全自动液质联用分析系统在脂溶性维生素检测中的应用
沈晶晶，应用工程师，现任职于岛津企业管理有限公司上海分析中心。
【摘要】本文建立了岛津在线自动前处理仪CLAM-2030和超高效液相三重四极杆质谱仪LCMS-8050CL联用系统测定人血清中5种脂溶性维生素含量的方法。此联用系统利用蛋白沉淀的原理实现自动化样本前处理及在线LC-MS/MS分析，只需简单放入采血管、配合脂溶性维生素专用试剂盒及方法包，便可完成实时的在线分析。本文对分析方法的线性、准确度和精密度性能做了考察，并检测6例临床样本，结果显示：各分析物线性范围内校准曲线相关系数均大于0.9966，质控品准确度均值靶值范围内，精密度CV值均小于11%，实测的临床样本无基质干扰，可满足临床检验需求。该方法自动化程度高，对检测人员友好，有助于更快、更简单、更安全地完成日常临床检测任务。
【关键词】临床检验；自动化；医用质谱仪；脂溶性维生素
脂溶性维生素就是指能溶于脂肪和油脂的维生素，它们可以储存在人体的脂肪组织中，而且也必须与饮食中的脂肪一起被吸收，维生素A、维生素D、维生素E和维生素K为四种常见脂溶性维生素。
维生素A对视力、免疫功能和人类发展至关重要。维生素A缺乏病是由于膳食中维生素A或其前体胡萝卜素缺少或吸收不良而引起的全身性疾病，其主要病理变化是全身上皮组织角质变性，于眼部出现最早，可引起视觉功能异常，并影响呼吸道、消化道、泌尿生殖道等的黏膜，乃至皮肤、骨骼及免疫系统。
维生素D，俗称“阳光维生素”，主要生理功能是将血钙和血磷水平维持在正常范围内，以维持大部分生命过程不可或缺的代谢功能，血清中25羟基维生素D2和25羟基维生素D3的浓度测量已经应用于监控人体内维生素D的状况及低血钙代谢性骨疾病和高血钙代谢性骨疾病的鉴别诊断。
维生素E是体内生物膜上的重要组成部分，当维生素E缺乏时，生物膜上的多不饱和脂肪酸容易发生过氧化反应，以红细胞为例，其细胞膜上的多不饱和脂肪酸因发生过氧化反应而受损时会发生溶血反应，继而出现贫血症状。
维生素K1，又名叶绿醌，在食物、人体中广泛存在。维生素K1是肝脏合成凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ所必须的物质，能促进血液凝固，缺乏维生素K会导致出血失调，导致无法止血。此外，维生素K缺乏可导致骨质疏松症，恢复维生素K水平则可改善骨质疏松症。
一、临床质谱检测的自动化需求
质谱分析技术作为生物样本内小分子分析的金标准方法，与传统的检测方法相比，具有特异性高、准确度高及多指标可同时检测的优点，仅需一次样品处理即可检测多种脂溶性维生素指标，不受内源性基质干扰，应用前景广阔，但由于质谱检测系统的开放性，仪器的自动化程度低，前处理过程复杂，这些对医院内相关技术人员的操作能力和专业数据的处理能力要求高。因此，临床质谱的使用对医院传统检验人员来说是一种新的挑战，如何解决临床质谱检测自动化难题，满足日益增长的临床检测需求，让检验分析人员更简单高效地完成检测任务是目前临床质谱分析的一个难点和重点。
岛津公司基于在凝血分析临床检测系统领域所积累的丰富经验所开发的、可用于LCMS™的全自动样品制备系统，仅需将采血管放置到指定位置,系统可自动执行从样品预处理到LCMS分析的全程操作。
CLAM-2030+LCMS-8050CL
工作流程
图1. CLAM-2030+LCMS-8050CL联用系统及其工作流程
本文利用在线自动前处理仪CLAM-2030和三重四极杆质谱仪LCMS-8050CL联用对人血清中维生素A、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、维生素E和维生素K1进行定性定量分析。简单、安全、准确地实现了临床脂溶性维生素的高通量检测。
1. 实验部分：（1）仪器设备：本实验使用岛津在线自动前处理仪CLAM-2030和岛津临床质谱LCMS-8050CL，具体配置如下（见表）。
（2）实验材料：脂溶性维生素检测试剂盒（液相色谱-串联质谱法，苏州帕诺米克公司，产品编号：DP000008，批号：2021122101）；Shim-pack GIST C18色谱柱（规格：50mm×2.1mm×2μm，岛津（上海）实验器材有限公司，P/N：27-30001-02）；超纯水（纯水仪（Millipore；Milli-Q Reference+Elix 5）制备）；甲醇（Methanol，Merck KGaA，德国，HPLC级）。
（3）分析条件：液相色谱条件（见表1）
色谱柱：Shim-pack GIST C18（50mm×2.1mm×2μm），岛津
（上海）实验器材有限公司，P/N：227-30001-02
流动相：A相-水，B相-0.1%甲酸甲醇（含1mM甲酸铵）
洗脱方式：梯度洗脱，时间程序见表1
流速：0.5ml/min
柱温：50℃
进样器温度：15℃
进样量：40μl
（4）样品制备和前处理：① 标准样品和质控品及样品制备：标准样品和质控品：使用脂溶性维生素检测试剂盒（液相色谱-串联质谱法，苏州帕诺米克公司）。该试剂盒包含以下部分：样本提取剂：维生素A-d6、25-羟基维生素D2-d3、25-羟基维生素D3-d6、维生素E-d6、维生素K1-d7、稳定剂、防腐剂；校准品：6个浓度水平冻干粉样本（含标准浓度的维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1）；质控品：3个浓度水平冻干粉样本（含标准浓度的维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1）。按试剂盒说明书要求，分析前使用超纯水溶解标准样品和质控品干粉样本，混匀后备用。② 临床样本：6例人血清临床样本由市某医院提供（仅作科研用途），解冻后，混匀备用。
2. 样品前处理：在CLAM-2030工作站界面优化自动前处理参数、蛋白沉淀剂使用量、震摇转速、震摇时间、抽滤时间等。确定样品自动前处理程序具体操作为：
（1）吸取20μl甲醇活化过滤管，准备上样；
（2）吸取校准品、质控品或血清样品30μl上样；
（3）吸取样本提取剂150μl；
（4）转速2000rpm震摇30s进行提取；
（5）使用-50~-60kPa的负压抽滤过滤管60s；
（6）接收管转移至自动进样器，进样40μL（详见图2）。
图2. CLAM-2030在线自动前处理过程
3. 实验结果：（1）线性关系：将6个标准浓度的校准品按1.3.2中前处理条件进行分析测定，以浓度比为横坐标，面积比为纵坐标，内标法制作校准曲线得到相关系数、线性范围和校准品准确度见表3。
（2）精密度&准确度实验：本实验分别对低、中、高浓度质控样品进行5次重复测定，精密度相对标准偏差范围分别在3.99%~10.99%（LQC）、2.31%~9.49%（MQC）、1.70%~10.14%（HQC）之间，准确度结果均落在质控品允许范围内，满足临床检测要求，数据结果见附录表4~表6。
二、临床样本实测
为考察本方法在实际样本检测中抗干扰能力，分别选取6例临床样本进行测试（其中01、02号为正常血清样本，04、05、06号分别为轻度溶血、轻度黄疸和轻度脂血样本），各维生素浓度检测结果详见表7，临床样本色谱图详细图3。
三、方法定量限
25OH-VD2、25OH-VD3、VA、VE和VK1方法定量限分别2.5、5、50、1000和0.1ng/mL，定量限色谱图详见图4。
四、结论
本文建立了一种使用岛津在线自动前处理仪CLAM-2030及岛津临床质谱LCMS-8050CL联用系统测定人血清中5种脂溶性维生素含量的方法。此方法使用岛津在线自动前处理方法进行LC-MS/MS分析，内标法定量，每个样品分析时间仅需7min，在线性范围内，5种维生素相关系数均＞0.9966，定量限分别为2.5ng/ml（25OH-VD2）、5ng/ml（25OH-VD3）、50ng/ml（VA）1000ng/ml（VE）、0.1ng/ml（VK1）。质控品均在靶值范围内，质控品精密度RSD均＜11%，实测临床样本无基质干扰，可满足临床日常检验需求。
此联用系统在线自动处理样品且数据重复性好，消除手动操作生物样品带来的风险，最大限度地减少操作人员与生物样本的接触，只需简单放入采血管、必要试剂和专用处理管，便可进行在线自动前处理，每个样品并行处理，以优化仪器的使用和样品通量，并且通过软件来管理试剂、校准曲线、控制样品和系统维护，确保系统的性能和可靠性，系统提供可视化的图表和数据，可实时提醒用户试剂量的减少或QC样品结果的变化等，是一种全自动化的分析系统。
