国疾病预防控制中心. 全国艾滋病检测技术规范 (2020年修订版). https://ncaids.chinacdc.cn/zxzx/zxdteff/202005/t20200518_216798.htm, 2020.

Cornett JK, Kirn TJ. Laboratory diagnosis of HIV in adults: a review of current methods. Clin Infect Dis. 2013 Sep;57(5):712-8. doi: 10.1093/cid/cit281. Epub 2013 May 10. PMID: 23667267.

WHO Recommendations on the Diagnosis of HIV Infection in Infants and Children. Geneva: World Health Organization; 2010. PMID: 23741779.

Abdollahi A, Saffar H. The Diagnosis of HIV Infection in Infants and Children. Iran J Pathol. 2016 Spring;11(2): 89-96. PMID: 27499768; PMCID: PMC4939637.

Lambert JS, Harris DR, Stiehm ER, et al. Performance characteristics of HIV-1 culture and HIV-1 DNA and RNA amplification assays for early diagnosis of perinatal HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 2003 Dec 15; 34(5): 512-9. doi: 10.1097/00126334-200312150-00011. PMID: 14657763.

Nelson JA, Hawkins JT, Schanz M,et al. Comparison of the Gen-Probe Aptima HIV-1 and Abbott HIV-1 qualitative assays with the Roche Amplicor HIV-1 DNA assay for early infant diagnosis using dried blood spots. J Clin Virol. 2014 Aug;60(4):418-21. doi: 10.1016/j.jcv.2014.05.012. Epub 2014 Jun 2. PMID: 24929752; PMCID: PMC4077672.

Fiscus SA, McMillion T, Nelson JA,et al. Validation of the Gen-Probe Aptima qualitative HIV-1 RNA assay for diagnosis of human immunodeficiency virus infection in infants. J Clin Microbiol. 2013 Dec;51(12):4137-40. doi: 10.1128/JCM.01525-13. Epub 2013 Oct 2. PMID: 24088864; PMCID: PMC3838099.

Ibrahim M, Moyo S, Mohammed T, et al. Brief Report: High Sensitivity and Specificity of the Cepheid Xpert HIV-1 Qualitative Point-of-Care Test Among Newborns in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 2017 Aug 15; 75(5): e128-e131. doi: 10.1097/QAI.0000000000001384. PMID: 28350554; PMCID: PMC5503760.

Wandera G, Bwana P, Mwau M. Usability of HIV-1 Assay Using DBS for Early Infant Diagnosis in Field Settings in Kenya. J Appl Lab Med. 2022 Sep 1; 7(5): 1120-1130. doi: 10.1093/jalm/jfac026. PMID: 35869941.

Bengu N, Mchunu N, Mokhethi S, et al. Next-generation point-of-care testing in pediatric human immunodeficiency virus infection facilitates diagnosis and monitoring of treatment. Medicine (Baltimore). 2022 Jul 8;101(27): e29228. doi: 10.1097/MD.0000000000029228. PMID: 35801794; PMCID: PMC9259159.

Hans L, Allmen NV, Edelmann A, et al. Early Diagnosis of HIV-1 and HIV-2 Using Cobas HIV-1/HIV-2 Qualitative Test: A Novel Qualitative Nucleic Acid Amplification Test for Plasma, Serum, and Dried Blood Spot Specimens. J Acquir Immune Defic Syndr. 2021 Aug 15; 87(5): 1187-1195. doi: 10.1097/QAI.0000000000002713. PMID: 33883470; PMCID: PMC8263138.

Masciotra S, Luo W, Rossetti R, et al. Could HIV-1 RNA Testing be an Option as the Second Step in the HIV Diagnostic Algorithm? Sex Transm Dis. 2020 May; 47(5S Suppl 1): S26-S31. doi: 10.1097/OLQ.0000000000001137. PMID: 31977972.

Fiscus SA, McMillion T, Nelson JA, et al. Validation of the Gen-Probe Aptima qualitative HIV-1 RNA assay for diagnosis of human immunodeficiency virus infection in infants. J Clin Microbiol. 2013 Dec;51(12):4137-40. doi: 10.1128/JCM.01525-13. Epub 2013 Oct 2. PMID: 24088864; PMCID: PMC3838099.

Chang J, Omuomo K, Anyango E, et al. Field evaluation of Abbott Real Time HIV-1 Qualitative test for early infant diagnosis using dried blood spots samples in comparison to Roche COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan HIV-1 Qual test in Kenya. J Virol Methods. 2014 Aug;204:25-30. doi: 10.1016/j.jviromet.2014.03.010. Epub 2014 Apr 13. PMID: 24726703; PMCID: PMC4720144.

Huang S, Erickson B, Mak WB, et al. A novel realTime HIV-1 Qualitative assay for the detection of HIV-1 nucleic acids in dried blood spots and plasma. J Virol Methods. 2011 Dec;178(1-2):216-24. doi: 10.1016/j.jviromet.2011.09.015. Epub 2011 Sep 24. PMID: 21968095.

Moyo S, Mohammed T, Wirth KE, et al. Point-of-Care Cepheid Xpert HIV-1 Viral Load Test in Rural African Communities Is Feasible and Reliable. J Clin Microbiol. 2016 Dec;54(12):3050-3055. doi: 10.1128/JCM.01594-16. Epub 2016 Oct 12. PMID: 27733636; PMCID: PMC5121399.

Nash M, Huddart S, Badar S, et al. Performance of the Xpert HIV-1 Viral Load Assay: a Systematic Review and meta-analysis. J Clin Microbiol. 2018 Mar 26;56(4):e01673-17. doi: 10.1128/JCM.01673-17. PMID: 29386266; PMCID: PMC5869835.

Ehret R, Harb K, Breuer S, et al. Performance assessment of the new Xpert® HIV-1 viral load XC assay for quantification of HIV-1 viral loads. J Clin Virol. 2022 Apr;149:105127. doi: 10.1016/j.jcv.2022.105127. Epub 2022 Mar 9. PMID: 35305378.

Dorward J, Naidoo J, Moodley P, et al. Diagnostic Accuracy of the Rapid Xpert HIV-1 Viral Load XC, Xpert HIV-1 Viral Load, & m-PIMA HIV-1/2 Viral Load in South African Clinics. J Acquir Immune Defic Syndr. 2022 Oct 1;91(2):189-196. doi: 10.1097/QAI.0000000000003037. Epub 2022 Jun 13. PMID: 36094486; PMCID: PMC7613592.

Wiesmann F, Ehret R, Naeth G, et al. Multicenter evaluation of Two Next-Generation HIV-1 Quantitation Assays, Aptima Quant Dx and Cobas 6800, in Comparison to the RealTime HIV-1 Reference Assay. J Clin Microbiol. 2018 Sep 25;56(10):e00292-18. doi: 10.1128/JCM.00292-18. PMID: 30068537; PMCID: PMC6156314.

Wirden M, Larrouy L, Mahjoub N, et al. Multicenter comparison of the new Cobas 6800 system with Cobas Ampliprep/Cobas TaqMan and Abbott RealTime for the quantification of HIV, HBV and HCV viral load. J Clin Virol. 2017 Nov;96:49-53. doi: 10.1016/j.jcv.2017.09.007. Epub 2017 Sep 20. PMID: 28950186.

[25] Khopkar P, Mallav V, Chidrawar S,et al. Comparative evaluation of the Abbott HIV-1 RealTime™ assay with the Standard Roche COBAS® Amplicor™ HIV-1 Monitor® Test, v1.5 for determining HIV-1 RNA levels in plasma specimens from Pune, India. J Virol Methods. 2013 Jul;191(1):82-7. doi: 10.1016/j.jviromet.2013.03.021. Epub 2013 Apr 12. PMID: 23588214.

Hatzakis A, Papachristou H, Nair SJ, et al. Analytical characteristics and comparative evaluation of Aptima HIV-1 Quant Dx assay with Ampliprep/COBAS TaqMan HIV-1 test v2.0. Virol J. 2016 Oct 21;13(1):176. doi: 10.1186/s12985-016-0627-y. PMID: 27769309; PMCID: PMC5073876.

Uprety P, Curtis D, Cárdenas AM. evaluation of the automated aptima HIV-1 quant Dx assay for both qualitative and quantitative testing in pediatric patients. J Clin Virol. 2020 Jun;127:104352. doi: 10.1016/j.jcv.2020.104352. Epub 2020 Apr 11. PMID: 32305881.

Parikh UM, McCormick K, van Zyl G,et al. Future technologies for monitoring HIV drug resistance and cure. Curr Opin HIV AIDS. 2017 Mar;12(2):182-189. doi: 10.1097/COH.0000000000000344. PMID: 28059958; PMCID: PMC6738332.

Weng Y, Zhang L, Huang J, et al. A simple and cost-saving phenotypic drug susceptibility testing of HIV-1. Sci Rep. 2016 Sep 19; 6: 33559. doi: 10.1038/srep33559. PMID: 27640883; PMCID: PMC5027539.

MacArthur RD. Understanding HIV phenotypic resistance testing: usefulness in managing treatment-experienced patients. AIDS Rev. 2009 Oct-Dec; 11(4): 223-30. PMID: 19940949.

Metzner KJ. Technologies for HIV-1 drug resistance testing: inventory and needs. Curr Opin HIV AIDS. 2022 Jul 1; 17(4): 222-228. doi: 10.1097/COH.0000000000000737. PMID: 35762377.

Clutter DS, Jordan MR, Bertagnolio S, et al. HIV-1 drug resistance and resistance testing. Infect Genet Evol. 2016 Dec; 46: 292-307. doi: 10.1016/j.meegid.2016.08.031. Epub 2016 Aug 29. PMID: 27587334; PMCID: PMC5136505.

Rhee SY, Sankaran K, Varghese V, et al. HIV-1 Protease, Reverse Transcriptase, and Integrase Variation. J Virol. 2016 Jun 10; 90(13): 6058-6070. doi: 10.1128/JVI.00495-16. PMID: 27099321; PMCID: PMC4907232.

Rhee SY, Kassaye SG, Jordan MR, et al. Public availability of HIV-1 drug resistance sequence and treatment data: a systematic review. Lancet Microbe. 2022 May; 3(5): e392-e398. doi: 10.1016/S2666-5247(21)00250-0. Epub 2022 Jan 19. PMID: 35544100; PMCID: PMC9095989.

Chen NY, Kao SW, Liu ZH, et al. Shall I trust the report? Variable performance of Sanger sequencing revealed by deep sequencing on HIV drug resistance mutation detection. Int J Infect Dis. 2020 Apr; 93: 182-191. doi: 10.1016/j.ijid.2020.02.004. Epub 2020 Mar 5. PMID: 32061862.

Mbunkah HA, Bertagnolio S, Hamers RL,et al. WHO HIVResNet Working Group. Low-Abundance Drug-Resistant HIV-1 Variants in Antiretroviral Drug-Naive Individuals: A Systematic Review of Detection Methods, Prevalence, and Clinical Impact. J Infect Dis. 2020 Apr 27; 221(10): 1584-1597. doi: 10.1093/infdis/jiz650. PMID: 31809534; PMCID: PMC7184901.

Huber M, Metzner KJ, Geissberger FD,et al. MinVar: A rapid and versatile tool for HIV-1 drug resistance genotyping by deep sequencing. J Virol Methods. 2017 Feb; 240: 7-13. doi: 10.1016/j.jviromet.2016.11.008. Epub 2016 Nov 17. PMID: 27867045.

Ávila-Ríos S, Parkin N, Swanstrom R,et al. Next-Generation Sequencing for HIV Drug Resistance Testing: Laboratory, Clinical, and Implementation Considerations. Viruses. 2020 Jun 5;12(6):617. doi: 10.3390/v12060617. PMID: 32516949; PMCID: PMC7354449.

Raymond S, Nicot F, Carcenac R,et al. HIV-1 genotypic resistance testing using the Vela automated next-generation sequencing platform. J Antimicrob Chemother. 2018 May 1; 73(5): 1152-1157. doi: 10.1093/jac/dky003. PMID: 29444253.

Raymond S, Nicot F, Abravanel F,et al. Performance evaluation of the Vela Dx Sentosa next-generation sequencing system for HIV-1 DNA genotypic resistance. J Clin Virol. 2020 Jan; 122: 104229. doi: 10.1016/j.jcv.2019.104229. Epub 2019 Nov 26. PMID: 31809945.

Tzou PL, Ariyaratne P, Varghese V, et al. Comparison of an In Vitro Diagnostic Next-Generation Sequencing Assay with Sanger Sequencing for HIV-1 Genotypic Resistance Testing. J Clin Microbiol. 2018 May 25;56(6):e00105-18. doi: 10.1128/JCM.00105-18. PMID: 29618499; PMCID: PMC5971553.

Ghosn J, Taiwo B, Seedat S, et al. HIV. Lancet. 2018 Aug 25; 392(10148): 685-697. doi: 10.1016/S0140-6736(18)31311-4. Epub 2018 Jul 23. PMID: 30049419.

附表1. 主要的HIV感染抗体检测方法[5]

附表2. 主要的HIV核酸靶向基因检测方法