膜性肾病相关自身抗体谱检测与临床诊断价值

罗静，医学博士、硕士研究生导师、主任技师/主任医师。现任山西医科大学第二医院风湿免疫实验室主任，风湿免疫微生态山西省重点实验室主任，美国佛罗里达大学和西北大学访问学者，山西省学术技术带头人，山西省首届三晋英才拔尖骨干人才，山西省卫生计划生育委员会百千万卫生人才培养工程骨干精英人才，兼任世界华人检验与病理医师协会委员、中国医师协会风湿免疫科医师分会第一届青年委员、中国中西医结合学会检验医学专业委员会委员、中国研究型医院学会检验医学专业委员会临床免疫学组委员、山西省免疫学会常务理事、山西省临床免疫学会副主任委员、山西省医师协会检验医师分会常委兼任副总干事、《中华临床免疫和变态反应杂志》青年编委，《Frontiers in Immunology》、《International Journal of Rheumatic Diseases》等杂志审稿专家。近年来负责国家级、卫生部及省院级研究课题10余项，科研经费200余万元，获山西省科技进步奖7项，发表中英文论文60余篇，其中SCI第一作者或通讯作者24篇，主译人民卫生出版社《Autoantibodies》中文版第3版，获国家发明专利2项。

秦艳，山西医科大学第二医院风湿免疫实验室技师，临床检验诊断学硕士，以第一作者发表SCI 6篇，参编《免疫微生态学》。

膜性肾病（Membranous nephropathy，MN）是一类以免疫复合物和补体成分肾小球基底膜上皮细胞下沉积伴基底膜弥漫增厚为特征的免疫性疾病，临床以肾病综合征、蛋白尿伴水肿为主要表现。在原发性MN中，肾小球足细胞表面的一个或多个抗原结合的循环自身抗体驱动自身免疫，其中70-80%原发性MN患者的靶抗原为抗磷脂酶A2受体（Phospholipase A2 recepto 1，PLA2R），具有2-5%的患者为1型血小板反应蛋白7A结构域（Thrombospondin type 1 domain-containing protein 7A，THSD7A）。此外，新型体内外检测技术的发展及更多MN相关抗原如神经表皮生长因子样蛋白1（neural epidermal growth factor-like 1，NELL-1）和信号素3B（semaphorin-3B，Sema3B）等的鉴定进一步提高了MN的分类与诊断。本文将就MN及其自身抗体谱的检测与临床应用价值进行概述，以期为开发更特异的、基于发病机制的治疗策略提供思路，从而改善MN患者的管理。

一、膜性肾病概述

膜性肾病（MN）是以免疫复合物和补体成分上皮下沉积及新基底膜合成导致肾小球毛细血管壁增厚为特征的肾脏免疫性疾病。免疫复合物沉积和膜攻击复合体形成引起足细胞结构病理生理紊乱导致的患者血清白蛋白水平下降，蛋白尿和全身性水肿是其主要临床特征。原发性MN是非糖尿病成人特发性肾病综合征最常见的病因，约占成人肾病综合征的20%-30%，在65岁以上成人中高达58%，肾脏预后较差。循环自身抗体与足细胞表面的内源性靶抗原结合为原发性MN的主要致病机制[1]。Beck于2009年在约70%成年初发MN患者的肾小球蛋白提取物中分离出185kD的蛋白，即M型磷脂酶A2受体（Phospholipase A2 receptor，PLA2R），并确认PLA2R作为靶抗原存在于沉积的免疫复合物中，可识别主要为IgG4亚型的抗PLA2R抗体[2]。这一发现表明原发性MN是一种自身免疫性疾病，其中足细胞既是循环自身抗体的靶点，也可能是自身抗原的主要来源。随后，另一种足细胞抗原，1型血小板反应蛋白7A结构域（Thrombospondin type 1 domain-containing protein 7A，THSD7A）在MN被鉴定，极大地促进了对MN分子发病机制的认识[3]。足细胞均可表达PLA2R和THSD7A，但它们在免疫沉积物中的积累只发生在MN患者中。最初研究认为抗PLA2R抗体和抗THSD7A抗体是相互排斥的，但近几年有研究报道抗PLA2R和抗THSD7A抗体双阳性的MN患者[4]。此外，约20%的MN继发于各种疾病，包括感染（乙肝）、系统性疾病（系统性红斑狼疮和结节病）、甲状腺炎、恶性肿瘤和非甾体抗炎药物的使用，IgG1，IgG2和IgG3免疫荧光沉积是继发性MN的标志[5]。

MN的致病机制颇为复杂，针对内源性或外源性抗原的自身抗体的产生被认为是MN发病的第一步。在原发MN中，抗体与足细胞上的内源性抗原结合，继发性MN中，抗体可能与积累在上皮下间隙的种植抗原结合。尽管靶向抗原已经确定，但触发针对这些抗原的免疫反应和确切病理机制仍未完全阐明。遗传因素、环境因素、自身免疫机制、补体激活和细胞适应性免疫反应在MN发生发展中发挥重要作用。如大多数自身免疫性疾病，MN与人类白细胞抗原（HLA）II类抗原有很强的相关性。PLA2R、HLA中的单核苷酸多态性及免疫和炎症相关基因如NF-κB1和IRF4与MN发生发展密切相关，特别是在PLA2R和HLA高危等位基因纯合的患者中，且被发现具有预后价值[6]。环境因素亦可在MN的发展中发挥作用。长期暴露于PM2.5与MN发病率增加密切相关。高暴露于PM2.5可能会诱导PLA2R表达于炎性肺组织，并在强氧化环境中暴露PLA2R表位，从而影响多种急性细胞因子表达，如IL-1β和IL-6，进而引起血管内皮细胞的炎症反应导致肾脏损伤[7]。此外，T细胞在自身免疫的发展中起着核心作用，原发性MN作为一种自身免疫病，T细胞亚群亦发生相应变化。MN患者T辅助性17细胞较正常人显著增加，调节性T细胞降低[8]。MN循环浆细胞和调节B细胞的百分比亦高于健康人或其他肾脏疾病患者，滤泡辅助T细胞与MN疾病严重程度相关[9, 10]。

目前，MN的治疗主要集中于免疫抑制、单克隆抗体及联合治疗。在很长一段时间里，由于环磷酰胺为基础的方案可防止晚期肾衰竭的发生，被认为是标准的治疗方案，但免疫抑制是抗原非特异性治疗方式，可导致整个免疫细胞的广泛损耗，进而增加罹患恶性肿瘤的风险。因此，为减少免疫抑制作用，更有针对性、特异性的单克隆抗体被使用，如CD20靶向药物利妥昔单抗，耐受性良好，但仅60-70%的患者可达到临床缓解，而环磷酰胺治疗缓解可达80%[11]。因此，阐明免疫复合物形成过程、识别相关自身抗体的靶向确切表位和确定肾小球病理生理机制一直是临床和实验室研究的重点，对相关自身抗体的进一步了解有望开发一种新的基于个体化血清学的治疗方案。

二、MN自身抗体谱

自身抗体可能在MN临床表现如蛋白尿或水肿出现前几年甚至几十年已经形成，因此MN自身抗体的检测尤为重要[12]。靶抗原PLA2R和THSD7A的鉴定，以及MN病理生理学方面的重大发现，使MN的特异性分子诊断成为可能，并引发了MN患者诊断、预测结果和监测治疗的思维模式的转变，为临床诊断、治疗及预后监测提供了新思路。

1. 抗PLA2R抗体：PLA2R抗原的发现是MN的一个里程碑，对其结构特征的研究为揭示MN的分子病理机制奠定了基础。Beck于2009年在约70%成年初发MN患者的肾小球蛋白提取物中分离出185kD的一种跨膜糖蛋白，主要局限于肾小球足细胞，即PLA2R[2]。大多数PLA2R抗体阳性的MN患者在肾小球毛细血管壁有强烈的颗粒状PLA2R染色，在正常肾脏或其他肾小球疾病中，该抗原仅在足细胞表面微弱可见。PLA2R属于I型跨膜受体，是哺乳动物甘露糖受体家族的四个成员之一。PLA2R有多个抗原表位，是成人原发MN中主要的足细胞抗原，可与IgG4共定位于肾小球沉积的免疫复合物中。PLA2R主要分为两型（M型与N型），M型PLA2R已被确认为自身抗体的主要靶抗原。因此，检测循环血液中的抗PLA2R1抗体对于诊断和检测原发性MN具有重要作用。抗PLA2R抗体水平是诊断原发MN患者理想的特异性生物标志物，在一段时间内持续监测抗体水平对确定治疗方式，监测治疗反应和判断肾脏结局甚至复发是非常有价值的工具。

2. 抗THSD7A抗体：2014年，在PLA2R之后，Tomas等通过免疫印迹在2%-5%的MN患者的肾小球提取物的纯化糖蛋白中检测到分子大小为250kD的蛋白[3]。该蛋白经质谱鉴定为THSD7A，为1型跨膜蛋白。这与PLA2R相似，THSD7A表达于足突的基底面，大多数抗THSD7A抗体亚型为IgG4。2016年，Tomas等从患者血清中分离出抗THSD7A抗体并将其注射给小鼠，发现小鼠足细胞结合THSD7A抗体可导致蛋白尿的发生和典型MN的组织病理学模式[13]。进一步的体外实验表明，抗THSD7A抗体直接诱导表达THSD7A的肾小球上皮细胞的细胞骨架重排，并激活局灶性粘附分子介导的信号转导[14]。在过去50年的大量观察性研究中显示，平均高达10%的MN患者患有良性或恶性肿瘤[15]。最近的一些研究表明，MN合并恶性肿瘤的患者体内有抗THSD7A抗体[16]。由于抗THSD7A抗体阳性患者的患病率较低，目前对临床预后的预测仍存在挑战。因此，THSD7A抗体水平对疾病转归的临床意义目前还不能确定。然而，小规模的队列研究表明，它与PLA2R类似，THSD7A抗体水平的降低也伴随着蛋白尿的减少，这表明与疾病的发生和持续存在因果关系[17, 18]。

3. 其他新抗原与抗体的发现：在近年的研究中，Sethi等通过使用激光显微切割肾小球，联合质谱分析以及组织学技术先后于2019、2020、2021年鉴定出PLA2R阴性MN患者的四种新抗原，外泌蛋白酶（EXT1/EXT2）、神经表皮生长因子样1蛋白（neural epidermal growth factor-like 1，NELL-1）、信号素3B（semaphorin-3B，SEMA3B）和原钙粘蛋白7（protocadherin 7，PCDH7），SEMA3B阳性大多为年龄＜2岁的儿童MN患者，而老年人多表达PCDH7[19-22]。与PLA2R和THSD7A不同的是，抗EXTl/EXT2，NELLl与SEMA3B的自身抗体均以IgGl亚型为主，抗PCDH7 IgG1和IgG4均被检测到。在PLA2R阴性MN的队列中，EXT1/EXT2是最常见的独特蛋白，在自身免疫继发MN中亦存在。此外，Bruschi等人使用覆盖人类基因组全部编码序列的高密度肽阵列（包含7,499,126个平铺肽）对MN患者的血清进行了研究，21个对MN血清反应的蛋白被鉴定出来，其中包含甲酸精-1（Formin-like 1，FMNL1），一种在MN患者组织中由巨噬细胞表达的蛋白质。在MN患者的血清中，ELISA检测到高水平的抗FMNL1 IgG4。同时显示肾脏中FMNL1阳性细胞与肾小球中的CD68共定位，这可能表明抗FMNL1 IgG4可能在MN疾病的进展中发挥作用[23]。此外，一些蛋白也被报道为MN中潜在的自身抗原，如神经细胞粘附分子1（NCAM1），溶酶体膜蛋白2（LIMP-2），蛋白激酶C结合蛋白，丝氨酸蛋白酶，转化生长因子受体β，接触蛋白1（CNTN1）和网蛋白G1（NTNG1）等[1]。总之，新型体内和体外实验模型的发展导致更多与MN相关的蛋白的鉴定，这将有助于确定自身免疫和局部肾小球病变之间的相互作用，进一步提高MN的诊断，亦为开发更特异的、基于发病机制的治疗提供机会。与此同时，不同抗原的发现将改变MN的分类，每个抗原相关的MN将有其特定的免疫谱（IgG亚类）和相关疾病模式，需进一步的研究来了解这些新抗原相关MN的病理生理机制。

三、MN抗体谱检测方法

蛋白免疫印迹（Western blotting，WB）在PLA2R抗体和THSD7A抗体的第一次发现中均被使用，但由于其复杂和耗时，不适于临床实验室常规使用。第一个商业化的抗PLA2R抗体检测试剂盒是德国Euroimmun公司的间接免疫荧光（indirect immunofluorescence，IIF）[24]。该检测系统利用表达人PLA2R1的固化HEK 293细胞，检测血清中PLA2R1特异性抗体，IIF对PLA2R1抗体的检测具有高的敏感性和特异性，对PLA2R1相关MN患者的筛查和随访有重大意义。但是，IIF只允许半定量检测抗体水平不适于疾病进展和治疗反应的监测，因此，酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）随后被研发，ELISA允许对抗体水平定量检测，目前在许多临床实验室中被常规使用[25, 26]。但ELISA亦有局限性，如敏感性低于WB和IIF[27]。因此，对于低水平PLA2R抗体的检测，IIF和WB仍是最敏感的方法，特别在持续蛋白尿且ELISA检测阴性的情况下，需使用IIF再次复测。商业化ELISA检测试剂盒PLA2R抗体阳性被定义为＞14RU/ml，然而，有研究建议临界值可调整为2RU/ml，这无疑会提高诊断灵敏度，但亦可导致假阳性率升高[28]。在临床实践中，高敏感度的IIF和ELISA绝对定量联合检测对确定抗体水平在疾病过程中的潜在作用，并监测治疗具有重要意义。

IIF和ELISA亦被用于血清中抗THSD7A抗体的检测[17, 18]。一项研究对ELISA、IIF、WB和活检染色检测抗THSD7A抗体的性能进行评估，表明ELISA与IIF效价显著相关[18]。

近年来，定位激光免疫分析法（laser bead immunoassay，ALBIA）被应用于抗PLA2R抗体的检测，该方法基于免疫荧光技术使用承载完整重组蛋白质的可定位激光珠进行检测，旨在同时测量单个样本中的多个抗体，具有多指标联合检测、标本用量少等优点[29]。在大量患者队列中分析不同检测方法的敏感性和特异性的研究将有助于更好地确定不同技术的检测特点。PLA2R和THSD7A抗原也可通过在石蜡切片上使用免疫荧光或免疫过氧化物酶法进行检测，并使用多克隆抗PLA2R或THSD7A抗体进行诊断。值得一提的是，肾活检始终是判断肾小球损伤类型的金标准。总之，建立高特异度、高灵敏度、允许绝对定量的检测系统对研究MN的致病过程尤为重要。

四、抗体谱检测的临床诊断价值

1. 基于血清自身抗体的诊断价值：抗PLA2R抗体是诊断MN高度特异的血清学标记物，PLA2R抗体在其他肾脏或系统疾病患者或健康个体中均未被检测到。研究表明原发性MN患者PLA2R水平增高，血清中抗PLA2R抗体水平亦显著升高。一项meta分析显示抗PLA2R抗体诊断MN敏感度为78%，特异度为99%，阳性预测值与肾活检相当，这提示肾活检不一定是诊断MN的必要条件，特别是对于有活检禁忌症的患者[30]。一项回顾性研究表明，血清抗PLA2R抗体阳性可作为无创诊断原发MN的标志，抗PLA2R抗体检测可作为一种非侵入性检测指导无继发病因的MN患者的治疗[31]。此外，一项纳入28个研究的meta分析显示，抗PLA2R抗体鉴别原发MN和继发MN时表现出良好的诊断准确性，其综合敏感性为65%（63~67%），特异性为97%（97~98%），阳性似然比为15.65（9.95~24.62），阴性似然比为0.37（0.32~0.42），诊断OR为50.41（31.56~80.52），曲线下面积高达0.939[32]。

目前，抗THSD7A抗体在健康对照组或其他肾脏和系统疾病患者中尚未被检测到，对MN病变具有100%的特异性。值得注意的是，THSD7A相关MN中，大量患者在3个月内检出恶性肿瘤，在子宫内膜癌和胆囊癌患者癌细胞可检测到THSD7A蛋白表达升高，且化疗导致THSD7A抗体下降及蛋白尿水平降低[33]。

2. 基于血清自身抗体的疾病监测：研究表明PLA2R抗体水平与疾病活动相关，且PLA2R抗体水平与蛋白尿呈正相关，与血浆白蛋白浓度呈负相关，抗PLA2R抗体水平升高是持续性高蛋白尿和肾功能下降的独立危险因素[34]。抗PLA2R抗体水平亦与疾病缓解相关，可用于指导MN治疗。血清抗PLA2R抗体水平低的MN患者易自发缓解，倾向于保守治疗。相反，高基线或增加的抗PLA2R抗体水平与肾病综合征和肾功能进行性丧失有关，因此更适于免疫抑制治疗。在基线临床特征和抗体水平相似的患者中，他克莫司和利妥昔单抗联合治疗组抗体降低幅度大于环磷酰胺治疗组[35]。此外，研究表明循环抗PLA2R抗体和蛋白尿有助于指导原发性MN肾病患者的个体化美罗华治疗[36]。抗PLA2R抗体水平的降低与症状缓解的时间显著相关，且疾病复发时血清抗体水平再次升高[37]。疾病缓解患者的血清抗PLA2R抗体水平显著低于未缓解患者，且抗体水平下降先于尿蛋白减少，这可能与足细胞上抗体与内源性靶抗原结合减少后肾小球的修复过程有关[38]。MN患者的生存分析显示连续监测抗PLA2R抗体水平可能有助于确定最佳治疗时间和评估治疗效果，减少不恰当治疗对患者的伤害[39]。

抗THSD7A抗体水平与THSD7A相关MN患者的疾病活性和治疗反应性相关[17, 18]。研究表明对治疗无反应或未达到缓解的患者抗THSD7A抗体持续升高[18]。

3. 基于血清自身抗体的预后监测：血清抗PLA2R抗体可有效预测治疗反应，抗PLA2R抗体水平在治疗的前3个月急剧下降，在6-9个月后消失，随后12-24个月蛋白尿缓解，治疗结束时PLA2R抗体水平可以预测长期疗效，抗体复阳或滴度增加可预示疾病复发[40]。治疗后PLA2R抗体阴性的大部分患者可保持5年缓解，而在治疗结束后，抗体阳性的患者在2年内均未缓解[35]。抗体滴度的重新出现或增加先于临床复发约3个月[36]。一个150例新诊断PLA2R相关MN患者的前瞻性研究通过WB和ELISA检测表位识别模式和区域特异性PLA2R抗体水平，证实血清中总抗PLA2R抗体水平与MN患者的临床转归相关[41]。研究亦表明移植时高PLA2R抗体水平与后续复发强烈相关[42]。此外，在THSD7A相关MN患者中，抗THSD7A抗体基线水平高的患者临床结局较差，移植时THSD7A抗体滴度高亦与疾病复发相关[13]。在MN的患者中，连续监测抗体水平可以提供更好的预后信息。

值得注意的是，临床症状的发展可能不仅取决于抗体水平，而且还取决于沉积在上皮下间隙的免疫复合物的数量，抗体通过肾小球基底膜的能力，以及与特定表位及其IgG亚类结合的能力。因此，肾活检仍然是诊断MN的金标准，但自身抗体的检测有助于有活检禁忌症患者的诊断，为治疗提供参考，并减轻过度医疗给患者带来的痛苦及经济负担。

五、总结与展望

综上所述，血清抗足细胞抗体水平的检测为无创诊断MN奠定了基础，并有助于鉴别原发性和继发性MN。针对主要足细胞自身抗原的血清抗PLA2R和抗THSD7A抗体水平与MN活动性相关，治疗后血清抗PLA2R抗体水平降低亦可作为蛋白尿缓解的早期指标，从而使个体化治疗成为可能。血清抗足细胞抗体水平还可预测缓解或进展至终末期肾病的风险。考虑到MN的病理机制的现有空白，最近发现的NELL-1、信号素3B在鉴别诊断、治疗管理和预后评估方面是否与PLA2R和THSD7A具有相同的临床相关性仍有待证实。因此，未来的研究需要确定每个抗原和抗体的致病作用，进一步评估这些抗原和抗体在疾病诊断、疾病活动监测和治疗反应方面的作用。此外，对产生自身抗体的B细胞亚群进行更好的表征和详细的表型分析可能有助于开发更具体的治疗方法。

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