强直性脊柱炎实验室诊断指标与检测技术临床应用评价

黄清水，医学博士、主任医师、教授、硕士研究生导师。现任南昌大学第一附属医院检验科副主任，检验教研室副主任。现任中国医师协会风湿免疫科医师分会自身免疫病实验诊断技术专家委员会委员，中国医师协会检验医师分会自身免疫性疾病检验医学专业委员会委员，中国研究型医院学会检验医学专业委员会委员，中国合格评定国家认可委员会医学实验室认可评审员等。主要从事临床检验、教学、科研及实验室管理工作，主持国家自然科学基金1项、江西省自然科学基金2项及厅级课题10余项，主编或参编专著7部，以第一作者及通讯作者在国内外期刊发表学术论文20余篇。

李佳，南昌大学第一附属医院临床检验诊断学硕士研究生在读。

【摘要】强直性脊柱炎（AS）是一种慢性炎症性风湿类疾病，其特征是以骶髂关节和脊柱附着点炎症为主要症状，并进展为关节骨化和强直。临床诊断主要依靠临床症状和影像学检查。早期诊断及治疗可有效改善预后，提高患者生活质量。HLA-B27是该病实验室诊断的主要指标，缺乏其他血清学指标，近年来随着研究的进展，多种细胞因子及自身抗体用于AS的诊断及病情评估。本文就AS实验诊断技术临床应用作一阐述。

【关键词】强直性脊柱炎；生物制剂；抗药物抗体；HLA-B27；细胞因子；自身抗体

强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS），是一种慢性、进行性、炎性风湿性疾病，主要累及轴向骨骼、大外周关节和肌腱鞘。其病理特征表现为软骨下组织呈肉芽肿状，浆细胞、淋巴细胞、肥大细胞、巨噬细胞和软骨细胞浸润，使受影响关节表现为不规则的糜烂和硬化，组织逐渐被纤维软骨所取代逐渐骨化[1]。骶髂关节受累（骶髂炎）是其标志，关节表现主要为骶髂关节炎和脊柱强直。部分患者存在外周少关节炎，而关节外表现包括葡萄膜炎、肠道炎症和指趾炎[2-4]。其发病机制不明，炎症组织学、血清IgA和急性期反应物水平升高以及HLA-B27与AS之间的密切关系提示了免疫介导的机制。还没有单一的致病因子或事件被确定为该病的病因，但AS、类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）和炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）之间的相互关系表明肠道细菌可能起了一定作用[5]。AS全球患病率在0.1%至1.4%之间，我国约为0.3%[6]。晚期AS患者骨化融合通常上升到脊柱，形成“竹节样脊柱”，导致脊柱活动性受损、日常活动减少以及生活质量严重下降[7]。因此AS的早期诊断及治疗对减少致残影响有极大价值，本文就AS的实验室诊断技术的临床应用作一概述。

一、AS的诊断标准及治疗

1. 诊断：强直性脊柱炎的诊断近年来多用1984年修订的AS纽约标准[8]，或1966年AS纽约标准[9]，然而它们对早期患者的诊断缺乏敏感性。因此对一些暂时不符合上述标准者，可参考有关脊柱关节病（SpA）的诊断标准，主要包括欧洲脊柱关节病研究组（ESSG）（见表1）[10]和2009年ASAS推荐的中轴型SpA的分类标准（见表2）[11]，据报道，ESSG其敏感性和特异性通常超过85%[12]。ASAS则首次采用了实验室指标HLA-B27及CRP作为诊断标准，全套ASAS标准对中轴型SpA的敏感性为82.9%，特异性为84.4%[13]。我国2001年举办的“全国强直性脊柱炎研讨会”会上制定了AS诊断标准[14]。

表1. 2009年ASAS推荐的中轴型SpA的分类标准

表2. 2001年我国“全国强直性脊柱炎研讨会”制定AS诊断标准：

2. 治疗：目前，对于AS患者主要是对症治疗，包括非甾体抗炎药与物理治疗相结合[15]，非甾体抗炎药不能改变疾病的进程或防止结构进行性损伤。对于非甾体抗炎药难治的症状，采用包括皮质类固醇和各种DMARDs在内的二线治疗，但疗效有限[16]。生物制剂（主要包括TNF-α抑制剂及IL-17抑制剂）已批准用于放疗性axSpA的治疗。中高水平的证据表明，这些药物能有效抑制疾病活动度和改善患者生活质量，并在短期内达到强直性脊柱炎的部分缓解[17]。

（1）TNF-α抑制剂：目前有三种主要靶向TNF-α的生物制剂：英夫利昔单抗（Remicade）是一种嵌合的（小鼠/人）IgG1κ同型单克隆抗体，对TNF-α具有高亲和力；依那西普（Enbrel）是一种受体融合蛋白，与TNF-α结合，从而竞争性地抑制TNF-α与细胞表面的结合；阿达木单抗（Humira）是一种重组人IgG1单克隆抗体，专门针对人TNF-α[18]。这三种药物可以抑制TNF-α促进炎症，从而减轻强直性脊柱炎患者的疼痛、压痛和关节肿胀。

（2）IL-17抑制剂：苏金单抗（secukinumab）是一种完全重组的人免疫球蛋白G（IgG）1 kappa单克隆抗体（mAb），可直接抑制IL-17A。它是第一个批准用于治疗强直性脊柱炎患者的IL-17抑制剂[19]，其已证明对放射学AS（对TNF-α抑制剂（TNFi）无充分反应者或先前对TNFi无充分反应者）[20]患者有效。与苏金单抗一样，伊西贝单抗（Ixekizumab）是一种选择性靶向IL-17A的高亲和力单克隆抗体，已批准用于治疗银屑病和银屑病性关节炎[21]。如果获得批准，伊西贝单抗将为治疗TNFi失败或不耐受患者的放射axSpA提供另一种选择。

3. 抗药物抗体（ADA）：生物制剂在炎症性疾病的治疗中发挥重大作用，它可以由蛋白质、核酸或物质的复杂组合组成，也可以是细胞和组织等生物实体组成。生物疗法可以被人体免疫系统识别为“非自我”，并诱导免疫反应。治疗性内源性蛋白，具有与人类相同的氨基酸序列，由于糖基化或构象变化，可产生免疫原性，从而暴露出新的表位。治疗性抗体具有独特的互补决定区域，包含经常识别为外来的序列，并诱导形成抗药物抗体（ADAs）。分子结构、甲氨蝶呤或其他免疫抑制/抗增殖剂的伴随使用、所应用的生物/生物仿制药的剂量和方案、既往生物制剂的ADAb发展史以及患者的性别、种族和共病等因素可能会影响药物的免疫原性[22]。很大一部分患者对初始治疗（原发性失败）无反应或反应不足，随着时间的推移失去反应（继发性失败）或发生潜在的治疗限制性不良事件（AE）。抗药物抗体（ADA）的存在为治疗失败的重要因素，并且接受生物治疗的患者的AE风险增加。根据研究数据，INF和INF生物仿制药的患者发展为ADA[23]。因此，在慢性免疫介导的炎症性疾病患者中选择治疗、剂量和给药方案以及使用背景免疫抑制/抗增殖剂时，生物制剂/生物仿制药的免疫原性是安全性考虑。

二、AS实验诊断技术

用于辅助诊断AS的实验室指标有限，中欧和北美的AS白人患者中，90-95%存在HLA-B27基因[24]，而50-70%的活动性疾病患者会出现C反应蛋白（CRP）水平升高和红细胞沉降率（ESR）升高[25]，对于评价AS活动性有一定的价值。疾病活动性的临床体征（疼痛、僵硬和睡眠障碍）与CRP和ESR之间缺乏相关性[26]。在疾病活动期可检出轻度的正常染色细胞性贫血和碱性磷酸酶水平升高。这与其他自身免疫性疾病一样，细胞因子及自身抗体同样在AS的发病中发挥作用，下面介绍HLA-B27及一些可能参与AS的细胞因子与自身抗体。

1. HLA-B27：AS的遗传能力受到主要组织相容性复合体（MHC）区域变异影响，这约占该疾病发展的总遗传风险的40-50%，特别是HLA-B27阳性，它约占该病总遗传率的30%[27]。HLA-B27是MHC I类分子，由第6号染色体上的MHC区编码的α链和非MHC编码的β链b2微球蛋白组成，具有高度的遗传多态性，有多达105种已知亚型，称为HLA-B*27:01至HLA-B*27:106（HLA-B*27:22亚型被撤销），由132个等位基因编码。与强直性脊柱炎相关的最常见亚型是HLA-B*27:05（白种人）、HLA-B*27:04（中国人）和HLA-B*27:02（地中海人）[28]。研究表明中国患者中至少出现四种亚型。其中B27:04最常见，在HLA-B27阳性强直性脊柱炎患者和健康对照中分别占54.8%和50.85%[29]。然而，两种亚型HLA-B*27:06和HLA-B*27:09似乎与该疾病没有任何关联[30]。据研究，HLA-B27可能通过“致关节炎肽”加工和呈递、HLA-B27重链错误折叠及增强细胞内微生物存活等机制在AS的发病中发挥作用[31]，因此，HLA-B27为AS的重要检测指标。

2. 实验室检测方法：强直性脊柱炎目前实验室检测技术一般有微量淋巴细胞毒试验、酶联免疫吸附试验、磁珠酶联免疫分析法、流式细胞仪分析法、聚合酶链反应-序列特异性引物法、聚合酶链反应-序列特异性引物法、实时荧光PCR法等检测方法。

（1）微量淋巴细胞毒试验（MLCT Assay）：HLA-B27抗原与细胞毒抗体结合后，激活补体对细胞膜破坏。若受试者白细胞（淋巴细胞）表面未表达相应HLA-B27抗原，则无作用。可以以染色法观察因破膜而致死的细胞，染料能着色因死亡而通透性改变的细胞，而不能着色细胞膜完整的活细胞。根据死亡细胞所占百分比，可以检测其白细胞表面是否存在HLA-B27抗原及与抗体的反应强度[32]。本法是较早建立的检测方法，该方法简单、检测量大、仪器设备要求不高，适合于基层单位开展。其缺点是需新鲜细胞，干扰因素相对较多，对试验的解释需要一些排除交叉反应引起的假阳性。

（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）：将与HLA-B27交叉反应的抗HLA-B27 MAB（克隆KS4，亚类IgG2a）与微量滴定板的孔结合，制成固相抗体，将待测试的血清或血浆添加到孔中，洗涤后，加入过氧化物酶标记的兔抗fl2微球蛋白缀合物，其与捕获的抗原结合。除去未结合的缀合物后，用常规ELISA读数器通过色原邻苯二胺观察反应。其操作简便，重复性好。但不能测定细胞上HLA-B27的表面表达，只能测定血清中HLA-B27的浓度[33]。

（3）磁珠酶联免疫分析法（IMS-ELISA）：利用HLA-B27抗体包被的磁珠来分离出全血中带有HLA-B27抗原的白细胞，同时以CD45-HRP结合体来标记全血中的白细胞，然后经TMB显色而测定其结果。优点：操作简便，反应时间短，对标本新鲜度要求低，需要样本量少，结果客观。缺点：不适合大批量操作。

（4）流式细胞仪分析法（FCM）：细胞表面的B27抗原与试剂盒中荧光标记的HLA-B27单克隆抗体相结合，通过荧光标记技术区分淋巴细胞亚群，比较淋巴细胞中HLA-B27抗原的荧光强度和仪器设定的界值来判断HLA-B27阴阳性。优点：操作简单、灵敏度高、特异性强、重复性好、结果稳定；缺点：需要新鲜血样，这与其他HLA-B抗原的交叉反应性较强，以及不能区分HLA-B27等位基因变体[34]。

（5）聚合酶链反应-序列特异性引物法（SSP- PCR）：通过选择性扩增HLA-B27基因的第三外显子中与B*2701至B*2705（包括）共有的区域来确定HLA-B27存在与否[35]。该方法最大的优势为它可以在分子生物学基础上对HLA-B27基因进行定性分型。缺点：PCR-SSP检测的是HLA-B27的基因型，携带B27基因并不等于细胞表面一定有HLA-B27抗原的表达。

（6）实时荧光PCR法（qPCR）：在PCR反应液加入与双链DNA特异性结合的荧光染料，检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量。优点：直接检测HLA-B27抗原的编码基因，不会与HLA-B27产生交叉反应，结果判断准确。缺点：操作要求高，需专业的实验室及人员。

3. 细胞因子：细胞因子是低分子量（≈6-70 kDa）的可溶性蛋白质，由多种细胞（淋巴细胞，巨噬细胞，自然杀伤（NK）细胞，肥大细胞和基质细胞）分泌。它们参与免疫反应，并作为与免疫系统通信网络相关的重要介质。促炎细胞因子诱导急性期反应，以保护宿主免受刺激，损伤和感染，然而过度的促炎反应可能导致慢性炎症。与其他关节炎一样，AS滑膜中的炎性浸润由巨噬细胞、T细胞和B细胞组成，它们分泌多种促炎和调节性细胞因子。通过比较分析发现，调节性或免疫抑制性细胞因子与促炎性细胞因子的比例明显高于其他关节炎，如类风湿关节炎[36]。各种细胞因子阻断疗法的临床疗效同样表明，AS患者的脊柱炎症至少部分是由细胞因子驱动的，其可能在AS的早期诊断及治疗中发挥一定作用。

（1）血管内皮细胞生长因子（VEGF）：成骨过程代表AS患者韧带骨赘形成的形态学基础，与血管生成过程密切相关。VEGF是一种内皮细胞生成因子，是血管生成和成骨的有效连接的必需因子[37]。研究表明，与健康对照组相比，AS中的VEGF水平升高[38]。大量证据表明，VEGF在软骨内骨化过程中起着关键作用，这可能与AS的强直过程有关[39]。因此，VEGF可能是AS中炎症和新骨形成的独特生物标志物。

（2）TNF-α：TNF-α是一种主要由巨噬细胞产生的细胞因子，参与免疫细胞的调节，其功能主要是促炎，但也在凋亡、恶病质和肿瘤发生中发挥作用[40]。人类骶髂关节标本活检证明了早期骶髂关节炎患者体内含有丰富的TNF-α[41]。人类TNF-α转基因（Tg-197）过度表达的鼠模型提供了具有骶髂关节炎、外周关节炎、全身性炎症和体重减轻的表型[42]。而TNF-α抑制剂被证明可抑制AS的疾病进程[43]，故TNF-α是AS诊断与治疗中一项具有价值的生物标志物。

（3）IL-17：AS患者中的IL-17主要来源于来自先天免疫系统的细胞，其对防御细胞外细菌具有重要的生理意义，但失调的表达与关节内各种细胞的激活和促炎细胞因子的表达有关，可导致滑膜炎、软骨退化和破骨细胞生成[44]。IL-17通过诱导人类间充质干细胞分化为成骨细胞来防止全身性骨丢失[45]，抑制脂肪生成并促进成骨细胞分化。对强直性脊柱炎患者小关节的组织学研究表明，强直性脊柱炎患者软骨下骨髓中分泌IL-17的细胞的频率明显高于骨关节炎患者[46]，表明IL-17参与AS发病机制。

（4）IL-23：IL-23由巨噬细胞和树突细胞产生，连接先天免疫和适应性免疫[47]。IL-23可以激活、扩增和维持以IL-17表达为特征的T辅助（Th）细胞的独特表型，它还可以诱导免疫调节细胞因子IL-22[48]。IL-23p19亚单位的中和作用导致疾病活动性降低，并下调参与骨侵蚀的介质和基因，包括IL-6、IL-1b、基质金属蛋白酶和RANKL[49]。这种新的SpA动物模型也出现了骶髂关节炎、脊椎炎和主动脉根部炎症[50]。有研究表明AS患者血清中IL-23水平升高[51]。最近也证明了IL-23R基因可能与AS的遗传易感性有关[52]。所有这些发现表明，IL-23也可能在AS的发病机制中发挥重要作用。

（5）IFN-γ：干扰素-γ是一种重要的细胞因子，主要由自然杀伤细胞和CD80+ T细胞分泌[53]。作为一种免疫调节因子，IFN-γ在巨噬细胞的活化中起着重要作用，据报道，IFN-γ的异常表达与多种自身炎症和免疫性疾病有关，如慢性牙周炎、IgA肾病和多发性硬化[54-57]。此外，IFN-γ还能调节人骨髓间充质干细胞（MSC）的成骨，IFN-γ暴露可能会抑制MSC的成骨[58]。所有数据表明，IFN-γ的异常表达可能参与了AS的发病过程。

（6）其他细胞因子：一项荟萃分析的结果提供了IL-1多态性和AS之间关联的证据，且这种关联在人种之间具有差异性[59]。有研究表明AS患者和活动性AS患者分别在PBMC和血清中显示出更高水平的IL-37，更重要的是，IL-37抑制AS患者中PBMC的促炎细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-17、IL-23的表达，表明IL-37在AS中的潜在抗炎作用[60]。据报道，血清IL-6与严重程度指标之间存在正相关关系[61]。有研究发现强直性脊柱炎患者血清中IL-27水平显著升高，与VEGF浓度呈正相关，并与疾病活动度相关[62]。

4. 自身抗体：由于缺乏类风湿因子，AS被认为具有血清阴性特征，因此自身抗体不被认为是AS的标志。然而，越来越多的证据表明B细胞和抗体在强直性脊柱炎中可能发挥作用。利妥昔单抗在降低强直性脊柱炎患者疾病活动性方面的有限疗效表明了抗体在强直性脊柱炎免疫应答维持中的病理作用[63]。研究结果表明，强直性脊柱炎患者血清中存在针对多种抗原靶点的自身抗体。然而，仅在少数AS患者中发现了这些抗体，并且在RA、未分化SpA患者或健康人的血清中也发现了这些抗体，特异性较低，因此限制了其在AS中的诊断应用[64]。因此我们需要对早期AS患者进行更广泛的研究，以探索这些自身抗体标记物在临床实践中的诊断潜力。

（1）抗CD74 IgG抗体：人类CD74，也称为人类组织相容性白细胞抗原（HLA）II类组织相容性抗原γ链或不变链，由296个氨基酸组成[65]。CD74对B细胞分化有影响，抗体与CD74的结合可能导致细胞的激活和促炎细胞因子的产生，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）[66]。De Winter等人[67]的结果表明，与健康对照组相比，AS患者的血清抗CD74 IgG和IgA抗体升高。因此，抗CD74自身抗体可能参与了AS的发病机制。基于抗CD74 IgG的敏感性和特异性，它是支持AS临床诊断的有前途的诊断工具[68]。

（2）SIRT1：SIRT1是一种广泛分布的III类组蛋白脱乙酰酶，参与调节T细胞活化以及免疫耐受和炎症[69]。此外，最近的研究表明SIRT1在调节骨代谢方面具有潜在作用[70]，骨关节炎患者成骨细胞中SIRT1水平降低，这种疾病的特征是骨组织成骨不当，导致TGF-β和硬化素的表达增加，硬化素通过Wnt信号传导调节骨矿化[71]。此外，从SIRT1缺陷小鼠中分离出的MSCs表现出成骨细胞和软骨细胞的分化受损[72]，这是参与AS发病机制的主要细胞。某项研究发现AS患者的血清抗SIRT1抗体水平显着高于RA患者的血清水平[73]，表明抗SIRT1自身抗体可以作为早期诊断AS的标志物。

三、总结与展望

现阶段AS的发病机制仍未清晰，HLA-B27与AS发病呈强相关，但仍有其他遗传学因素影响。诊断则主要依靠临床症状、体征及影像学检查，其他实验室指标在诊断中作用尚不明确。本文总结了一些实验室指标，其可能对AS诊断、病情评估等提供帮助。进一步探索AS特异性抗体或细胞因子，对AS早期诊断、治疗和预后具有重大意义。

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