隐球菌荚膜多糖抗原检测试剂FungiXpert在隐球菌感染快速诊断 中的临床应用价值

作者:刘雅 康梅 吴思颖 吴丽娟 何兰 肖玉玲 张为利 廖全凤 邓劲 陈志兴 马莹
作者单位:四川大学华西医院检验科(刘雅 康梅 吴思颖 肖玉玲 张为利 廖全凤 邓劲 陈志兴 马莹); 广西壮族自治区贵港市人民医院检验科(吴丽娟);成都市第六人民医院检验科(何兰) 2022-11-10

康梅,主任技师,医学博士,硕士研究生导师。现任四川大学华西医院实验医学科临床微生物室主任技师。兼任国家卫健委全国真菌病监测网质量管理中心委员、中国医师协会病原微生物检验质量管理专委会委员、中国医院协会临床微生物实验室管理专业委员会委员、欧洲临床微生物和感染病学会药敏委员会CHiCAST分委会委员、中国医药保健促进会临床微生物与感染病分会委员、四川省医学会细菌感染与耐药防治专委会常务委员、四川预防医学会医院感染分会委员。近五年以第一作者或通讯作者发表SCI及中文核心期刊论文50余篇;负责和主研多项国家自然科学基金及四川省科技厅项目等,获四川省科技进步一等奖等多个奖项。


刘雅,主管技师,临床检验诊断学硕士。四川大学华西医院实验医学科临床微生物室主管技师。主要研究方向:感染性疾病的实验室诊断。作为主研参与国家自然科学基金-青年基金一项,四川省科技厅计划项目一项。近年来以第一作者发表论文5篇,其中SCI论文2篇,参编著作1部。


【摘要】隐球菌是一种机会性病原真菌,也是真菌性脑膜炎的主要病因。隐球菌抗原(CrAg)侧向免疫层析法(LFA,胶体金法)是一种免疫层析试验体系,该方法已成为一种床旁检测(POCT)手段。在此项研究中,我们通过检测血清和脑脊液(CSF)样本诊断隐球菌病、分析与病原真菌和细菌的交叉反应来评估隐球菌荚膜多糖检测FungiXpert(天津喜诺生物医药有限公司)的诊断性能,同时与美国食品和药物管理局(US-FDA)批准的IMMY CrAg LFA进行比较。本研究回顾性收集了来自158例患者的80份CSF和119份血清/血浆样本,以进行CrAg的定性或半定量试验。利用28株真菌和1株细菌进行交叉反应试验。在定性试验中,与IMMY CrAg LFA相比,FungiXpert LFA敏感性99.1%、特异性98.9%;在96例样本的CrAg半定量试验中,39例(40.6%)样本使用FungiXpert LFA检测的阳性滴度比IMMY CrAg LF高1-2个稀释倍数,二者半定量试验的组内相关系数(ICC)为0.976;阿萨西毛孢子菌(Trichosporon asahii)对FungiXpert LFA和IMMY CrAg LFA均出现交叉反应。与IMMY CrAg LFA相比,FungiXpert LFA表现出同样优异的诊断性能,但对患者诊断时,仍要注意这两种试剂对阿萨西毛孢子菌(T. asahii)潜在的交叉反应。FungiXpert LFA是一种快速、有效地筛查隐球菌病的方法,可用于隐球菌病的诊断及治疗过程。


【关键词】隐球菌;隐球菌荚膜多糖抗原;侧流免疫层析法;交叉反应性;一致性


隐球菌是一种机会性致病真菌,是引起接受免疫抑制治疗的HIV/AIDS患者真菌性脑膜炎的主要原因[1-4],格特隐球菌(Cryptococcus gatti)某些复合体也会引起健康人群的感染。此外,隐球菌也可引起患者肺部感染。快速和准确的实验室检测以识别隐球菌感染十分必要。侧向层析法(LFA,胶体金)利用免疫层析技术对血清、血浆、全血和脑脊液(CSF)中的隐球菌荚膜多糖抗原进行定性或半定量试验,隐球菌抗原(CrAg)LFA检测具有高敏感度和特异性,检测成本低,已被广泛应用于床旁检测(POCT)手段[5, 6]。此外,CrAg滴度与死亡率密切相关,可预测患者死亡风险[7-9]。另一方面,CrAg低滴度对于HIV阴性患者隐球菌病的早期诊断至关重要,当低血清滴度呈阳性时,建议常规进行腰椎穿刺取CSF检测[10]。因此,快速的半定量LFA试验结果可影响临床诊断、指导医生做出治疗决策[9]。


隐球菌荚膜多糖检测K-set LFA试剂(FungiXpert,天津喜诺生物医药有限公司)是一种在中国生产的商业检测产品。本研究的目的是评估FungiXpert LFA在检测血清和CSF样本中的诊断性能,并与美国食品和药物管理局(US-FDA)批准的IMMYCrAg LFA(Immuno-Mycologics, Norman, OK, USA)进行比较,分析与其他病原真菌和细菌的交叉反应。根据制造商的说明,已经进行了一些交叉反应性实验,例如,巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)的高浓度(>0.1mg/ml)抗原与IMMYCrAg LFA试剂表现出一定的交叉反应。毛孢子菌属(Trichosporon spp.)、裂褶菌(Schizophyllum commune)、灰盖鬼伞菌(Coprinopsis cinerea)、链格孢菌(Alternaria alternata)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、红酵母菌属(Rhodotorula spp.)或二氧化碳噬细胞菌(Capnocytophaga canimorsus)感染可能导致低滴度假阳性结果。据报道,类风湿因子、羟乙基淀粉、肥皂、消毒剂、受污染的样本采集瓶、样品杂蛋白处理不充分均会导致交叉反应[11-17];然而FungiXpert LFA的交叉反应性尚未得到充分的证实。在本研究中,我们对真菌、细菌病原体与隐球菌抗原检测的交叉反应进行分析[11]。评估FungiXpert LFA作为POCT手段诊断隐球菌病的性能。


材料与方法


1. 样本收集和临床信息:回顾性收集了199例样本(80例CSF和119例血清/血浆),样本均来自四川大学华西医院于2018.10.26至2020.11.27收治的158名接受隐球菌抗原筛查的患者,以上样本被用于评价FungiXpert LFA试剂的诊断价值。所有样本储存条件为-20℃的冰箱中,并统计158名患者的性别和年龄。同时,回顾性分析CrAg阳性患者的实验室检查数据及临床诊断。


2. 真菌和细菌菌株及样本制备:培养19个种的28株真菌及1株细菌菌株,用于评价两种试剂的交叉反应。以上菌株包括临床分离菌株、ATCC标准菌株、美国病理学家协会能力验证(CAP-PT)菌株:临床分离菌株包括新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginos)、白地霉(Geotrichum candidum)、皮炎外瓶霉(Exophiala dermatitidis)、阿萨西毛孢子菌(Trichosporon asahii)、黑酵母(Aureobasidium pullulans)、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)复合体、顶孢霉菌(Acremonium)、互隔交链孢霉(Alternaria alternat)、断发癣菌(Trichophyton tonsurans)、须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes)复合体、总状毛霉(Mucor racemosus),尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、生痰二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga sputigena);ATCC标准菌株包括白念珠菌(Candida albicans)ATCC90028、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)ATCC22019、克柔念珠菌(Candida krusei)ATCC6258;CAP-PT菌株包括热带念珠菌(Candida tropicalis)CAP2013 F-1、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)2015CAP F-04。临床分离菌株经MALDI-TOF MS(Bruker Dalton-ics,Inc.,Billerica,MA,USA)鉴定,通过Biotyper DB5989和丝状真菌数据库2.0进行检索,比对内部转录间隔区ITS1和ITS4序列;子囊菌和担子菌使用SDA培养基、35℃环境下培养;其他真菌使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基于28℃环境培养;细菌使用血平板培养基、35℃培养。培养出菌落后,菌株传代一次,再培养24h后进行检测。所有菌株均溶于0.9%的无菌生理盐水制成0.5McF标准真菌/细菌悬浮液制备,可得到每毫升1×105~5×106个细胞的酵母原液悬浮液。


3. 检测试剂:对隐球菌荚膜多糖检测试剂盒K-set LFA(FungiXpert,天津喜诺生物医药有限公司)和IMMY CrAg LFA(ImmunoMycologics,Norman,OK,USA)进行评价,试验操作根据说明书进行。

4. 定性试验:IMMY CrAg LFA试验步骤如下:将40μL样本稀释液添加至微量离心管中,再加入40μL样本混合均匀,将CrAg检测条的白色端浸入样品中,在10min后记录结果。FungiXpert LFA试验步骤相似:将50μL样本处理液添加至微量离心管中,再加入50μL样本混合均匀,吸取50μL样本混合液滴加至检测卡的加样孔中,等待10min记录结果。


5. 半定量滴度检测:IMMYCrAg LFA的操作步骤如下:将10个微离心管放在管架上,并将其标号为1-10(1:5到1:2560),初始稀释液滴度为1:5;在#1管中加入160μL样本稀释液,在#2-10管中分别加入80μL滴定稀释液;将40μL样本加入#1管中,混合均匀;从#1中取80μL的试样转移至#2号管,混合均匀,重复上述稀释步骤直至#10管;丢弃#10号80μL和#1号管40μL,使每管最终体积为80μL;将CrAg测试条的白色端浸入#1-10管中进行检测,在10min后记录结果。FungiXpert LFA试剂的操作步骤类似:稀释操作同IMMYCrAg LFA相同;将每管50μL混合样品分别滴加到检测卡的样品孔中进行试验,10 min后记录结果。


6. 交叉反应试验:0.5McF标准真菌/细菌悬浮液样本可直接用于试验,无需稀释,操作步骤与定性及半定量试验一致。为准确计算滴度,用0.9%无菌生理盐水按10倍比例稀释,依次由1:10至1:10000;取10μL真菌/细菌悬液稀释液接种于SDA/血液琼脂平板(BAP)上进行菌落计数。


7. 数据分析:比较了两种检测试剂定性结果的一致性,以IMMYCrAg LFA为参考标准,计算隐球菌荚膜多糖检测FungiXpert LFA的敏感性和特异性,与参考方法不一致的结果被定义为假阳性或假阴性。同时,通过回顾患者的病例,对定性结果不一致的样本进行分析。


数据分析使用社会科学统计22.0软件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA),评估比例、总体百分比一致性和kappa系数的置信区间(CI)。将两种试剂盒的半定量结果转换为对数关系后进行组内相关系数(ICC)分析。


结 果


1. FungiXpert LFA定性试验性能优异:在199例IMMYCrAg LFA试验样本中,113例CrAg阳性(49例CSF和64例血清/血浆)。158名参与者的临床信息显示,其中55名女性(34.8%)和103名男性(65.2%),平均年龄为49±15岁。在76例CrAg阳性患者中,69例(90.8%)患者被诊断为隐球菌感染;其中53例(69.7%)患者被确诊为隐球菌性脑膜炎,33名患者的脑脊液中分离出新型隐球菌/格特隐球菌复合体,另外20名患者通过墨汁染色、隐球菌抗原和临床症状被临床诊断为隐球菌性脑膜炎。此外,14例(18.4%)患者被诊断为肺隐球菌病,1例(1.3%)患者被诊断为播散性隐球菌感染,1例(1.3%)患者被诊断为隐球菌骨内感染,1名(1.3%)患者被诊断为可能的隐球菌感染,6名(7.9%)患者诊断为非隐球菌感染和未确定的隐球菌感染(图1)。与IMMY CrAg LFA相比,在定性试验中,FungiXpert LFA显示出敏感性为99.1%(95%CI,0.94,0.99)和特异性为98.9%(95%CI,0.93,0.1999),一致性为98.9%(kappa=0.98)(表1)。113例IMMY CrAg LFA阳性样品(滴度为1:2)中,1例样本FungiXpert LFA检测显示阴性结果,根据临床记录,该样本于2020年11月9日送检,为脑脊液,且患者经治疗后阳性滴度降低,此样本检测为假阴性结果。在86例IMMY CrAg LFA阴性样品中,有1例FungiXpert LFA试检测呈阳性(滴度为1:2),根据临床记录,患者通过病理活检被临床诊断为右乳腺浸润癌,此样本为假阳性(表1)。


图1. 本研究中应用于CrAg LFA检测的血清和/或脑脊液样本临床概述


表1. FungiXpert LFA(K-set)和IMMY CrAg LFA的试验结果(n=199)

试验及结果

IMMY CrAg LFA

阳性

阴性

敏感性(%)

(95% CI)

特异性(%)

(95% CI)

一致性

(%)

Kappa

K-set

阳性

112

1

99.1 (0.94,0.99)

98.8 (0.93,0.99)

98.9

0.98

LFA

阴性

1

85





注:LFA,侧向层析;CrAg LFA:隐球菌抗原侧向层析;CI:置信区间


2. 半定量实验显示,FungiXpert LFA和IMMY CrAg LFA结果一致:对96例阳性标本(46例CSF和50例血清/血浆)进行CrAg滴度检测,最小滴度为1:2,最大滴度>1:2560,根据说明书,未进一步稀释>1:2560的稀释液。在CrAg半定量结果中,39例(40.6%)FungiXpert LFA测试滴度高于IMMY CrAg LFA;其中,29例(30.2%)FungiXpert LFA结果比IMMY CrAg LFA结果高一个滴度,11例(10%)比IMMY Grag LFA高两个滴度。通过两种试剂CrAg半定量结果的ICC为0.976(<0.4,弱相关性,>0.75,强相关性)(表2)。


表2. 两种试剂CrAg滴度半定量结果的组内相关系数


组内相关系数b

95%置信区间

F test with true value 0

下限

上限

数值

df1

df2

Sig

单独测量

0.976a

0.964

0.984

80.729

95

95

0.000

平均测量

0.988c

0.981

0.922

80.729

95

95

0.000

注:a无论是否存在交互作用,计算方式相同;bC类内相关系数使用一致性定义,从分母方差中排除度量间方差;c假设不存在交互作用,则计算此估计,因为否则无法估计


3. 交叉反应试验结果显示,阿萨西毛孢子菌与两种试剂均显示存在交叉反应:阿萨西毛孢子菌(Trichosporon asahii)与两种试剂均显示存在交叉反应(表3)。FungiXpert LFA和IMMY CrAg LFA试验滴度分别为1:320(3.1×102 CFU/ml)和1:160(6.3×102 CFU/ml)时均可观察到与阿萨西毛孢子菌(Trichosporon asahii)的交叉反应(图2)。此外,单一物种内的菌株变异不会影响本研究的结果,本研究中的其他真菌和细菌菌株未显示交叉反应(表3)。


图2. 两种与阿萨西毛孢子菌的交叉反应试验(A. FungiXpert LFA. B. IMMY CrAg LFA)


表3. 真菌和细菌菌株的CrAg LFA结果


讨 论


过去的研究中胶乳凝集(LA)试验一直被认为是金标准方法[18, 19]。在血清和脑脊液样本的研究中,IMMY隐球菌荚膜多糖抗原胶体金免疫层析法(LFA)的敏感性优于LA试验和酶免疫分析法(EIA);与EIA和LA相比,LFA的优点还包括成本较低和易于使用[20-22]。在本研究中,我们评估了半定量FungiXpert LFA与IMMY CrAg LFA的性能。FungiXpert LFA具有与IMMY CrAg LFA相同的优势,快速、使用简单且无需设备;检测时需要的样品体积很小,可以在室温下储存。FungiXpert LFA也相对便宜。但是,如果试剂包装不是大型塑料盒的话,FungiXpert LFA会更加环保。与IMMY CrAg LFA相比,FungiXpert LFA表现出优异的性能,在定性测试中具有99.1%的敏感度和98.9%的特异性。值得注意的是,所有假阳性和假阴性都是在低滴度样品1:2发现的,可能是因为低抗原浓度导致的。因此,在临界值附近的样本会有预期误差。我们回顾了两个患者在两种检测试剂中具有不同定性结果的病例。其中一个病例IMMY CrAg LFA阳性样本在FungiXpert LFA试剂测试中呈阴性。该样本于2020年11月9日进行检测,是经治疗后滴度降低的脑脊液样本。该患者于2019年6月因头痛、头晕在我院神经内科接受治疗。印度墨汁染色阳性,培养脑脊液,通过MALDI-TOF MS显示隐球菌属复合体。血液和脑脊液中CrAg检测结果均为1:2560。患者被诊断为隐球菌性脑膜炎,随后转入感染科治疗。给予两性霉素B、伏立康唑和氟胞嘧啶,并提供对症治疗以降低颅内压。随后,患者症状缓解后出院。患者于4月20日、6月20日、8月20日和11月20日入院随访。治疗后,墨汁染色和脑脊液培养均为阴性,血液和脑脊液中的CrAg低度逐渐减低(脑脊液滴度下降速度比血液快)。根据病历,我们推测这种不一致与两种检测方法对隐球菌抗原的检测敏感性有关。因为抗原清除的动力学很慢[3, 23, 24],我们推测IMMY CrAg LFA在检测较低浓度的抗原时表现出更高的灵敏度。


另一个不一致的结果是IMMY CrAg LFA阴性样品在FungiXpert LFA上呈阳性,滴度为1:2。该患者因咳嗽和咳痰入院1个月。所有与感染相关的测试均为阴性。痰细胞学检查怀疑患者为右肺腺癌。随后,患者经病理活检临床诊断为右乳浸润性癌。我们推测假阳性结果是由患者肿瘤中的非特异性抗体引起的。根据Dubbels[25]等人的研究报道,所有阳性结果中有34%(13/38例)被认为是假阳性,半定量滴度在1:2和1:5之间。该研究还提到,假阳性病例最终被诊断为肿瘤相关疾病,例如弥漫性大B细胞淋巴瘤和神经胶质瘤。因此,我们建议在首次对K-set试剂滴度为1:2阳性的患者进行隐球菌感染诊断之前对其临床表现进行综合判定。


隐球菌荚膜的主要成分是葡糖醛木甘露聚糖 (GXM),它是一种多糖抗原靶点,可用于诊断隐球菌病的免疫测定[26]。我们研究中的两种检测方法利用了侧流免疫层析法,其包被的抗体对GXM抗原高度敏感。但由于生产工艺不同,反应结果色带的清晰度也不同。我们观察到FungiXpert LFA和IMMY CrAg LFA在终点滴度上的差异。两种检测方法半定量CrAg滴度测试的ICC为0.976,表明两种试剂盒的半定量结果非常吻合。同时,在96名阳性患者中,有39名FungiXpert LFA的滴度高于IMMY CrAg LFA的滴度。考虑到终点滴度与不同的检测方法有关,临床医生和实验室应注意,应使用相同的半定量CrAg检测方法对诊断时中枢神经系统疾病的概率进行风险分层或监测患者治疗的有效性。


随着分子技术的引入,新型隐球菌和格特隐球菌复合体的分类学得到了修订。新型隐球菌和哥特隐球菌复合物中的物种包括:C. neoformans s.s.、C. deneoformans、C. gattii s.s.、C. bacillisporus、C. deuterogattii、C. tetragattii和C. decagattii[27]。目前,已经开发了一些快速半定量LFA检测方法[6, 28],至少有4种CE认证的用于体外诊断(CE-IVD)的CrAg LFA试剂,但并非所有都能检测到新型隐球菌和格特隐球菌复合体的7个成员[29]。使用Dynamiker LFA无法检测到C. bacillisporus和两个C. tetragattii菌株。Biosynex LFA无法检测到一种C. bacillisporus和一种C. deuterogattii菌株,并且没有检测到六种C. tetragattii菌株。然而,所有7种致病性隐球菌都被 IMMY和FungiXpert LFA检测到[29]。


在这项研究中,我们采用0.5 McFarland的真菌/细菌悬浮液测定了FungiXpert LFA和IMMY CrAg LFA的交叉反应性。阿萨西毛孢子菌(Trichosporon asahii)在两种检测方法中均表现出交叉反应,滴度为1:320(3.1×102 CFU/ml,FungiXpert LFA)和1:160(6.3×10CFU/ml,IMMY CrAg LFA)。毛孢菌属的细胞壁会表达GXM,类似于隐球菌属物种[30]。虽然由阿萨西毛孢子菌引起的感染病例相对较少,但临床医生应在CrAg检测呈阳性并治疗隐球菌病无效时考虑阿萨西毛孢子菌感染的可能性。生痰二氧化碳嗜纤维菌和链格孢菌的检测在其他研究中产生假阳性结果[11],在本研究中为阴性。本研究中其他病原体交叉反应的结果也为阴性,说明这两种检测方法具有很好的特异性。


我们的研究也存在一些局限性。首先,用于比较的样品数量很少,尤其是滴度低于1:10的样品。其次,这是一项使用保存菌株的病理悬浮液而非临床标本的基础研究。因此,进一步研究使用来自阿萨西毛孢子菌感染患者的血液或脑脊液等临床样本是有必要的。由于在常规临床工作中不进行分子分型方法,我们不确定用于比较的样本是哪种隐球菌感染。在我们的研究中,只有新型隐球菌用于交叉反应实验。


作为获得CE认证的国产试剂,FungiXpert LFA比进口产品便宜;因此,它是许多国内实验室的理想选择。总之,它与IMMY CrAg LFA相比,在血清和脑脊液的检测中,FungiXpert LFA具有更高的敏感性和特异性。FungiXpert LFA的部分终点滴度高于IMMY CrAg LFA。然而,应使用相同的半定量CrAg测定来监测患者治疗的有效性。临床医生和实验室应该意识到,在诊断患者时,化验可能与阿萨西毛孢子菌发生交叉反应。FungiXpert LFA(天津喜诺生物医药有限公司)是一种快速筛查方法,可以为诊断隐球菌病和监测患者治疗效果提供有效实用的方法。


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