基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在检测细菌耐药性中的应用
蔡珍，助理研究员，现任航空总医院检验科科研组组长。研究方向包括：碳青霉烯耐药菌的快速诊断，多粘菌素的快速药敏方法评价，高毒力肺炎克雷伯菌的耐药及毒力机制研究。以第一或通讯作者发表SCI论文4篇，中文核心论文3篇。参与国家科技重大专项子课题1项，参与国家重点研发计划1项，申请院级课题1项。现担任智能检验医学（英文）iLABMED杂志青年编委。
【摘要】近些年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix assisted laser desorption ionization time of fight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）广泛应用于临床微生物的菌种鉴定工作。该方法鉴定准确、操作简单、成本低廉，能在数分钟内快速鉴定菌种。除了菌种鉴定，MALDI-TOF MS在细菌耐药性检测领域也显示出巨大的潜力。本文将概述MALDI-TOF MS技术在检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、β-内酰胺类抗生素耐药菌、碳青霉烯类抗生素耐药菌、多粘菌素耐药菌以及结核分枝杆菌耐药菌中的研究进展，并对其应用前景进行展望。
【关键词】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；抗生素耐药；病原菌
随着抗生素在临床的广泛使用，细菌耐药逐渐成为一个严峻的公共卫生问题。多重耐药菌的出现，如MRSA、β-内酰胺类抗生素耐药菌、碳青霉烯类抗生素耐药菌、多粘菌素耐药菌，不仅威胁着患者的生命安全，还为临床抗感染治疗工作带来巨大挑战。临床医生常因不能尽快获取患者感染菌的药敏结果，无法为患者及时、准确地使用抗生素，最终致使患者病情恶化。因此，快速、准确的药敏结果将指导临床准确用药，并提高患者的生存率[1]。目前，临床检测细菌药敏的方法包括微量稀释肉汤法、E-test、VITEK方法等，然而，这些方法耗时长，需要24-48小时的时间。此外，还有一些基于表型或基因的检测方法，比如Carba NP、PCR等方法，但这些方法操作复杂，成本高，需要接近3-24小时的检测时间。
MALDI-TOF-MS技术在临床被广泛地用来鉴定致病菌，是临床微生物领域的重大突破。这一技术操作简单，成本低廉，速度快，可以用来鉴定多肽、蛋白质、糖、核酸等生物大分子及化合物。MALDI-TOF-MS在鉴定微生物时，首先利用裂解液裂解细菌，将菌体蛋白或小肽从细菌体内释放出，再将蛋白及小肽与基质混合，并通过激光激发细菌裂解蛋白形成蛋白质量指纹图谱，与已构建的菌株信息库进行对比分析，从而实现微生物的快速鉴定。近些年来，已有很多研究发现MALDI-TOF-MS技术在鉴定细菌耐药性方面也有显著优势[1, 2]。本文将综述这一技术在鉴定MRSA、β-内酰胺类抗生素耐药菌、碳青霉烯类抗生素耐药菌以及多粘菌素耐药菌中的进展。
一、MALDI-TOF-MS 在鉴定MRSA中的应用
在2000年，Edwards-Jones及团队通过分析甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）和MRSA在质谱鉴定时的差异峰，发现m/z 891、1,140、1,165、1,229和2,127是MRSA特征峰，m/z 2,548和2,647是MSSA的特征峰[3]。在2014年，Josten等人从220株MRSA菌株中发现了在2,415 m/z有一个特征峰，且与PSM-mec的表达有关[4]。PSM-mec是一种溶于有机溶剂的小肽，在葡萄球菌盒式染色体（Staphylococcal chromosome cassette mec，SCCmec）分型菌株的II，III，和VIII型中表达，它编码基因psm-mec的表达和金黄色葡萄球菌的甲氧西林耐药表型相关。有研究表明，利用这一峰值来鉴定MRSA的特异性、阳性预测值可达100%，但灵敏性为60.2%。因此，该峰值的缺失并不能用以判断菌株为MSSA[4]。
数据分析是MALDI-TOF MS鉴别细菌耐药性的关键步骤，为了提高质谱区分MRSA和MSSA的能力，机器学习技术也被应用到质谱数据分析过程中。2022年，Po-Hsin Kong等人优化了数据分箱方法，利用遗传算法genetic algorithm（GA）和四种机器学习的方法，即支持向量机support vector machine（SVM），决策树decision tree（DT），随机森林random forest（RF），多项式回归polynomial regression（PR）区分MRSA和MSSA。结果表明，利用SVM方法得出的模型预测MRSA的能力最好，利用这一模型检测MRSA的准确性、灵敏性、特异性分别是87%，75%和95%[5]。在2023年最新的一篇研究中，鲁辛辛教授实验室用多种算法软件对MRSA和MSSA进行鉴别。研究利用Bruker MALDI-TOF质谱仪的ClinProTools软件中的遗传算法、快速分类算法、监督式神经网络算法以及中元汇吉质谱仪EX-Smartspec软件的卷积神经网络算法进行试验研究，展开3轮建模和验证，发现，各方法在鉴定MRSA与MSSA时的灵敏性和特异性均较高。Bruker ClinProTools软件中的监督式神经网络算法与中元汇吉质谱仪EX-Smartspec软件所用的卷积神经网络算法在快速识别MRSA时的性能指标可被临床接受[6]。
二、MALDI-TOF-MS在鉴定β-内酰胺类耐药菌中的应用
β-内酰胺类耐药菌的耐药机制主要是由于细菌产生β-内酰胺酶。细菌产生的β-内酰胺酶将β-内酰胺类抗生素，如青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类抗生素的β-内酰胺环水解，导致其失去活性，进而对其耐药。
利用MALDI-TOF MS鉴定β-内酰胺酶有两种方法，一种是酶水解法。即细菌产生的β-内酰胺酶水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环，导致β-内酰胺类抗生素的相对分子质量增加18 Da，随后，水解产物进一步脱羧，相对分子质量减少44 Da，最终，在质谱图上会呈现-26 Da的位移[7, 8]。这种检测方法较为繁琐，需要将细菌与合适的β-内酰胺类抗生素共同孵育1-4小时，离心，取上清用于质谱检测[7, 9, 10]。抗生素的质谱图峰主要为为 [M+H] +、[M+Na] + 和 [M+2Na] +，水解产物质量峰主要为 [Mhydr+H] +、[Mhydr+Na]+、[Mhydr+2Na] + 和 [Mhydr/decarb+H] +（M表示抗菌药物分子，Mhydr表示抗菌药物水解产物，Mhydr/decarb表示抗菌药物水解脱羧产物）。目前，已经用MALDI-TOF-MS检测的β-内酰胺类抗生素包括青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢他啶、厄他培南、亚胺培南、美罗培南等[7, 11-16]。
另一种方法是直接利用质谱来鉴定特定的β-内酰胺酶。Papagiannitsis等人利用多种步骤从不同的肠杆菌中提取了周质蛋白，进而鉴定出AmpC酶，即CMY-2的特征峰位于m/z 39850，此外，他还检测到另外两种AmpC酶的特征峰，分别是，ACC-4 39670 m/z，DHA-1，38887 m/z[9]。Espinosa等人通过分析耐三代头孢的大肠杆菌和其他肠杆菌的裂解产物蛋白质谱，也鉴定到CMY-2质谱特征峰m/z 39800 Da[10]。研究者利用提取试剂（甲酸：异丙醇：水，17:33:50）（Sigma-Aldrich）提取细菌总蛋白，并结合双层辛皮酸doublelayer sinapinic acid（SA）（Bruker Daltonics）点样技术进行质谱鉴定。该方法操作更为简便、迅速，鉴定大肠杆菌中CMY-2的灵敏性与特异性均为100%[10]。
三、MALDI-TOF MS在鉴定碳青霉烯类耐药菌中的应用
这与检测β-内酰胺类耐药菌类似，利用MALDI-TOF MS技术检测碳青霉烯类耐药菌的第一种检测方法就是酶水解法。Lukáš Hleba等人通过对比碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌与耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌（KPC-kpn）对美罗培南的水解产物，发现，单独的美罗培南有以下几个特征峰384.098 m/z（美罗培南）、406.264 m/z（美罗培南钠盐），428.057 m/z（美罗培南二钠盐），碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌由于无法水解美罗培南，相应的质谱峰几乎没有变化。然而，KPC-kpn组菌株，由于能水解美罗培南，使得美罗培南被水解、脱羧，产生了以下几个不同的质谱特征峰：402.338 m/z（酰胺键断裂的美罗培南），423.945 m/z（酰胺键断裂的美罗培南钠盐），446.575 m/z（酰胺键断裂的美罗培南二钠盐），380.055 m/z（美罗培南脱羧后钠盐）[17, 18]。
为了量化水解，logRQ的概念被引入到质谱鉴定中。logRQ是水解产物质谱峰强度总和与抗菌药物质谱峰强度总和比值的对数值，logRQ值越大，细菌对抗生素的水解效果越好，相应的MIC越大。Oviaño M等人在2020年的研究发现，可以使用质谱联合布鲁克碳青霉烯水解酶试剂盒（MALDI-TOF MS MBT STAR-Carba IVD assay）检测对亚胺培南/瑞来巴坦敏感的肠杆菌科细菌。研究人员首先将143株碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（97 blaKPC，1 blaGES，12 blaVIM，4 blaIMP，3 blaNDM，26 blaOXA-48-like）与亚胺培南/瑞来巴坦一起孵育30分钟，再利用MALDI-TOF MS MBT STAR-Carba IVD assay检测细菌对亚胺培南/瑞来巴坦的水解活性。只有含有A类碳青霉烯酶型的肠杆菌能被瑞来巴坦抑制，从而无法水解亚胺培南。实验结果表明，MALDI-TOF MS MBT STAR-Carba IVD assay方法在检测class-A型的肠杆菌科对亚胺培南/瑞来巴坦的敏感性时，灵敏性和特异性分别高达98%和93%。LogRQ值用来评价细菌对亚胺培南/瑞来巴坦的水解能力。LogRQ值＞0.4表明细菌产生的碳青霉烯酶不能被瑞来巴坦抑制，细菌能水解亚胺培南，LogRQ值＜0.2，表明细菌产生的碳青霉烯酶被瑞来巴坦抑制，细菌不能水解亚胺培南，LogRQ值在0.2与0.4之间，表明还需要进一步验证[18]。
第二种方法是通过检测pKpQIL质粒表达的p019截断蛋白质谱特征峰11,109Da来检测KPC-kpn。p019蛋白，与质粒转座子Tn4401a，同时存在于产生KPC-2的肺克ST258型菌株中，在质谱中呈现11109Da的峰，被用来预测KPC产物[17]。
第三种方法是用MALDI-TOF MS直接检测成熟的碳青霉烯酶。Roque Figueroa-Espinosa等人发明了一种简单迅速的从菌株或报阳血培养瓶中鉴定成熟KPC-2碳青霉烯酶的方法。实验菌株在MH培养基上培养过夜，利用与鉴定β-内酰胺酶特征峰同样的方法提取细菌总蛋白、并利用质谱鉴定特征峰[19]。结果显示，在所有60株产生KPC-2的肠杆菌菌株中，均在28544 Da m/z鉴定到了特征峰，相反，在产生ESBL菌种（TEM-1，CMY-2，CTX-M）以及碳青霉烯抗生素敏感性菌株中没有检测到该特征峰。这一方法检测KPC-2型碳青霉烯酶的灵敏性和特异性均为100%。此外，该研究同时还检测了m/z 11,109 Da信号峰，发现在所有KPC-肺炎克雷伯菌中，只有28%（11/39）的菌株检测到m/z 11,109 Da信号峰[19]。进一步的分析发现，这些检测到m/z 11,109信号峰的KPC-kpn菌株都含有p019基因和Tn4401元件，属于ST258序列型。然而，72%（28/39）的KPC-kpn菌株没有检测到11109Da特异峰。这是由于Tn4401区域发生截短或缺失，导致p019基因无法正常表达[19]。
2022年，Yun Huang等人研究发现，MALDI-TOF MS 中的452 1 m/z特征峰与中国很多城市中的KPC-kpn有关[20, 21]。作者利用ClinProTools s软件，通过比较175株（93株KPC阳性株，82株KPC阴性株（2 NDM，I IMP，1 OXA-48，78株碳青霉烯敏感株））的质谱峰和遗传算法genetic algorithm（GA）建立模型，发现4521 m/z特征峰只在blaKPC-2阳性株中被检测到，blaKPC-2阴性株不含有该特征峰。有意思的是，MLST实验发现，实验中所有KPC-kpn都属于ST11型，这是国内肺炎克雷伯菌最主要的流行株。因此4521 m/z特征峰可以用来检测国内主要流行株ST11 KPC-kpn。
四、MALDI-TOF-MS在鉴定粘菌素耐药菌中的应用
多粘菌素耐药菌的耐药机制主要是因为细菌中多粘菌素的作用靶点脂多糖（LPS）被修饰，导致多粘菌素无法通过结合LPS破坏细菌细胞膜而发挥功能，进而导致细菌对其耐药。常见的LPS修饰包括细菌lipid A添加4-氨基-4脱氧-L-阿拉伯糖（L-Ara4N）和磷酸乙醇胺（pEtN）。利用MALDI-TOF MS检测多粘菌素耐药菌的原理即是识别这两种修饰所导致的质谱特征峰的改变。2019年，Laurent Dorte等人完善了MALDIxin操作方法[22]，通过加入在1%乙酸中再水解15分钟的方法，优化了操作步骤，最终使质谱鉴定在30分钟内完成，成功鉴定了49株多粘菌素耐药肺炎克雷伯菌（45株染色体介导的耐药，3株质粒MCR介导的耐药，1株包含两种耐药机制）。结果发现，细胞膜lipid A的L-Ara4N修饰，导致了质谱峰图上lipidA相关特征峰产生m/z +131的位移，lipidA的pEtN修饰，导致了质谱峰图上产生m/z+123的位移。此外，通过结合测序结果，发现使用MALDI-TOF MS还可以区分细菌对多粘菌素的耐药类型，即区分染色体介导的多粘菌素耐药的还是质粒介导的多粘菌素耐药。100%的L-Ara4N修饰都发生在染色体介导的多粘菌素耐药菌中，这是因为染色体编码的调节因子MgrB发生变异（截短、位移、点突变等），激活arn操纵子，进而导致了lipid A的L-Ara4N修饰。而接近100%的pEtN修饰发生在有质粒介导的mcr基因表达的粘菌素耐药菌中[23]，这是由于mcr基因编码pEtN转移酶，使细菌外膜LPS的lipidA发生pEtN修饰。
五、MALDI-TOF-MS在鉴定结核分枝杆菌耐药性中的应用
由于常见的细菌药敏技术需要利用纯培养的细菌，而结核分支杆菌生长速度非常慢，因此，它的常规药敏分析更为困难。核酸飞行时间质谱整合了质谱MassARRAY平台和PCR技术，利用PCR扩增特定的耐药基因，再利用质谱区分野生型基因和突变基因，从而鉴定结核分枝杆菌及其耐药性[24]。2022年，Jichan Shi等人的研究利用MassARRAY平台，检测了202例结核分支杆菌的耐药基因，发现MALDI-TOF MS检测结核分枝杆菌中的异烟肼INH，利福平Rfp，乙胺丁醇EMB，链霉素Sm，氧氟沙星Ofx，莫西沙星Mfx，阿米卡星Am，卡那霉素Km，和卷曲霉素Cm耐药基因时，与BACTEC960药敏方法的结果一致率分别为98.61%，93.75%，97.92%，92.36%，94.44%，88.19%，83.33%和89.58%。这项研究直接从痰或肺泡灌洗液中检测MTB-DNA，而不需要等待结核分枝杆菌生长出纯菌落后，再从菌株中提取DNA进行检测，因此，大大缩短了临床鉴定结核分枝杆菌及其耐药基因的时间[25]。这表明，MALDI-TOF MS在鉴定结核分支杆菌中具有很好的应用前景。
六、定量分析在MALDI-TOF MS鉴定细菌耐药性中的应用
定量MALDI-TOF MS方法之一是MALDI生物型抗生素敏感试验快速测定法MALDI Biotyper antibiotic susceptibility test rapid assay（MBT-ASTRA）。MBT-ASTRA的基本原理是细菌与其敏感的抗生素孵育时，无法产生足够的蛋白数量，进而无法在质谱上产生相应的峰图。MBT-ASTRA计算细菌在与抗生素孵育时AUCBAC+ATB的质谱峰下曲线面积，并同时计算该细菌在无抗生素时质谱峰下的曲线面积AUCBAC。AUCBAC+ATB/AUCBAC的比值即为相对生长速率RG。RG值越接近0，表明在含有某一抗生素时，细菌几乎无法生长，即该细菌对此抗生素敏感。相反，当RG值接近1时，表明该细菌对抗生素耐药，生长不受影响。MBT-ASTRA的优势是检测速度快，可在2-3小时内完成，比常规药敏实验缩短约12小时。然而，此方法的相关软件使用非常专业，需要由专业人士完成。Lange等人分析了108株肺炎克雷伯菌，菌株经过与美罗培南孵育1小时后，经裂解液裂解得到菌体蛋白，再用定量质谱的方法检测菌体蛋白，计算RG，判断菌株对美罗培南的耐药性。它与Etest方法相比，这种方法的灵敏性为97.3%，特异性为94.5%[26]。
2023年，Camila Mörschbächer Wilhelm等人改进了MBT-ASTRA方法，使其操作更为简单方便。文章使用商品化的美罗培南disks（Oxoid Thermo Scientific）配置美罗培南稀释液，简化了峰谱分析方法，使用flexAnalysis 3.4软件（Bruker Daltonics）分析质谱峰。每个峰图选择6个质谱峰进行分析，根据每一株细菌计算相对生长速度RG，与经典药敏方法对比，分析敏感株和耐药株的RG后计算cutoff值。最后发现，RG值≤0.1510的菌株对美罗培南敏感，≥0.672的菌株对美罗培南耐药。该方法与经典药敏方法相比，符合率为95.65%，其中有2.9%的小差异，3.23%的重大差异[27]。
七、分析与结论
MALDI-TOF MS技术以其快速、准确、易操作、成本低的优势在临床微生物实验室得到广泛的应用，该技术在鉴定病原菌耐药性方面也具有巨大的应用潜力。本文总结了MALDI-TOF MS在鉴定MRSA、β内酰胺类抗生素耐药、碳青霉烯类抗生素耐药、多粘菌素耐药、结核分枝杆耐药等方面的很好的应用前景，但也应认识到该方法的局限性。
首先，目前的研究多是利用研究者所在区域的菌株资源，鉴定结果依赖于当地的流行株特征。如在美国和欧洲，p019蛋白与blakpc相邻，位于质粒pKpQIL的转座子Tn4401上，有这一遗传特征的菌株多为ST258型肺炎克雷伯菌，可以通过质谱检测p019蛋白特征峰11,109来检测KPC-kpn。然而，在中国，Tn4401相关原件并不携带blakpc-2，因此，这一方法并不适用于检测国内ST11型肺克流行株KPC-kpn[20]。在中国，依靠质谱检测KPC-kpn的特征峰是4521 m/z，编码4521 m/z蛋白峰的基因位于携带Tn1721-blakpc-2的IncFII质粒中，与国外流行株遗传特征差异较大[7, 20, 28]。因此，数据库需要持续的升级、更新和完善[3]，不能将某一地区构建的模型直接用在其他地区[6]。
其次，β-内酰胺酶的亚型多，难以通过质谱进行分型。并且，β-内酰胺酶表达量较低，难以通过质谱检测出强度较高的质谱峰[29]。在利用酶水解法分析病原菌的耐药性时，也严重依赖于细菌的耐药机制，只能分析某些种类的抗生素。此外，利用MALDI-TOF来鉴定细菌的耐药性目前的标准化程度低，各研究者使用的蛋白提取方法不同，基质液缓冲液也不同，因此，最终的质谱峰鉴定也存在差异。
尽管MALDI-TOF MS鉴定耐药性的研究大多处于试验研究阶段，并未在临床大规模应用，但越来越多的研究证明其在预测抗生素耐药性的强大的应用前景。2022年，在发表在Nature Medicine杂志的一篇研究中，来自瑞士Caroline Weis等人开发了一种新的机器学习方法，表明，基于MALDI-TOF MS的机器学习可以很好的预测细菌对抗生素的耐药性。该研究收集了超过30万个质谱图和超过75万个抗生素耐药表型，发现在用机器学习的方法预测临床常见致病菌，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌时，受试者工作特征曲线下面积分别为0.80、0.74、0.74.[30]。我们相信，随着研究的进一步深入，基于MALDI-TOF MS的细菌耐药性分析必将成为优化治疗和抗生素管理的重要工具。
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