感染性疾病分子诊断技术40年的变化

作者:编译:骈亚亚 刘一锋 赵惠 丨主审:汤一苇 胡继红 2022-11-10
作者单位:北京医院 国家卫生健康委临床检验中心(骈亚亚 胡继红);首都医科大学附属北京友谊医院(刘一锋);

汤一苇,复旦大学上海医学院医学学士、流行病学硕士、美国范德堡大学微生物学和免疫学博士、美国微生物学院院士、美国传染病协会会士、美国微生物学会新冠病毒资料馆馆员。《Journal of Clinical Microbiology》共同主编、《Journal of Molecular Diagnostics》和《Emerging Microbes and Infection》副主编。现任丹纳赫诊断平台/赛沛中国首席医学官、海外华人微生物学会主席、美国临床和实验室标准研究所分子诊断专家组委员。曾是美国疾病控制中心访问学者、梅约医学中心住院医师、范德堡大学医学院教授、美国纪念斯隆凯特琳肿瘤医院主任医师和临床微生物科主任、康奈尔大学医学院教授、美国食品和药品管理局医疗器械咨询委员会委员。发表相关科研论文、综述和专著逾300篇。


聚合酶链式反应(PCR)自诞生之日起已近40年,它通过体外酶扩增技术检测核酸,灵敏度高、特异性好。特别是自2019年冠状病毒病(新型冠状病毒肺炎)爆发后的两年多时间里,感染性疾病分子诊断发挥了比以往任何时候都更大的全球化作用。鉴于此,作者广泛回顾了分子技术在临床微生物学中的进展,并指出其在当前的重要性。值得注意的是,这些方法不仅可以用于微生物核酸的检测和定量,还可以进行序列表征分析。总之,我们试图对这些技术本身进行一个全面的综合分析,同时分析它们如何在技术创新、病理生理学知识、临床/实验室管理、甚至金融/监管因素的交叉点上形成医疗保健。


一、微生物和DNA的诊断能力


自19世纪末以来,临床微生物学随着人们对感染性疾病基本知识的认识而随之发展[1]。这些科学理论的认识可以追溯到巴斯德、科赫和李斯特的研究工作,正是他们开创性地引入了细菌学理论的定义,即特定微生物会引起特定感染性疾病[2]。我们现在比以往任何时候都清楚,微生物与人类之间关系的复杂性尚未完全阐明。然而,细菌学理论作为现代医学的基本准则,其在临床微生物实验室的重要作用仍未改变:对引起疾病的细菌、真菌、病毒和寄生虫进行鉴定。


100多年来,显微镜观察、微生物培养和免疫学诊断一直是鉴定病原菌感染的主要方法。这些技术到现在仍不过时,依旧是鉴定许多病原菌的金标准。近几十年发生的巨大变化是分子生物学新方法间的相互印证。1944年,艾弗里、麦克劳德和麦卡蒂证明从III型肺炎链球菌中提取的DNA可以将毒力传递给非致病性的II型肺炎链球菌[3]。而沃森和克里克在1953年对这个现象进行了著名的阐述(当然他们的工作是建立在许多人基础之上):即DNA编码遗传物质的能力源于其碱基结构和功能[4]。这种信息存储机制提供了诊断的基本依据,例如可区分人或微生物的DNA(或RNA),根据基因型预测微生物表型,对生物进行分类[5]。当然,不同的分析需要相应的分子诊断技术以针对性的检测DNA。


因此,在过去的40年间,随着超敏感技术的发展,DNA/RNA作为诊断工具已经发生了翻天覆地的变化,分子诊断技术已经从单纯的概念演变为临床微生物学实践中不可或缺的工具[6]。基因(现在是基因组/多组学)名词的出现开创了一种新常态,它重新定义了实验室可能提供的信息量和速度。因此,鉴于目前核酸检测、定量和测序已成为感染性疾病管理的重要方法,本文提供了一个机会来综合分析分子诊断技术的重要性。我们试图对这些技术本身以及它们对实验室管理和患者护理的重要影响进行综合分析。在分析技术和宿主-病原生物学发展的推动下,这些主题与临床管理甚至金融/监管因素密切相关,反映了分子诊断在全科实践和专科护理中的普遍应用。


二、早期非扩增探针技术


非核酸扩增探针检测是美国食品和药物管理局(FDA)批准的首批用于感染性疾病分子体外诊断(IVD)技术之一[7]。这些技术通常需要在分析之前进行“生物扩增”,即微生物在体外进行生长,但不会产生作为潜在交叉污染物的扩增产物(扩增子)。这些分子探针构成长度为15到30个碱基的单链寡核苷酸,并与互补链进行配对杂交。一般以DNA作为模板,但有时也以RNA或DNA合成类似物(如肽核酸)作为模板[8]。探针通常只识别目标物中(通常是rRNA片段)大量且唯一保守序列。这些探针可以直接或间接与显色酶、荧光基团或放射性同位素结合,也可以直接作用于标本或固定/切片组织,包括原位杂交,病理学家可以通过原位杂交在组织学/细胞学上观察病原微生物[9]。


在临床微生物实验室中,非扩增探针方法被用来替代传统的微生物分离培养或生化鉴定。它们可以在微生物培养后第一时间进行快速鉴定,常见例子包括缓慢生长的真菌和分枝杆菌[10],以及细菌/真菌血培养[11]。用于检测阳性血培养瓶的荧光原位杂交(FISH)技术在21世纪初已开始普及,即利用单个探针直接检测引起菌血症的常见病原菌。最近,用于血培养的非扩增探针技术已经发展为可同时识别多个靶点的多重芯片技术[12]。分子探针并不仅限于分类鉴定,也用于抗生素耐药检测,前提是某一特定基因/等位基因的存在(或缺失)能严格预测耐药表型,其中常见的例子包括葡萄球菌mecA、肠球菌vanA/vanB以及革兰阴性杆菌的各种超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶[13, 14]。这些多重探针技术通常会利用其他表面和悬浮阵列及显式核酸扩增方法,因此处于不断发展中(下文会进一步讨论)。


历史上,核酸探针也促进了信号放大技术的发展,包括杂交捕获和支链DNA技术。探针和目标序列的识别通过连续几轮核酸和/或抗体杂交得以增强,可最大限度提高检测值[15]。信号放大在感染性疾病中的最广泛应用或许是在巴氏涂片中检测人类乳头瘤病毒[16]。而目前,信号放大技术在很大程度上已经让位于核酸靶向放大技术。尽管如此,信号放大技术的优势还是比较明显的,包括其易用性和能够在不产生扩增子的情况下灵敏地检测核酸序列。


三、核酸扩增技术的出现


许多人认为:分子生物学领域的一个重要转折点是20世纪80年代初Mullis在Cetus公司开发了PCR技术,分子诊断学也随之诞生[17, 18]。PCR是利用纯化的DNA聚合酶和单链DNA(ssDNA)模板及5’-寡核苷酸引物在体外合成双链DNA(dsDNA)。引物同时作用于正义链和反义链,可以选择性地从极其复杂的核酸混合物中扩增目标序列(即两个引物侧翼的区域)。PCR实现了指数级的扩增灵敏度,它以个位数拷贝为模板,理论上每个温度循环可以进行两倍扩增。它同样具有显著特异性,我们可以调整引物序列去扩增几乎任何病原菌。最初使用的聚合酶(大肠杆菌DNA聚合酶I,Klenow片段)由于其热不稳定性,因此PCR第一次应用在技术上很复杂。它需要在每个变性步骤后向反应中添加更多Klenow片段。然而,Cetus从黄石公园温泉中分离到一株水生栖热菌,并从中提取了热稳定聚合酶,从而实现了单一反应混合物在所有循环中均可使用[19]。而另一项关键进展是逆转录酶对PCR标本的初步应用(RT-PCR),它可以将任何形式的RNA逆转录为cDNA,并允许PCR扩增RNA病毒基因组或任何序列的微生物mRNA/rRNA[20]。


整个20世纪八九十年代各种技术的进步也同样推动了PCR在临床的广泛应用[21]。PCR实验室设备的发展尤其是热循环仪的研发对PCR的发展至关重要。该仪器提供了一个热控制“热块”,以便在每个反应步骤实现所需的温度[22]。许多现代仪器均采用珀耳帖效应,它允许通过反向电流加热和冷却模块[23]。薄壁反应容器提供快速的导热率和平衡,而加热的盖子防止容器顶部冷凝(旧的热循环器用一层油或蜡)。第二代(或“快速循环”)PCR仪融入了其他功能,以确保温度能够加速上升[24]。这些功能包括更小的反应体积(低至亚微升),采用微流控界面的强制空气加热/冷却,以及简化的循环(例如退火和延伸的简化步骤)[25]。这些创新使得进行40个循环以上所用时间不超过半小时。


总的来说,诊断PCR可归纳为三个步骤:(1)样本处理和核酸提取;(2)目标扩增;(3)扩增产物检测或鉴定(图1)。在回顾检测技术之前,我们希望认识到样本提取的重要性。事实上,如果不能从病原菌中有效提取DNA/RNA(在临床标本中出现),就无法显示PCR的固有敏感性。Boom等人融合了标本变性裂解和二氧化硅颗粒的核酸结合能力,发明了一种适合核酸提取、纯化和浓缩的新方法[26]。制造商基于这一原理和相似原理,利用磁珠纯化和/或过滤方法开发了许多系统,使其适合于不同的微生物[27]。 现在可以在不同级别的自动化水平和工作负载上使用仪器,允许实验室根据他们的需要选择最合适的方法。


四、“可视化”和定量扩增产物


虽然PCR可以指数扩增低丰度的DNA/RNA,但它的诊断效用却依赖于成对方法来检测最终产物(上述步骤3)。扩增产物检测必须简单、直接、可重复,以便临床实验室能有效使用。PCR产物的早期诊断方法是琼脂糖凝胶电泳,通过DNA结合荧光燃料(如溴化乙锭)染色并在紫外灯下观察。这种方法是观察扩增产物大小是否和预期大小一致[28]。虽然琼脂糖凝胶电泳在科研上应用广泛,但出于对该方法的实际需求,因此也可以作为分子诊断的次优选择[29]。进一步说,作为非扩增技术的演变,PCR结合分子探针从而实现共同扩增/检测。虽然这些组合方法在具体细节上大不相同,但它们都是通过一个或多个标记的寡核苷酸进行连接,这些寡核苷酸结合扩增子进行读数。许多平台利用固相和液相两种形式基质进行杂交[12];信号产生的方法有:抗体偶联和显色[30],质谱鉴定扩增产物[31],以及电子微循环的调节[32]。测序也被用于检测扩增产物,这部分内容将在下文进行讨论。


在临床微生物学中最常用的PCR检测方法或许是荧光探针法。PCR早期里程碑就是通过荧光来主动监测扩增产物。Higuchi等人开发了一种将溴化乙锭溶在反应混合物中作为荧光剂的方法[33]。将热循环反应通过光纤连接到荧光光谱仪,500纳米激发光照射激发器,并监测由此产生的610纳米发射光的增强(来自扩增子产生和燃料嵌入)[33]。进一步研究发现,荧光基团偶联的寡核苷酸可以提供更高的检测特异性。这些技术通常会用到荧光共振能量转移(FRET)原理[34]。在这里,两个荧光基团只有在空间上相互接近时才活跃,或者一个荧光团在淬灭剂存在时不活跃[35]。对于PCR检测来说,这些现象是通过将这些片段结合到单个探针的不同区域或多个针对相邻扩增子区域的探针来实现的。杂交修饰了部分的空间关系,使得发射仅在靶扩增时发生。杂交改变了分子的空间关系,使得只有在靶基因发生扩增的时候才会发射荧光。


图1. 临床微生物学核酸扩增三步基本操作


图1临床微生物学中核酸扩增分析的三步基本操作,包括样本提取、RNA/DNA扩增产物及检测/鉴定。对于每个步骤,图中总结了在临床环境中使用的不同技术/程序选择,其中诊断技术的重要类别还将(从概念上或仪器方面)归纳在一起进行总结,比如用于核酸扩增和检测的qPCR/qRT-PCR,以及各种高通量自动化和即时检测平台,通过工程学特性从一步到另一步连续切换。


虽然这一理论有许多变化,但水解法(或“TaqMan”)是最广泛使用的,它利用了水生嗜热菌(T. aquaticus)DNA聚合酶的5’-核酸外切酶活性[36]。在引物延伸过程中,这种酶将切割其路径上已经与目标杂交的任何寡核苷酸。荧光基团和猝灭剂在另一端(5’端和3’端)连接到探针,未被淬灭的荧光基团的荧光水平随着扩增的进行而增加。荧光PCR探针在微生物诊断领域还有许多附加的应用价值。在这个仪器中,扩增、检测和目标确认的各个步骤(如通过熔融曲线分析)可以在单个密封的反应容器内进行[37]。这不仅简化了实验程序,而且还避免了在实验室内因操作不当导致非特异扩增的风险。此外,不同荧光的独特发射光谱(跨越可见光光谱)使得多重检测成为现实[38]。不同产物的扩增过程,可以通过它们各自荧光基团的发出颜色来区分,以此实现实验过程的实时追踪。虽然这种多重化的程度受到光谱重叠的限制,但它仍然可以显著增加分析的范围和通量。


重要的是,像TaqMan这样的探针技术在概念上是简单的:每个靶基因对应一对引物和一个探针,这种方法可以合理地适用于不同的和/或新的微生物靶标。这种便捷甚至允许单独的临床实验室开展满足当地需求新的实验室开发测试(LDT)[39]。这些“自制”反应通常是围绕独特的患者群体、不常见的标本类型或地理上有限的病原体开展的,这些病原体的商业分析尚未获得国家监管部门的批准(在分子测试早期需要)。例如,在美国,LDT必须根据临床实验室改进修正案(CLIA)规定的特征进行验证,但不需要FDA的批准或许可。TaqMan对检测开发的指导作用与新出现的病原体特别相关,2020年初在全球范围内颁布的第一批2019年冠状病毒病(COVID-19)检测方法就是例证[40]。


除了这些优点之外,荧光PCR检测的一个关键优势是它不仅能够定性,而且能够实现定量检测。对于许多感染来说,医疗决策不仅基于病原体的存在或不存在,而且取决于其丰度。最常见就是血液病毒载量,医生利用病毒浓度来推断慢性感染的患者对治疗的反应或机体的免疫状态[41],如下所述。同样,人们越来越希望对来自固有的非无菌解剖部位,例如呼吸道[42]和泌尿生殖道[43]的机会性病原体在分子水平进行量化。在这些部位,引起直接感染的相同微生物可以代表共生菌群或非特异性的发现,而机体负担可能反映不同的作用。


对于这些和其他临床情况,PCR技术特别适合。尽管无论靶基因的初始数量如何,反应终点的荧光强度都是相似的,但可检测到达到这一荧光强度所需要的时间,这与样本中核酸的初始载量密切相关。每个周期成倍的扩增产物在目标的初始数量和荧光达到可检测阈值的周期数(CT值)之间建立对数线性关系。通过分析已知的定标浓度结合未知的诊断,可以通过CT值和线性回归分析修正实际的核酸载量[41]。或者,如果在定义的范围内扩增效率已被严格验证,则可以从单次定标结果中推断出量化值。无论是拥有正式监管批准的商业平台还是当地的LDT,这种“实时”PCR和逆转录PCR的过程是大多数定量检测传染性病原体的基础。最近,数字微量PCR(ddPCR)能够在极低的靶标浓度下获得更高的准确度,创造了一种绝对定量靶基因的替代方法,这种技术的原理是将标本大规模地片段化成无数(多达数百万)纳升级别的小液滴,其中每个都经过扩增和微流控检测[44],最后通过泊松模型对阳性液滴的比例进行量化。


五、不同于PCR的其他核酸扩增法


PCR一词经常与“核酸扩增”同义使用,证明了其具有开创性。然而我们必须强调,其他核酸扩增试验(NAATs)已经被开发出来,不同于PCR,它们的反应过程通常是不需要变温循环的等温法。尽管对这些技术的详细回顾超出了本综述的范围[45],但我们注意到有几种方法已被纳入流行的商业平台,并得到广泛传播。这些方法包括环路介导的等温扩增[46]、核酸内切酶扩增反应[47]、转录介导的扩增[48]和螺旋酶链反应[49]。此外,COVID-19大流行导致一些基于CRISPR/cas的检测方法首次通过紧急使用授权占领了IVD市场,并与循环介导或重组酶辅助扩增相结合[50]。等温技术的理论优势在于其简化的仪器,在某些情况下比快速循环PCR更受到欢迎。


六、微生物核酸扩增实验的常见应用


经过40多年的改革,PCR和其他NAATs的出现极大地提高了临床实验室的能力,改变了“标准”诊断的定义。NAATs已经成为指导住院和门诊病人感染诊断的一个常见的综合组成部分。其中包括上呼吸道感染(URIs),如COVID-19[51]和流感[52];急性胃肠炎[53];性传播感染(STIs)[54];以及脑膜脑炎的及其他可疑病例的有症状的病例和无症状筛选[55]。在这些情况下,分子方法在很大程度上取代了传统的病毒病原体培养,特别是考虑到培养的技术复杂性和孵育时间[56, 57]。此外,对于肠道病毒,大多数致病因子在标准的实验室诊断条件下是无法培养的。类似的情况也适用于利用透射电子显微镜进行病毒诊断,现在只限于适用于特定的临床和公共卫生场景[58]。NAATs也同样适用于检测对生长要求超过常规培养能力的病原体(如衣原体、支原体和百日咳鲍特菌)[59-61]。对于各种寄生虫(如滴虫、阿米巴、隐孢子虫),尽管粪便免疫测定仍是常用方法,但NAATs已逐渐取代了依赖显微镜观察的方法[53]。


相反,分子诊断对更容易培养的细菌和真菌的作用更难用单一的、广泛的方式来描述。对于这些微生物,NAATs与非分子测试的相对价值哪个更高取决于具体的生物体和感染的解剖部位。但总的来说,尽管目前已经开发了许多分子检测方法,但仍需要以更快或更直接的方式来提供与常规细菌/真菌培养相似的数据。在某些情况下,例如筛查机会性病原体或抗生素耐药菌株的定植(如直肠、阴道、鼻腔)时,NAATs可以提供与传统的选择性/差异性培养相称的性能,理论上是一种不错的替代选择[62]。对于其他的感染,培养的高敏感性(低至只有一个活的生物体)决定了NAATs不能作为完全的替代品。然而,即使在这里,分子检测也可以通过其“排除法”的能力来显著改善医疗服务。例如,呼吸道或脑脊液(CSF)标本的结核分枝杆菌PCR阴性,仍必须经过几周的培养才能完全确定这种生物体的存在,这种生物体生长缓慢,可能以极低的负荷存在于标本中[63]。然而,快速PCR的阳性结果允许临床医生实时确定结核病的诊断,甚至根据耐药性的可能性调整治疗。后者是Cepheid Xpert MTB/Rif检测的基础,它帮助发展中国家普及了分子诊断技术[64]。来源于同一测试的阴性结果,特别是在多次重复均为阴性的情况,感染预防专家也可以利用它来预测患者感染结核病的可能性较低,从而终止预防空气传播的措施[65]。


如上所述,对分子定量同样已成为许多病毒病原体和临床诊疗的常规需求。这些包括慢性感染,如人类免疫缺陷病毒(HIV)[66]、丙型肝炎病毒(HCV)[67]和乙型肝炎病毒(HBV)[68],其中病毒载量水平可以反映疾病的进展和患者应对治疗的反应。鉴于目前的抗病毒药物已经使HIV无限期抑制和HCV完全治愈成为现实,故这些测量结果尤其重要。此外对免疫功能低下患者体内的潜伏病毒仍需要进行检测,尤其是接受干细胞和实体器官移植后的患者,其中内源性再激活(或甚至供体源性的感染)可显着提升发病率。这些病毒包括各种DNA病毒,例如巨细胞病毒[69]、EB病毒[70]、BK病毒[71],以及腺病毒[72]、细小病毒[73]和人类疱疹病毒6/7/8型[74]。检测血液中的此类病毒可以通过多种方式为治疗提供信息。在没有体征/症状的患者中,内源性病毒载量增加可能表明过度免疫抑制或临床尚未发现的病理早期(在EBV感染的情况下可表现为明显感染或病毒源的瘤形成)。相反,如果临床怀疑特定解剖部位有疾病,血流病毒载量可以帮助临床医生确定该病毒是否为病原体,尤其是如果该部位不能在没有侵入性程序的情况下直接取样和检测。


现在一些商用的qPCR平台可以实现对许多病原体的检测,这些平台已经在美国FDA进行了试验并被正式批准使用,通常校准可追溯到世界卫生组织(WHO)的国际单位标准[75]。这些流程在执行测试的各个实验室之间提供了一定程度的质量保证和数据标准化。众所周知,样本中的病毒载量在不同的qPCR批次的试验之间可能存在显着差异,所以必须明确验证测定间的可重复性和可互换性[76, 77]。这种不一致可能源于引物/探针序列、DNA/RNA提取方法、PCR仪器、校准品来源的差异,甚至是特定病原体和标本类型(例如,全血与血浆)[78]。在学术机构、参考实验室和公共卫生机构,NAATs(无论定性还是定量)的多样性可能要大得多,通常可以满足多种的临床常见。值得再次强调的是,这些检测通常是LDT,没有现成的FDA批准的方法。所以,在比较此类测试之间的定量值或对外公布的数据时需要谨慎。


七、测序技术在微生物诊断中的应用


虽然NAATs仍然是临床微生物实验室中最常见的分子工具,但病原体的基因序列也可以提供有价值的数据。因此,诊断测序在感染治疗中发挥着越来越重要的作用。测序技术正飞速发展,该技术已经扩展到链终止方法之外的领域,包括同时表征数百万/数十亿读数的二代测序(NGS)[79]。这些NGS技术包括二代短序列方法(例如Illumina、Ion Torrent)和三代长序列技术(例如PacBio、Oxford Nanopore)[80]。目前临床使用的大多数应用于诊断的序列技术的都是由各个实验室开发的LDTs。尽管如此,一些测序分析技术已经在国家层面获得了用于评估HIV的IVD状态[81],其中包括第一个NGS平台[82]。


测序可以用来表征直接从临床标本中提纯的微生物DNA/RNA和从培养中已经分离的单个菌株中提取的微生物DNA/RNA。例如,细菌/真菌的鉴定主要是通过替代方法(如生化表型和质谱)来进行的。但分类学的基础还是在于DNA[5]。当替代的方法难以满足时,对微生物管家基因的测序可提供更高的标准。其中包括细菌的16S rRNA基因和真菌的核糖体内转录间隔区序列(ITS),其他位点也可能是解决分类的必要因素,这取决于需要鉴定的物种[83]。各种位点的菌种级别的测序也可以在追踪疫情方面发挥重要作用,因为它能够衡量菌株之间的相关性或克隆性[84]。鉴于NGS的出现,基于全基因组测序(WGS)的检测方法在定义疫情[85]和描述病原体流行病学[86]方面发挥着越来越大的作用,这在公共卫生实验室显得尤为重要。


此外,测序可以在各菌株之间的水平上评估一个生物体的相关临床表型,包括指导抗菌疗法。它对生长特性具有挑战性(缓慢、繁琐或构成生物安全风险)的病原体特别有价值。HIV是一个公认的例子。HIV的蛋白酶、逆转录酶和整合酶位点具有多态性,这种多态性与逆转录病毒的耐药性相关[66, 87]。一般来说,由于病毒的基因组较小,是抗菌药物基因分型的理想靶标[88, 89]。对于细菌和真菌,WGS同样为培养的分离物或未培养标本的肿瘤抗菌谱提供了可能[90]。例如,对于结核杆菌和潜在的其他分枝杆菌物种,确定的基因中的多态性与对普通药剂的表型抗性密切相关[91, 92]。正在进行的工作旨在将这一模式扩展到其他菌种,包括当抗药性没有被完全展现出来或者是相互作用的位点功能较为复杂时。值得注意的是,为了给疾病的诊断建立相互关系,运用多位点和机器学习模型预测WGS数据的抗菌素敏感性已越来越普遍[93]。


分子检测不一定分为扩增/检测和基于序列的特征分析。随着科技的发展,可以利用测序来检测临床样本中病原体的存在,同时确定其特征。在各种不同的情况下,这种策略被描述为广义的检测、不确定的检测和诊断性的宏基因组学[94]。例如,美国的LDTs和欧洲的IVDs已经围绕着泛细菌[95]、泛霉菌[96]和泛真菌[97]PCR建立了起来。上述位点(16S、ITS等)是针对从组织(新鲜或固定)或液体标本中提取的总核酸进行的PCR反应,最后对扩增子进行测序,以确认检测和识别致病的病原体。虽然这种方法不一定比传统的微生物培养或目标特异性NAATs更敏感或特异(至少在所有生物体/部位),但在某些情况下,它可以对已有数据提供有价值的补充。例如,如果临床/显微镜下证实存在感染,但相应的培养物没有生长时。


更进一步说,从临床标本中提取的核酸可以直接进行基于NGS的深度测序[98, 99]。尽管大多数基因拷贝数来自于宿主,但如果只有一小部分与病原体有关,那么即可表明NGS所发挥的病原学诊断作用。血浆是宏基因组分析中另一个重要标本类型,尽管在血液中检测到微生物核酸并不等同于菌血症[100]。相反,微生物基因组拷贝数往往反映了机体内的感染病灶有无通过细胞外空间进入循环的游离核酸。因此,血液中没有活的或完整的循环生物体,但能检测到低水平的微生物DNA/RNA的可能性是存在的。目前,对于CSF、支气管肺泡灌洗液(BAL)[101]和滑膜标本[102]已经推出了相应的技术。当然,这些检测方法的开发、质量保证和报告可能比其他分子诊断法要复杂得多,特别是在参考标准、对照、微生物定量和序列数据库的验证方面。从条件致病菌中分辨出共生或短暂的菌群(甚至是背景信号)也是一个挑战。由于技术的新颖性和数据的个性化带来挑战,对宏基因组数据的临床解释仍需谨慎。目前,虽然临床上的成功经验有据可查,但能提供这种测试的参考中心寥寥无几[98, 99]。宏基因组学检测将凭借其在对微生物药物敏感性的准确预判[103]或甚至是通过转录组学的预测宿主反应的能力[104]使得它在未来的运用上越来越广。


图2. (A)分子诊断的综合主题。指导分子诊断应用于感染性疾病护理的关联因素网络。这里提供的例子包括诊断技术本身的进步和我们对感染和宿主-微生物相互作用的病理学理解;实验室和诊所在实践和后勤中的注意事项;卫生保健资金和赔偿中的重要事项;以及世界各地围绕诊断检测的监管/法律框架。(B)NAAT技术的发展。经许可转载自参考文献159。POCT即床旁检测。


八、分子诊断中的突出主题


通过大量的方法和病原体,感染性疾病分子检测的多样化已经达到了令人难以置信的程度。尽管如此,这种情形还是因一些重要的主题而受到关注,这些主题展示了技术进步、我们对微生物发病机制的理解以及指导现实中诊断应用的关键元现象之间的巨大相互联系(图2A)。最首要的是对操作简单性的要求,尽管分子诊断设备的工程越来越复杂,但越来越易于使用。自然地,分子检测作为常规护理在检测量和周转时间方面有更高的期望[105]。简而言之,如果所有的分子工作都由专项技术人员手动完成,现代微生物实验室是不可能存在的。


因此,商业分子平台的设计越来越强调自动化和样本到结果的能力,类似于基于培养的诊断微生物学中实验室的全面自动化。在这里,自动化液体处理平台可以将核酸提取与扩增、检测甚至报告相结合,最大限度地减少了直接操作样本的需求[106]。我们的目标是,即使没有专门的分子微生物学家团队的实验室也可以支持大量的分子检测(尽管仍然需要专家来识别和排除出现的问题,防止检测成为一个完整的“黑匣子”)。因此,大部分制造商的做法是开发自动化平台,在这些平台上可以应用一组单独的NAATs,每个都有自己的IVD状态[107-109]。事实上,这类仪器的普及可以改变临床实验室的布局。传统上,分子实验室非常重视其空间工作流程。扩增前区和扩增后区保持清晰的分离,通常为单向流动,以防止分子交叉污染。虽然防止分子污染仍然实验室质控方案的一个关键组成部分,但独立的自动化的使用大大降低了潜在的风险。


对分子诊断的简单性的需求远远超出了实验室本身。希望在床旁(POC) 实施分子检测是最值得注意的趋势之一,包括诊所和紧急护理场所[110]。微生物学中的POC检测并不是一个新概念,因为上呼吸道病毒(流感和呼吸道合胞病毒)和链球菌咽炎的快速抗原检测已经存在多年。一般来说,POC诊断可以促进针对性治疗,防止不必要的治疗(即,抗生素管理),并推动感染预防工作。分子POC检测比传统的免疫分析更具有优势,特别是敏感性和阴性预测值得到了提高[111]。例如,为了彻底排除感染,流感或链球菌抗原阴性结果必须随后进行额外的以分子或培养为基础的实验室检测。相反,分子POC检测阴性可以作为这些药剂的一种排除条件,消除了经验治疗的必要,而后续结果待定。


尽管实验室中的分子平台越来越多地为检测量而设计,但POC设备被设计为在任何给定时间快速、特定使用。它们将核酸提取、扩增和检测结合在一个整合、密封的机壳里,使其简单、快速、安全(图2B)。对于POC工具而言,操作的简单性甚至比包括获得监管批准(美国的“CLIA-豁免”等级)在内的其他条件更重要。低复杂性是至关重要的,因为作为最终用户的临床医生往往没有接受过分子技术或诊断质量监测方面的正式培训。早在2019冠状病毒病之前[112],近年来就推出了几项针对呼吸道病原体的分子POC检测[111],以及首个针对性传播感染的此类平台[113],预计分子POC检测的范围只会扩大。正如2004年Raoult等人[114]预测的那样,微生物诊断可能会变得越来越两极化:在门诊(甚至在家里)直接进行随机访问分析,或在中央实验室使用批量、自动化的平台。


这些相同的POC注意事项在发展中国家全球健康和诊断可用性的背景下也同样至关重要。2003年,世界卫生组织提出ASSURED标准(价格实惠,灵敏,具体,用户友好,快速,无设备,交付)作为资源有限环境下诊断的目标,特别强调热带传播(如疟疾、结核病)和性传播(艾滋病毒、梅毒)感染[115]。虽然分子检测通常需要少量的仪器,但这些原则仍然可以为整个国际社会的分子诊断发展提供信息[116]。最近提出的RE-ASSURED标准阐明了重要的实际考虑,包括灵活供电和连接到移动设备以进行报告[117]。


当然,如果不解决高复合症候群检测的出现,任何关于感染性疾病分子检测的讨论都是不完整的[118]。对于各种感染,鉴别诊断可能包括许多无法通过临床鉴别的病原体,相反,需要对每种微生物进行平行检测。迅速获得这一信息可以促进针对性的护理升级和降级,促进抗菌药物管理[119]。可能病原体的数量往往超过传统多重qPCR的多路复用限制。相反,需要专门的方法在空间上或通过一些其他标记来隔离潜在的扩增子。目前,几种PCR驱动的平台在临床中普遍使用;这些仪器包括基于探针检测的:空间排列荧光基团[120];金属纳米粒子的光学检测表面阵列[121];微电路阻抗干扰[32];以及调制磁共振松弛特性[122]。重要的是,这些仪器必须在一个独立的设备(理想情况下)中包含专用的微流体,连接核酸提取,扩增和检测。


症候群检测在临床上广泛应用于呼吸道感染(包括上呼吸道感染)的鼻/鼻咽拭子检测[123]和肺炎的肺泡灌洗液检测[124];急性腹泻的大便检测[125];脑膜脑炎的脑脊液检测[126]和血流感染。根据平台的不同,后者可能需要分析血液本身[127]或血液培养瓶中最初的微生物生长[128]。其他综合征检测正在积极开发和评估中,包括关节[129]和尿路感染[130]。对于一个平台(FilmArray),呼吸系统平台的POC使用被授予了CLIA-waived等级[131]。


虽然多重平台具有强大的分析能力,但它们的实施并非没有挑战。一种常见的情况,特别是对呼吸和胃肠系统,涉及到多重目标的检测以及这是否反映了恶化的混合感染[132]。事实上,所有分子检测的一个关键限制是,检测(本身)不能区分出活病原体的核酸和解决/治疗感染的“分子残留物”。类似的挑战涉及区分感染与无症状定植。在解释任何分子数据时,这种潜在的模糊性是固有的,但在同时检测到许多指标时,和在预测概率高的患者中是非常相关的(例如,儿童和上呼吸道感染)。同样,作为初步诊断检测而开发的试验并不总是适合作为治疗的分子检测,这一动态因COVID-19而显著,并希望利用阴性随访结果通知接触限制[133]。矛盾的是,这种检测的高分析灵敏度可能会降低它们辨别已解决的感染的能力。


即使多重检测的临床解释是毫无疑问的,围绕临床可操作性、正确使用和诊断管理的其他问题也会出现[134]。举个简单的例子,一个具有免疫能力的成年人是否需要对有限发作的无血腹泻进行多重粪便检测?大多数临床医生会回答否,因为一个明确的诊断不会改变支持性护理的过程。在这种情况下,各种社会层面的建议现在包括基于患者临床表现和风险因素的症候群检测建议参数[135, 136]。个别机构也同样颁布了何时允许症候群检测的算法,例如,结合患者的年龄、检测原理或其他实验室数据[137]。无论是好是坏,这些问题也与医疗保健经济学有着内在的联系。尽管全球各地的财务模型存在显著差异,但在决定哪些检测可报销时,症候群分子检测并没有逃脱支付人的注意,这在主要利益攸关方之间引发了大量讨论[138]。事实上,在美国,症候群感染的分子CPT(当前的程序术语)代码现在是按多重病原体的数量分级的。


这些管理和报销问题突出了围绕分子微生物诊断的一个甚为广泛的问题:越来越多的人认识到效果研究的必要性[139]。传统上,分子检测的研究和开发工作侧重于分析/诊断性能;换句话说,其特征就是在临床检测实施之前经过验证。然而,一旦一项检测启动,在实验室内外,围绕其理想利用率以及最终对患者护理和医疗成本[101]的问题往往仍然存在。虽然确定检测的可归因结果并不总是直接的,但如果不能以循证的方式改善结果或节约资源,更多的诊断数据就不一定是“好数据”。尽管如此,近年来,临床微生物学中基于效果的研究越来越多,而症候群平台是最受欢迎的话题之一[140, 141]。类似的问题也适用于宏基因组学和其他新兴的NGS分析,需要系统地定义它们以及非分子和靶向分子检测的作用[142]。根据新出现的数据得出的一个突出的观点是,这些工作流程可以补充传统方法,但肯定还不能取代它们[143]。


回到检测的分析维度,人们必须认识到,感染性疾病的分子分析应该超出核酸的范畴[144]。广义上,分子诊断不仅包括基因组学,还包括代谢组学[145]、转录组学[146]和蛋白质组学技术[147]。事实上,通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱,蛋白质组学在细菌/真菌鉴定中的广泛应用证明了蛋白质组学技术的力量[148]。这样的进展为结合宿主和病原体的多分子特征诊断提高了希望,虽然他们也强调在临床微生物学中需要更流利的生物信息学,医学信息学和其他计算技术。这一事实已经在一些实现了NGS管道和大数据的实验室体经历过了[149]。


这些新的范式甚至可以超越微生物疾病的传统定义。近十年来,我们对微生物组在人类病理生理学中的作用有了更深入的认识[150]。现在已经确定了微生物群(肠道内和其他地方)的种群结构与全身疾病状况之间的巨大关联[151, 152]。这种关于健康和疾病的病理生物学观点是建立在宿主-微生物在生理、代谢和炎症水平上的复杂关系之上的,这些关系通常超出了微生物疾病的科赫历史标准。然而,如果对患者微生物组的特征描述能够影响治疗,那么其可能具有诊断价值[153, 154],即将人体微生物生态系统作为生物标志物。在这种情况下,这种检测的效用将不仅取决于关联本身(传统的指标,如敏感性、指定和受试者工作曲线),而且取决于前面提到的可操作性的概念[155, 156]。从本质上讲,确定患者的微生物群是否能让临床医生加强个性化医疗护理?虽然诊断微生物组检测的概念仍处于起步阶段,但它提出了一个令人兴奋的想法,即临床微生物学可能最终发展到超出感染性疾病。


最后,无论是成熟的技术还是新兴的技术,都必须考虑不断变化的法律/监管要求的影响。在任何地方,诊断监管的现状都不是一成不变的。例如,在美国,检测必须以临床定义的表现类别为特征,或者大体上通过 FDA上市前审查或作为单点LDTs。然而,未来的立法可能会改变这一动态,包括提出的VALID Act及可能扩大国家LDT监管[157]。此外,在欧共体,诊断部门正在准备实施体外诊断医疗设备条例2017/746,该条例扩展了试验的上市前要求[158]。虽然这些变化并不局限于感染性疾病的治疗,但鉴于分子检测现在的普遍作用,这一领域可能是受影响最深刻的领域之一。


九、结语


虽然临床微生物实验室的基本任务保持不变,但其工作范围在过去40年发生了变化,而分子诊断是这一变化的根源。从日常实践中遇到的常规情况到由专家处理的罕见情况,这些检测都已经改变了感染性疾病的护理。不仅从技术角度,而且从与现代卫生保健服务至关重要的相互关联的后勤、财务和监管因素方面,持续的进步将继续维持这种改变。简而言之,这场分子诊断革命没有放缓的迹象。

参考文献

英文参考文献参见 https://journals.asm.org/doi/10.1128/jcm.02446-21