特发性炎性肌病相关间质性肺疾病生物标志物与实验室检测方法
刘敏，教授、博士后合作导师。现任中山大学附属第一医院医学检验科主任。主要从事临床医学检验、教学和科研及临床实验室管理等方面的工作, 尤其是在感染、肿瘤标志物、自身免疫及产前筛查等方面有丰富的经验。担任广东省医师协会检验分会、 医院协会临床实验室管理专委会、精准医学应用学会精准检测分会、生物工程学会临床实验室分会、预防医学微生物及免疫分会、医疗行业协会检验分会、健康管理学会检验分会副主任委员，中国女医师协会检验分会副主任委员，广东省女医师协会检验分会主任委员。承担或参与国家自然科学基金项目、863子课题项目、广东省科技厅项目及广州市协同创新重大专项基金等多项课题。发表SCI及中文核心期刊等论文数十篇，其中2020年以第一作者在BMJ上发表文章一篇。参与的项目《新型冠状病毒肺炎综合防控诊治体系》获广东省科技进步一等奖。
李柳冰，中山大学附属第一医院医学检验科在站博士后，北京协和医学院北京协和医院临床检验诊断学博士，师从李永哲教授。美国国立卫生研究院联合培养博士。主要研究方向为自身免疫性疾病诊断标志物、遗传风险因素和发病机制。主持中国博士后科学基金等基金项目3项，参与国家自然科学基金项目4项，获发明专利4项。以第一作者/共同第一作者发表SCI文章16篇（总IF 130.531）。
特发性炎性肌病（Idiopathic inflammatory myopathies，IIM）是一组以对称性近端肌肉无力伴肌肉炎症和肌外表现的自身免疫性疾病，主要包括皮肌炎（dermatomyositis，DM）、免疫介导的坏死性肌病（immune-mediated necrotising myopathy，IMNM）、散发性包涵体肌炎（sporadic inclusion-body myositis，sIBM）、重叠性肌炎（overlap myositis，OM）和多发性肌炎（polymyositis，PM）五种临床亚型。IIM的肌外表现以间质性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）最为常见，发生率可高达75%，并可增加IIM患者死亡风险[1, 2]。早期发现和治疗IIM相关ILD（IIM-ILD）对于延缓疾病进展和改善患者预后具有重要意义[3, 4]。IIM自身抗体包括肌炎特异性自身抗体（myositis-specific autoantibodies，MSAs）和肌炎相关性自身抗体（myositis-associated autoantibodies，MAAs），以及其他血清生物标志物在预测和评估IIM-ILD进展风险方面发挥着重要作用[5]。本文就IIM-ILD相关血清生物标志物作一概述。
一、IIM-ILD相关血清生物标志物
1. 抗合成酶抗体：抗合成酶（aminoacyl-transfer RNA synthetase，ARS）抗体是以胞浆氨基酰tRNA合成酶为靶抗原，主要包括抗Jo-1、抗PL7、抗PL12、抗EJ、抗OJ、抗KS、抗Zo和抗Ha自身抗体[6]。抗ARS自身抗体与IIM、ILD、发热、技工手、多关节炎和雷诺现象临床症状的出现密切相关，称为抗合成酶综合征（anti-synthetase syndrome，ASS）。随访225例抗JO-1自身抗体阳性患者，发现在随访结束时，ILD发生率可高达84%，而在随访基线时，ILD发生率约为50%[7]。与抗JO-1自身抗体相比，其他抗ARS自身抗体的患者更常伴发ILD，抗KS和抗OJ自身抗体阳性患者在初始诊断和后续随访中仅有ILD而无肌炎的其他症状[8]。在IIM患者中，抗ARS自身抗体阳性患者合并ILD通常表现为慢性进行性肺功能障碍，对糖皮质激素治疗的反应更好，预后也更好。
2. 抗黑色素瘤分化相关蛋白5抗体：抗黑色素瘤分化相关蛋白5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5）抗体在亚洲国家皮肌炎患者中的流行率远远高于美国和欧洲国家[6]，与快速进展性ILD紧密相关，46%的抗MDA5自身抗体阳性患者在发病6个月内死于呼吸衰竭[9]，是IIM预后不良的重要标记物[10]。抗MDA5自身抗体阳性患者伴发皮肤溃疡可增加发生ILD的风险[11]。在抗MDA5自身抗体阳性的皮肌炎患者中，与抗体效价较低的患者相比，效价高的患者对治疗的反应更差，死亡率更高[12]。因此，抗MDA5自身抗体的水平是与IIM-ILD病程相关的，该自身抗体不仅可用于诊断，还可用于监测疾病活动[13]。
3. 抗Ro52抗体：抗Ro52抗体是一种IM相关性自身抗体。美国一项研究指出，在幼年型IIM患者中，抗Ro52自身抗体与抗ARS、抗MDA5自身抗体的存在相关，这些抗体同时出现增加了ILD和不良预后的可能性，抗Ro52自身抗体阳性患者常表现为慢性病程，病情得以缓解亦较少见[14]。我国对1979例抗Ro52自身抗体阳性的结缔组织病患者进行分析，发现IIM是最常见的疾病类型，ILD的发生与抗Ro52自身抗体相关，且在不同结缔组织病中，ILD的发病率差异较大，抗Ro52自身抗体阳性而不是抗Ro60自身抗体阳性，更可能提示ILD的发生[15]。
4. 抗PM-Scl抗体：抗PM-Scl抗体是以核仁PM/Scl大分子复合体的几种蛋白质为靶抗原的异质性自身抗体，根据分子量大小，主要分为抗PM/Scl-75和抗PM/Scl-100两种自身抗体。抗PM-Scl自身抗体是一种IIM相关性自身抗体，常见于IIM-系统性硬化症重叠综合征患者中。在抗PM-Scl自身抗体阳性的IIM患者中，ILD是主要突出的临床并发症，尤其是合并抗Ro-52自身抗体的患者，且部分抗PM-Scl自身抗体阳性的IIM患者可单独合并ILD，无肺外表现[16, 17]。大多数抗PM-Scl自身抗体阳性的IIM患者对免疫治疗反应良好，但也有一些患者容易复发。
5. 抗Ku抗体：抗Ku抗体的靶抗原是与双链DNA结合的70-80kDa蛋白，通过非同源末端链接途径参与双链DNA修复，与DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）结合，调节核蛋白的磷酸化。除了可见于IIM患者中，亦常见于系统性红斑狼疮、系统性硬化症、类风湿关节炎等结缔组织病患者中。研究表明，抗Ku自身抗体阳性IIM患者在基线时，有19%合并ILD，最终有56%发展为ILD[18]。IIM患者中，抗Ku自身抗体阳性患者是以远端无力、ILD高风险、罕见皮疹和无钙质沉着为主要特征。
6. 涎液化糖链抗原：涎液化糖链抗原-6（Krebs Von den Lungen-6，KL-6）是一种粘蛋白样高分子量糖蛋白，在Ⅱ型肺泡上皮细胞膜和细支气管上皮细胞膜上表达，细胞损伤和/或再生后会升高[19]。现有研究表明，在IIM中，合并ILD患者的KL-6浓度显著高于不合并ILD患者，且KL-6水平升高与IIM-ILD的复发相关，是IIM肺纤维化和疾病严重程度的重要生物标志物，对预测ILD发展具有重要价值[20, 21]。我国一项研究招募了1084名受试者，包括373例ILD、584例非ILD肺疾病患者和127名健康个体，检测KL-6指标，结果指出，在中国患者中KL-6以500U/mL作为诊断cut-off值时，对ILD的敏感性和特异性分别为77.75%和94.51%[22]。
7. 表面活性蛋白：表面活性蛋白A（surfactant protein A，SP-A）和表面活性蛋白D（surfactant protein D，SP-D）属于C型凝集素超家族的集合蛋白亚群，主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞和Clara细胞产生，具有高活性，以多聚体形式存在。研究指出，与健康对照相比，ILD组SP-A和SP-D水平均显著升高[23]，SP-D（77%）对ILD的灵敏度高于SP-A（33%），而SP-A（100%）对ILD的特异性高于SP-D（83%）[24]。血清SP-A、SP-D与肺损伤程度和疾病临床过程密切相关，由于单个指标使用诊断价值有限，在临床上应联合其他血清学指标或影像学检查以提高对ILD的诊断价值。
二、实验室检测方法
目前用于IIM-ILD相关自身抗体检测的方法包括免疫沉淀法（immunoprecipitation，IP）、酶联免疫分析法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、线性印迹免疫分析法（line immunoassay，LIA）和斑点印迹免疫分析法（dot immunoassay，DIA）等。IP法作为检测IIM自身抗体的金标准，具有很好的参考价值。但IP法的操作程序复杂且耗时，需要使用放射性同位素，对操作人员有一定的风险，故IP法的实际使用范围较少。临床上较常用ELISA法和LIA法检测IIM自身抗体。ELISA法能在短时间内同时处理大量样本，且能提供抗体定量的结果，能有效监测疾病活动。LIA的一大优势是一个样本可以同时检测多个自身抗体，由于IIM存在丰富的自身抗体种类，故LIA法在检测IIM自身抗体时十分方便。但LIA主要是一种非定量分析，虽然条带的强度与抗体滴度相关，但在结果呈现时价值不大，且LIA法和IP法之间的一致性比ELISA法和IP法之间的一致性要低[58]。
我课题组比对了ELISA法和LIA法检测抗MDA5和抗TIF1γ自身抗体的一致性。结果发现，两种方法检测结果的一致性一般[25]。此外，LIA法对抗Ku自身抗体的测定具有高假阳性率，只有23%的LIA法阳性样本被ELISA法确认为阳性[18]。重要的是，通过ELISA验证的大多数（65%）样品的LIA cut-off值超过150，而不是厂家所定义的超过15。因此LIA法测定每种IIM自身抗体的cut-off值应分别定义，以提高其性能。此外，采用LIA法检测IIM自身抗体，还需充分评估该方法在操作实验室中的敏感性和特异性，避免周围环境因素对实验结果所造成的不良影响，尽最大可能保证结果的准确性。
三、结语
总而言之，人们对IIM-ILD的认识在近几十年中取得了巨大的进步，但目前对IIM-ILD的诊断和治疗监测仍然是一个挑战。已有的IIM-ILD血清生物标志物的敏感性和特异性有限，在临床实践中可联合使用这些生物标志物，以提高其临床价值。此外，开发早期诊断和评估预后的IIM-ILD血清生物标志物仍是未来工作的重点之一。
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