重症肌无力血清学抗体临床特点与实验室诊断技术应用及研究重点
黄晶,教授、主任医师、医学博士,博士研究生导师。现任吉林大学第一医院检验科主任,研究方向为实验诊断学、临床感染免疫、自身免疫与肿瘤免疫及临床免疫学项目的实验室检测、临床应用及相关体外诊断试剂的临床研究。现兼任中华医学会检验分会免疫学组委员、吉林省健康管理学会检验分会主任委员、吉林省中西医结合学会检验专业委员会副主任委员、长春市医学会检验分会主任委员、中华检验杂志审稿专家等。作为负责人,主持国家级项目1项和973计划子课题1项,主持省部级项目3项,以及吉林大学横向联合课题40余项,累计经费230余万元。获得省科技进步二等、三等奖及吉林大学医疗成果、教学成果奖多项,获得2019年“白求恩式检验人”称号。累计发表论文90余篇,其中近五年以通讯作者发表SCI论文15篇,影响因子共计63.8;以第一作者/通讯作者发表中华系列及中文核心论文40余篇;出版专著1本。目前培养硕士研究生17人。
宋佳星,吉林大学第一医院主管技师,生物医学工程硕士,研究方向:自身免疫病相关自身抗体的实验室检测。
【摘要】重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是一种自身免疫性疾病,其通过体液免疫介导为主,主要表现为骨骼肌无力和易疲劳。MG发病机制与突触后膜上的相关组分的自身抗体功能异常有关,包含乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)、低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体(LRP4-Ab)、肌肉特异性受体酪氨酸激酶抗体(MuSK-Ab)、连接素抗体(Titin-Ab)及其他自身抗体等,MG自身抗体检测在疾病诊断治疗及预后方面具有重要意义。随着医疗技术的快速发展,自身抗体相关检测方法也不断进步,为MG的精准检测提供了更大的可能。因此,本文对现阶段MG相关自身抗体分类及其检测方法进行综述,以期为MG临床诊疗提供一定参考依据。
【关键词】重症肌无力;自身抗体;检测技术
重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是一种潜在且严重但可以治疗的自身免疫病之一,其发病是自身抗体调节的获得性神经-肌肉接头(neuromuscular junction,NMJ)信号途径障碍引起[1]。NMJ负责将信号从运动神经元的轴突末端传递到肌肉,迅速将神经元动作电位转变为肌肉收缩,而MG主要表现为血液循环中出现多种自身抗体,该类抗体能够损伤NMJ终板膜上的乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)功能,降低ACh与受体结合能力,抑制Ca2+内流,从而导致终板膜局部电位不足以集聚引起动作电位,从而影响肌肉收缩,导致肌无力发生[2-3]。流行病学调查显示,在中国每10万人中就有0.68人患有MG,女性患者的数量明显高于男性患者,数据显示在医院进行治疗的MG患者中死亡率能达到14.69‰,而致人死亡的关键因素是由于骨骼肌收缩无力而导致的呼吸衰竭以及肺部感染等[4]。AChR抗体是目前临床诊断MG的金标准,此外,越来越多的研究发现肌肉特异性受体酪氨酸激酶(muscle-specific receptor tyrosine kinase,MuSK)、低密度脂蛋白受体相关蛋白4(low-density lipoprotein receptor-related protein 4,LRP4)及兰尼碱受体(RyR)等自身抗体在MG的发生发展中具有重要作用,上述抗体能够降低AChR簇集、下调AChR功能及干扰NMJ神经信号传导。2020年《中国重症肌无力诊断和治疗指南》中提出的MG亚组分类正是基于血清抗体和临床体征,证明血清学抗体的检测对MG精准治疗和预后评估具有指导意义,本文就国内外MG实验诊断技术及临床应用及其进展作一概述。
一、MG血清抗体及临床特点
1. 乙酰胆碱受体抗体(acetylcholine eceptor antibody,AChR-Ab):肌肉烟碱型AChR为MG患者中检出率最高的自身抗原,其主要集中在突触后膜折叠部位的尖端。烟碱型AChR分子量为250kD,其性质为五聚体跨膜糖蛋白。AChR抗体主要属于IgG1和IgG3亚类 ,因此,它们可以激活突触后膜上的补体,从而导致AChR的丢失和其特征结构的破坏。其致病机制为:(1)通过补体与抗原结合后激活补体级联反应体系,促进相关复合膜形成,诱导攻击抗原-抗体复合物从而引起突触后膜的损伤。(2)通过抗原调节促进AChR内质化,使得抗原交联导致突触后膜上的AChR被破坏。上述机制均可导致突触后膜上AChR识别ACh能力降低,从而阻断AChR信号转导[5]。
AChR-Ab为导致MG发病的主要抗体,特异性强,作为诊疗和研究MG的重要指标,MG患者中AChR-Ab阳性检出率高达80~85%,且女性人群检出率更高,该抗体阳性也与胸腺瘤密切相关,有研究提示上述现象可能与感染EB病毒有关[6]。AChR-Ab阳性MG患者发病早期主要以眼部症状为主,多于1年内进展为全身型MG且同时伴胸腺组织异常增生。但是AChR-Ab检测的局限性在于MG疾病进展与AChR-Ab滴度并无明显相关性,不能够依据抗体滴度去评价疾病严重程度[7]。然而,针对于主要的免疫显性区高滴度的AChR-Ab抗体可能与更严重的疾病相关。此外,胸腺瘤患者胸腺切除术后AChR-Ab滴度可降低。在有眼部表现的MG患者中,AChR-Ab滴度的升高能够预测MG泛化的风险。AChR-Ab阳性MG治疗首选乙酰胆碱酯酶抑制剂,而难治性AChR-Ab阳性MG目前尚无有效治疗方案。目前研究方案显示,采用依库丽单抗治疗难治性AChR-Ab阳性MG可有效降低MG危象发生风险,其临床效果虽高,但安全性仍然需要长期随访来确认[8]。无独有偶,部分学者积极采用AChR-Fc来治疗难治性AChR-Ab阳性MG患者,通过新型生物分子制剂AChR-Fc来中和机体中的抗AChR-Ab,但近期研究表明生物分子制剂对体液免疫具有抑制作用,其适用性仍需探究[9]。
2. 肌肉特异性受体酪氨酸激酶抗体(muscle-specific receptor tyrosine kinase antibody,MuSK-Ab):肌肉特异性受体酪氨酸激酶(muscle-specific receptor tyrosine kinase,MuSK)选择性在骨骼肌细胞表达,是分子量约为110000的跨膜蛋白。MuSK为聚集蛋白受体之一,可与聚集蛋白结合使乙酰胆碱磷酸化并具有聚集AChR的作用。与AchR-Ab不同,MuSK-Ab属于IgG4亚类,不激活补体,其作用主要是抑制MuSK和胶原Q或LRP4之间的相互作用,通过结合到MuSK的第一个IgG样结构域即细胞膜外结构从而抑制AChR聚集,引起骨骼肌细胞动作电位阈值增加,最终导致MG的发生[10]。在患者血浆中存在的短寿命血浆母细胞是MuSK的主要来源。最近,从MuSK阳性MG患者中获得了单克隆抗体,为深入了解这种MG亚型的发病机制提供了线索。AChR-Ab阴性MG患者中MuSK检出率约为20~50%,多以年轻女性检出率高[11]。MuSK-Ab阳性MG患者以眼肌无力症且呈亚急性进展为延髓病变为主要表现,但MuSK-Ab阳性MG患者中眼部肌肉功能损伤发生率则明显低于其他MG亚型[12]。在幼儿期MuSK-Ab阳性MG患者可出现广泛的肌肉萎缩,引起患儿肢体和脊柱侧凸,且肌肉萎缩在发病早期较为明显,临床上多使用类固醇激素治疗,但部分患者效果不佳可进展为慢性,严重者甚至可导致患儿残疾[13]。
在其他并发症方面,因MuSK-Ab阳性MG患者较少合并胸腺瘤,因此临床上不建议该类型MG患者行切除胸腺治疗[14]。因MuSK-Ab阳性MG患者疾病严重程度与血清MuSK-Ab滴度具有相关性,故而MuSK-Ab滴度越高患者病情越严重。目前,MuSK-Ab阳性MG患者首选血浆置换及免疫抑制剂治疗,而胆碱酯酶抑制剂治疗效果较差。应用免疫抑制剂他克莫司可有效抑制MuSK-Ab阳性MG患者的CD4+和CD8+ T细胞增殖,减弱致病性Th17细胞分泌IL-17和TFN-γ的能力;此外,该免疫抑制剂还具有抑制滤泡性T辅助细胞和调节性T辅助细胞亚群的作用,但上述研究结果仅仅能证实他克莫司在MuSK-Ab阳性MG患者治疗中具有一定的效果,其中的具体作用机制还需要更多实验和理论的研究[15]。在非临床实验方面,有人应用动物实验证明Efgartigimod对MuSK-Ab阳性MG具有一定治疗效果,但其不稳定的安全性和长期性仍然是一大局限[16]。
3. 低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体(low-density lipoprotein receptor-related protein 4 antibody,LRP4-Ab):LRP4-Ab是含有多个低密度脂蛋白重复序列的单亚基跨膜蛋白,其具有较大的胞外结构域。在机体中,LRP4主要集中在神经-骨骼肌接头处,并且可在该处与集聚蛋白形成复合体,复合体可活化MuSK。LRP4-Ab具有破坏LRP4-集聚蛋白复合体的作用从而导致MG。IgG1亚群为LRP4主要组成部分,也是LRP4-集聚蛋白复合体的受体,能够有效抑制MuSk活化和AChR的聚集,可见到补体依赖性的细胞坏死,从而导致神经肌肉终板失去相应的信息传递功能。
流行病学调查表明,LRP4-Ab在MG患者中检出率为1~5%,在AChR-Ab和MuSK-Ab均为阴性的MG患者中检出率为19%[5],且LRP4-Ab阳性MG患者发病率呈现明显的地理位置差异。LRP4-Ab阳性MG主要多见于儿童及女性人群,此外研究证实LRP4-Ab阳性MG在男性人群中主要表现为迟发性MG[14]。LRP4-Ab阳性MG患者病变起始部位为眼肌,而颈部肌肉和其他部位则较少,与其他抗体阳性亚型不同,LRP4-Ab阳性MG患者临床症状相对较少,并且不常合并胸腺瘤。在临床治疗方面,LRP4-Ab阳性MG患者临床多采用胆碱酯酶抑制剂和泼尼松治疗,泼尼松治疗的LRP4-Ab阳性MG患者完全缓解率高达41.7%[17]。因此该自身抗体的检出率较低,故而如何提高其特异性和敏感性成为近期研究的难点。
4. 横纹肌抗体:此种抗体是针对细胞内蛋白的特定抗体,包括连接素抗体(Titin-Ab和兰尼碱受体抗体(RyR-Ab)),在MG的预后上发挥一定作用。这些蛋白表达于MG胸腺瘤组织中,相关的自身抗体被定义为“横纹”,因为它们以横纹模式结合到骨骼和心肌组织切片上(收缩结构的规则排列构成了这些肌肉组织学中的横纹)。Titin对调控骨骼肌收缩具有重要作用,Titin-Ab在MG中发病机制可能是通过表位扩展与胞内抗原反应,从而对骨骼肌收缩产生影响。RyR是骨骼肌细胞肌浆网上的Ca2+通道,通过调控Ca2+释放从而参与骨骼肌兴奋-收缩耦联反应,在骨骼肌细胞膜去极化时Ca2+通道开放,大量Ca2+进入细胞质,引起骨骼肌收缩[18]。它们与AChR抗体共同存在于伴有胸腺瘤和晚发性疾病的MG患者中,与副肿瘤神经综合征中的神经自身抗体类似,不发挥直接的致病作用,因为它们的抗原靶点是细胞内的蛋白,但可以作为潜在肿瘤的生物标志物相关。
5. 集聚蛋白抗体(Agrin-Ab):集聚蛋白是由运动神经末梢合成分泌的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)。集聚蛋白可与骨骼肌纤维膜上的LRP4、层粘连蛋白等结合,调节NMJ的形成、功能维持以及再生[19]。集聚蛋白与LRP4结合为NMJ中信号传导通路中的重要环节,同时集聚蛋白还具有促进MuSK和LRP4间相互作用的功能。研究证实,Agrin-Ab是一种新型的MG致病性抗体,Agrin-Ab可抑制集聚蛋白与LRP4结合,从而抑制NMJ信号传递功能,导致MG发生[20]。此外,在三血清阴性的MG患者中,血清学上也检测到了Agrin-Ab。
由于在世界范围内仅发现了少数Agrin-Ab阳性的病例,因此Agrin-MG患者的临床和人口统计学特征尚未被报道。近期,我国在一项研究中通过构建表达人全长agrin蛋白的质粒,建立一个荧光细胞染色方法(cell-based assays,CBA法)来进行检测Agrin-Ab,并采用该方法检测了1948例MG患者的血清样本,并探讨了中国Agrin-MG的临床特点。其为中国MG人群中Agrin-Ab的流行率提供了重要的数据,并为此类病例的治疗提供了有价值的临床指导。
6.其他自身抗体:除上述论述的MG自身抗体外,部分MG患者体内还存在着其他的相关自身抗体,如ColQ-Ab、kv1.4抗体(kv1.4-Ab)及皮质蛋白抗体(Cortactin-Ab)等。如ColQ-Ab作用机制研究较少,ColQ-Ab对ColQ-AchE复合物具有破坏作用,可降低NMJ上ColQ-AchE数量,减少NMJ间隙AchE浓度[21]。而ColQ功能异常可降低对Ach的分解作用,延长Ach活性时间,增加终板电流时间,增强离子内流,从而导致神经肌肉传导受损[22]。敲除ColQ的小鼠不再分泌AchE,NMJ间隙的AchE浓度显著增加,其骨骼肌细胞膜上MuSk和AchR复合体也明显减少,而补充ColQ后,即可部分恢复集聚蛋白介导的AchR复合体[23]。Cortactin是骨骼肌细胞内一种微丝肌动蛋白结合蛋白,在NMJ中具有调控肌动蛋白的合成的作用,目前研究认为Agrin/MuSK信号可调控酪氨酸激酶作用于Cortactin,从而激活Agrin在NMJ的聚集和AchR的簇集[24]。这些抗体通过各种方式调控及相关物质进而导致MG的发生,也将成为对于特质性疾病MG新的研究方向。
二、MG血清抗体实验室检测技术
目前,临床对于MG患者血清中相关自身抗体的检测方法也成为了研究的重点。由于MG患者AChR-Ab阳性率较高,所以目前AChR-Ab的检测依旧是诊断MG的首选血清学检查。传统的AchR抗体的检测诊断方法是放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)、ELISA等,近几年来,通过检测技术的不断发展,出现了CBA等。
1. 放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay,RIPA):RIPA是目前检测AchR抗体准确性最高和临床最常用血清学诊断方法。多年来,RIPA有着非常高的特异性和敏感性,在全身性MG中阳性率约为85%,在眼部MG中阳性率约为50%,在青春期前儿童(50%-70%),而在MG并发胸腺瘤患者中阳性率接近100%,已成为MG诊断的金标准。RIPA采用放射性标记的AChR混合物和MG患者血中的抗AChR-Ab结合,再在体系中加入抗人的IgG与待测抗AChR-Ab让其产生竞争性结合,最后检测放射标记物检测出MG患者中AChR-Ab的浓度,这种方法与ELISA相比灵敏度有极大提高。RIPA虽然会使大约10%的MG患者AChR-Ab误检为阴性,但基本上可检出约80%的全身型MG患者[25]。其误差产生原因是RIPA所使用的AChR抗原中虽然含有多种亚基,但上述亚基处于游离状态,始终无法与神经-骨骼肌终板膜上的AChR簇集,从而导致一些MG患者采用RIPA无法检出低亲和力的AChR抗体而漏诊。该方法除了定性,也可用于定量检测,通过对抗体滴度的测定来监测个别患者病程进展。RIPA以商业试剂盒的形式提供,并被广泛应用于临床化学实验室。此方法主要缺点是具有放射性,它意味着放射性废物处理的问题复杂、对于使用者的健康是有风险的,也受到试剂时间的限制,这些问题也都将是未来我们将要改进和取代的。
2. ELISA:ELISA为实验室中最常用的蛋白检测方法之一,其检测模式主要有直接法、间接法和夹心法3种。ELISA的原理是通过抗原与抗体的特异性结合而对目标抗体进行检测,有操作简便,灵敏度高的优点。目前的临床应用中,ELISA可以实现全程操作自动化,免去了因人为因素所带来的误差影响,因此在MG抗体检测中得到了广泛的应用。但目前该法易受到多种因素的影响:(1)代谢产物:抗原抗体交叉反应是常见的干扰因素之一,导致生物利用度异常;(2)抗体的产生:在蛋白需要定量检测时会导致实验结果出现误差;(3)基质特异性:蛋白在常温条件下的反应性通常会发生变化或蛋白水解,从而影响定量检测结果。因该法存在上述因素导致结果可靠性差。考虑到它们技术再现性、不使用放射性试剂、自动化和成本等方面的优势,Hewers及其同事开发了一种固相竞争ELISA,显示出高灵敏度和良好的特异性,并与RIPA有良好的一致性。许多实验室在目前的诊断中仍在使用ELISA,但与放射免疫沉淀法的特异性及敏感性相比较来说,后者更为准确。
3. 荧光细胞染色方法(cell-based assays,CBA):CBA是解决RIPA无法检出低亲和力AChR-Ab最佳解决方案。CBA检测原理在于通过互补cDNA转染HEK细胞,进而稳定调高AChR。CBA的特点是在细胞膜内外能够检测出那些能与AChR相结合的抗体,因此,当MG患者血清抗体阴性时,CBA能够明显调高抗体阳性检出率。但CBA的缺点在于实验基础要求为活细胞,并且需要专业的组织培养相关设备,除了成本高消耗时间长外,对检查者的要求也较高,从而限制了该方法在临床实验诊断中的应用。
因此,一些研究小组已经成功地生成了稳定表达AChR单一亚基的细胞系,用于检测患者体内的抗AChR-Ab,但由于在单个病毒载体中所能够表达几个亚基和聚类蛋白的限制,目前还没有关于表达聚类AChR的稳定细胞系的报道。因此Cai等人提出了一个稳定的人胚胎肾293T(HEK 293T)细胞系(KL525)表达聚集AChR-Ab的研究。在此研究中KL525稳定细胞系检测抗AChR-Ab的阳性结果为80.6%,敏感性比RIPA的51.4%高出29.1%,所有健康个体测试KL525 CBA和RIPA都为阴性,反映此种方式对于低亲和力AChR-Ab敏感性更高[26]。此方法瞬间转染,减少了重复瞬时转染而导致的批间偏差,从而提高了检测结果的一致性。此外,稳定细胞系使CBA嵌入微流体芯片成为一种可行的解决方案,为临床提供了节约时间和成本的CBA, 并在临床应用方面具有更多的优势,也将成为未来的研究重点。
4. 时间分辨荧光免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA):MG患者自身抗体除了可采用放射免疫沉淀法检测外,还可采用TRFIA法检测。TRFIA法是使用En3+-a-CTx标记抗原,具有更高的稳定性,可有效克服检测中易出现的反应酶不稳定性高和RIPA放射性污染的问题,但是,该方法对实验设备要求较严格,成为该法在临床中的推广使用的一大阻碍。
三、总结与展望
MG临床发病率较低,其发病机制较为复杂,对于自身抗体的血清学检测是MG诊断的核心之一。近年来先进的分子技术在MG检测和治疗方面发展迅速,截止至2022年国内外共发现十几种与MG自身抗体及患病息息相关的自身抗体,这些自身抗体的发现对于MG患者的个性化治疗将是非常有益的,应该是未来关注的重点。MG患者的临床表现和对治疗的反应取决于检测到的自身抗体的类型。我们发现,血清中不同的自身抗体通过不同的检测方法(RIPAs、ELISAs、活CBAs、固定CBAs等)和抗原底物有可能会呈现出不同的致病性、敏感性和特异性。目前较为常用的方法仍然为ELISA和RIPA。CBA法的灵敏度虽然明显高于RIPA和ELISA,但CBA受到瞬时转染法的影响,缺乏可用的商业试剂盒,无法在临床推广使用。TRFIA法相较于RIPA法的优势在于可以检出低亲和力的AChR抗体,但因其实验设备要求过高而无法普遍应用于临床。因此,对已知自身抗体进行更敏感的检测,多种方法、多指标联合检测的策略,以及发现和验证新的自身抗体是必要的,改良并设计灵敏度高、特异性强、适用性广的检测方法或将成为未来研究的重点。
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