胰岛素样生长因子1 (IGF-1) 的临床意义与检测技术临床应用价值
赵蓓蓓，广州医科大学金域检验学院临床基因组教研室副主任，广州金域医学检验集团质谱技术主任，临床蛋白组学联合创新实验室执行主任、广州金域临床质谱检测中心主任、广州金域淀粉样变性研究中心主任。广东省五一劳动奖章获得者，广东省科技进步奖一等奖获得者，广州市开发区创新创业骨干人才和紧缺人才。中国营养学会公共营养分会委员，中国医疗器械行业协会临床质谱创新发展分会委员，广东省精准医学应用学会委员。研究方向：临床色谱质谱技术发展与应用研究，临床质谱实验室管理。学术成就：全国首本临床色谱质谱高等学校教材《临床色谱质谱检验技术》副主编，拥有发明专利30余项，以第一作者或通讯作者发表SCI和中文核心学术论文20余篇，参与指南共识8项。
胰岛素样生长因子1（Insulin-Like Growth Factor-1，IGF-1）是一种对细胞的增殖分化和人体的生长发育具有关键作用的调控因子。临床上由生长激素（Growth Hormone，GH）分泌异常导致的肢端肥大症（Acromegaly）、生长激素缺乏型（Growth Hormone Deficiency，GHD）矮小症等疾病的筛查与诊断，以及接受重组人生长激素（Recombinant Human Growth Hormone，rhGH）治疗的患者的用药监测，均需要进行IGF-1的精准定量检测。目前广泛用于检测IGF-1的方法主要包括放射免疫法（Radioimmunoassay，RIA）、免疫放射法（Immunoradiometric Assay，IRMA）、酶联免疫法（Enzyme linked Iimmunosorbent Assay，ELISA）、化学发光法（Chemiluminescence assay，CLIA）等，然而上述免疫学方法易受内源物质的干扰，例如：体内IGF-1主要与IGFBP3结合，因此IGFBP3浓度的变化影响免疫检测结果；同时这些免疫学方法因无法区分野生型和突变型IGF-1，因此较难实现IGF1的精准检测。近年来，色谱质谱技术的发展和蛋白质数据库的逐步完善，液相色谱串联质谱技术（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）日渐成为生物蛋白质组学、生物制药等研究领域的重要检测方法，并已应用于IGF-1的检测，因质谱法与免疫法相比具有灵敏度更高、特异性更强、检测一致性更好、可检测IGF-1序列多态性信息的特色，可以实现IGF1的精准定量检测。本文将就IGF-1的研究历史和临床意义进行简要回顾，并针对IGF-1检测技术的发展和各类检测方法的优势和不足展开具体阐述。
一、IGF-1的研究历史与临床意义
1. IGF-1的研究历史：1957年，Salmon和Daughaday在研究GH的过程中，首次发现GH刺激软骨的生长需要通过血清中的一种“硫酸化因子”进行调节，GH本身并不能直接发挥作用[1]。由于这种因子具有促进DNA和蛋白合成等生物学作用，因此又被称为“生长介素”[2]。1963年，Froesh等发现血清中的某种胰岛素样活性物不能被血清中的胰岛素抗体完全抑制，故将其命名为“不被抑制的胰岛素样活性物”[3]。随着分子生物学技术的不断发展，1978年，Rinderknecht和Humble成功纯化了两种与胰岛素原同源性高达约48%的“不被抑制的胰岛素样活性物”，并分别将其命名为胰岛素样生长因子1和2（IGF-1，IGF-2）[4]。
IGF-1是一种由70个氨基酸组成的单链蛋白，其分子量为7649道尔顿（Dalton，Da）。IGF-1主要由肝脏合成，但人体的肾脏、骨骼肌、脂肪等多种组织器官也能合成并分泌少量的IGF-1。血液循环中的IGF-1大部分与胰岛素样生长因子结合蛋白（IGF-binding proteins，IGFBPs）结合，形成无活性的大分子复合物。研究表明，IGFBPs主要具有以下生物学功能：（1）协助IGF在血管内和跨管壁的运输；（2）将IGF定位到特定的组织或细胞；（3）调整IGF与其受体的结合，进而调控IGF的生物学功能[5]。目前已知的IGFBPs共有6种，其中，IGFBP-3在血清中含量最高，是血液中IGF-1的主要载体，此外，IGFBP-3还可介导GH的合成[6]。血液循环中约95%的IGF-1与IGFBP-3以及“酸不稳定亚单位”（Acid-Labile Subunit，ALS）结合，形成分子量高达150kD的三元复合物，该复合物可阻止IGF-1被转运至胞内[7]，有利于延长IGF-1的血清半衰期并调节其可利用度。此外，约4%的IGF-1与IGFBP-1、2、4和6结合，形成分子量约50kD的二元复合物，约1%游离状态的IGF-1不与任何IGFBP结合，这两种状态下的IGF-1均可透过血管内皮屏障，它与靶细胞膜上的对应受体结合，发挥其生物学功能[8-9]。血清IGF-1的水平受多种因素影响，如年龄、性别、营养状况和生长激素的释放等。其中，生长激素是影响肝脏合成和释放IGF-1的主要因素。人类血清IGF-1水平还具有年龄依赖的特性，其浓度水平在胎儿和新生儿最低，儿童期逐渐增高，青春期达到高峰并随后维持在相对稳定的水平，成年后则逐渐下降[10]。
2. IGF-1的临床意义：IGF-1的生物学效应可归纳为如下几类：（1）促进葡萄糖、蛋白质和脂肪的合成并抑制其分解；（2）刺激RNA和DNA的合成和细胞增殖；（3）作为GH的介导因子促进GH的产生。IGF-1的主要功能是介导GH在外周靶器官和组织的促增殖效应，其促增殖作用是胰岛素的约50倍左右[11]。同时IGF-1负反馈抑制垂体合成及分泌GH。
临床上，最初IGF-1水平检测在临床上主要用于GHD和肢端肥大症的初筛，及上述疾病的治疗检测和疾病管理。多年来，GH激发试验被用于判断垂体GH分泌是否异常和诊断生长激素缺乏症的金标准。然而，GH受下丘脑生长激素释放激素（Growth Hormone Releasing Hormon，GHRH）和生长抑素（Somatostatin）双重调控，呈脉冲式分泌，而且GH激发试验存在实验繁琐、假阳性率高、准确性不佳等不足[12]。血清IGF-1无明显脉冲式分泌及昼夜节律变化，受脑垂体搏动释放、运动、急性营养缺乏、急性血糖波动等环境因素影响也相对较小，可作为反映体内内源性生长激素分泌状况的可靠指标。美国内分泌协会亦在2014年发布的《肢端肥大症：内分泌协会临床实践指南》中明确建议将血清IGF-1作为肢端肥大症的初筛指标[13]，并通过口服葡萄糖负荷试验进行该疾病的确诊。在2015年文献报道IGF-1水平测定通常是评估GH/IGF-1轴的第一步[14]。此外，IGF-1在多种疾病的预测、诊断、治疗监测方面也发挥着重要作用。有研究表明，肥胖人群肿瘤发生风险明显增加，或许与胰岛素和IGF-1的水平调节异常存在关联，IGF-1可能在肥胖与胰腺癌等多种恶性肿瘤中发挥重要介导调节作用[15]，多项流行病学调查分析也显示，IGF-1与肺癌等多种肿瘤相关，血清IGF-1或可成为肿瘤预测的有力指标[16-19]。
二、免疫学方法在IGF-1检测中的应用
IGF-1最早是使用生物测定法或竞争性膜结合测定法进行检测分析，这些方法既费力又非特异性。自1968年免疫学方法被成功应用于生物标记物（Biomarker）的定量检测后，在1977年人们使用特异性放射免疫法测量循环IGF-1，这标志着IGF-1研究领域的一个重要里程碑[20]。科学家们已先后运用放射免疫法（RIA）、酶联免疫法（ELISA）和化学发光法（CLIA）研究IGF-1、IGFBP-3在GHD以及肢端肥大症的诊断和治疗监测中的作用。林刚等人[21]运用放射免疫法对67例GHD患儿和30例健康儿童进行血清IGF-1和IGFBP-3水平的比较研究，结果表明，GHD患儿血清IGF-1和IGFBP-3水平显著低于健康儿童，并指出IGF-1在诊断GHD时具有较好的敏感性、特异性和准确度。李堂等人[22]采用酶联免疫法测定的结果也显示IGF-1和IGFBP-3在GHD诊断和预后预测等方面具有重要潜力。葛青玮等人[23]采用化学发光法进行的矮小症人群研究则证明了IGF-1、IGFBP-3及其比值在生长激素缺乏的矮小症诊断中具有较高的敏感度、特异度和准确度，该结果与侍学琴等人[24]的研究结果基本一致。此外，Paolo[25]和Arosio等人[26]的研究结果都表明，IGF-1可作为诊断肢端肥大症的生物指标。
虽然，免疫学分析方法仍然是临床上检测IGF-1的常用方法，但是该类方法不同厂家试剂盒的抗IGFBP-3干扰能力不同、同一厂家试剂盒的批次间差异较大；高特异性IGF-1抗体不易获得，这使得各种免疫学分析方法的结果差异较大，结果的可靠性受到质疑[27]。Algeciras-Schimnich等人[28]采用德国西门子（SIEMENS）公司的Immulite 2000 IGF-1检测试剂盒在美国6所知名医学实验室中进行为期5年的同一研究人群血清IGF-1水平测定追踪。结果显示，采用该试剂盒测定的血清IGF-1水平随试剂盒批次的变化而变化。2002年，Chestnut等人[29]对5种不同的免疫分析法对I型和II型糖尿病患者体内IGF-1水平的测定结果进行了对比分析。结果表明，放射免疫法测定IGF-1的水平比酶联免疫法和免疫放射法高，后两者检测方法受结合蛋白IGFBP-3的干扰较大。
三、质谱技术在IGF-1检测中的应用
质谱技术因其高特异性、高灵敏度、高准确性、检测范围宽等特点，已被逐渐应用于临床实验室的众多检验项目中，包括内分泌激素检测、新生儿遗传代谢病筛查和治疗药物监测等。质谱检测可以较好地克服免疫方法特异性差，存在交叉污染等不足，实现对目标分析物的精准定量，助力疾病精准诊断和管理[30-31]。2001年，de Kock等[32]建立了一种利用内源性蛋白酶对IGF-1进行酶解并通过LC-MS /MS对IGF-1进行结构鉴定和浓度测定的方法。此后，Krisch等人[33]和Kay等人[34]采用胰蛋白酶水解的方法分别对血清和血浆中的IGF-1水平进行定量测定，其中Kay等人在使用胰蛋白酶前先利用乙腈对样品进行沉淀处理，以达到对IGF-1进行富集的目的。实验结果显示，Krisch等人建立的IGF-1检测方法在校准曲线浓度范围内的相对标准偏差为7%至29%，而Kay等人的方法该值则小于17%。这表明，乙腈沉淀步骤或可增强去除杂蛋白的效果，减少干扰，从而提高检测灵敏度。2011年，Bystrom等人[35]通过对血清样品进行酸醇液液萃取、孵育、低温促沉淀等步骤尽可能地去除样品基质中的大分子蛋白复合物，进一步减少复杂样品基质带来的干扰、降低质谱检测中的背景噪音，提高检测灵敏度。结果表明，通过该优化后的前处理方案，人类血清样本的IGF-1检测下限可达15.6ng/ml。2012年，该团队利用上述方法对IGF-1和IGF-2进行同时检测，并建立了各自年龄和性别的参考范围[36]，该方法后被广泛沿用。2012年，Cox等人在全美五个实验室间通过对130例健康人群和22例肢端肥大症患者样本血清IGF-1水平进行测定，比较分析了IGF-1实验室自建质谱检测的差异，结果显示，质谱法测血清IGF-1的室间变异系数（Coefficient of Variance，CV）为11.1%至16.0%，相比于免疫学分析方法，质谱法检测IGF-1的室间检测差异度大大降低[37]。
另一方面，与众多蛋白类物质一样，IGF-1也存在一定频率的蛋白序列多态性现象，目前已知有二十余种氨基酸序列突变类型，其中V44M、R36Q、R50W、Y60H已被报道该突变可造成IGF-1蛋白全部或部分失去生理功能[38-41]。2014年，Paul等人利用免疫质谱分析方法在9小时内高效地完成了1045个人血浆样本IGF-1水平的准确测定，并在约1%的样品中检测到67位的A＞T替换突变[42]。2015年，Mayo Clinic团队采用静电场轨道阱（Orbitrap）质谱仪对459例患者血清IGF-1水平进行测定，研究结果表明采用质谱法对IGF-1进行检测分析，能更好地分离并鉴别野生型和突变型的IGF-1，而当前市场上主流的IGF-1检测试剂盒则无法实现该鉴别[43]。这主要是因为免疫学分析方法的检测依赖于抗体上抗原结合位点对表位的识别，如果变体区域或化学修饰的残基未被抗体识别，这些突变型IGF-1蛋白将会被错误地识别为野生型蛋白，进而导致检测结果不准确。基于质谱技术的IGF-1检测方法能通过特定质荷比（m/z）值识别野生型和突变型的IGF-1，避免了免疫学分析方法的弊端，为同时检测和定量突变和化学修饰的蛋白提供了一种理想的精准检测方法。
四、展望
IGF-1作为一种对人体生长发育，糖脂代谢，血压调节等生理功能都具有重要作用的调控因子，其水平测定在临床上具有重要的监测价值。目前，临床上常用免疫分析方法测定血清或血浆中IGF-1的含量。但是，这些方法存在易受IGFBP-3等结合蛋白的干扰以及各实验室间检测结果差异较大等不足。随着质谱技术的发展，强特异性、高灵敏度、高通量、可检测蛋白变异体的的LC-MS/MS技术可成功地克服免疫学方法的不足，准确、快速、经济地检测和诊断疾病，可实现IGF-1的精准检测。但精准的检测技术，真正实现辅助临床疾病的精准诊疗，仍需结合临床诊疗，建立区分年龄、性别的，适用于中国人群的参考区间。因此未来，基于质谱技术的IGF1参考范围研究，对实现相关疾病的精准筛查、诊断和药物治疗检测，具有重要意义。
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