血液和粪便样本肿瘤标志物检测在结直肠癌早诊早筛中的临床诊断价值
崔巍，医学博士、研究员、博士研究生导师。现任中国医学科学院肿瘤医院检验科主任。专业研究方向：临床基础检验、血液检验、分子生物学诊断。学术任职：中华医学会检验分会候任主任委员，中华检验医学杂志副总编辑，北京医师协会检验医师（技师）专业委员会会长，国际实验血液学学会细胞分析和流式委员会委员，IFCC EMD临床实验室管理委员会通讯委员等。主要学术业绩：在国内外期刊发表文章200余篇;主持国家自然科学基金、北京市科委等重点课题项目20余项；荣获中华医学科技奖、北京市科技进步奖等7项。
李怡玲，在读博士。中国医学科学院肿瘤医院临床检验诊断学直博生三年级；研究方向为结直肠癌的表观遗传调控、肿瘤免疫及生物标志物研究。发表SCI期刊论文5篇，总影响因子29分，其中以第一作者发表文章2篇，发表中文核心期刊1篇。
【摘要】随着居民生活水平及饮食结构等多方面的发展，结直肠癌的发病率和死亡率呈现上升趋势，其全球发病率和死亡率分别高居第三位和第二位。由于结直肠早期症状不特异，癌前窗口期长，使得实验室早诊早筛备受关注，无创和微创的检测技术也得以发展。本文总结了近年来新兴的基于血液和粪便样本的实验室筛查与诊断方法，评估其对于结直肠癌的临床诊断效能与研究现状，为CRC的早诊早筛技术的临床应用提供参考依据。
【关键词】结直肠癌；肿瘤标志物；筛查；诊断
结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，据国际癌症研究机构统计，2020年全球约有190万新增结直肠癌患者，近93.5万患者死亡[1]。根据研究表明，结直肠癌的发生发展是一个多步骤、多阶段演进的复杂过程，主要通过三种途径发展，包括：腺瘤-癌序贯模型、锯齿状腺瘤和炎症途径。但其症状不特异、癌前窗口期长，大多数患者确诊时已处于中晚期[2]。因此，为减轻结直肠癌日益沉重的治疗负担，降低死亡率，早期的实验室筛查与诊断方法新兴而起。常见的结直肠癌筛查方法有风险评估问卷、便隐血检测、肛门指检以及肠镜检查等，但这些方法在实际应用中存在一定隐患。大便隐血检查和肛门指检等方法的弃检率较高，不能完全有效覆盖应筛查人群；肠镜检查是一种侵入性检查，不仅依从率较低[3]，而且我国的肠镜资源和肠镜医师缺乏，不能完全覆盖。既往的人群筛查常使用问卷调查和免疫法粪便隐血试验（Fecal immunochemical test，FIT），但问卷或FIT阳性的高危人群肠镜检出率与依从性仍然较低[4]。为了更好地防治结直肠癌，进一步提高筛查与诊断效率，非侵入性的早期结直肠癌实验室筛查与诊断方法迫在眉睫。在本文中，我们对近些年来基于血液和粪便来源的实验室新兴检测方法及其诊断效能进行了论述。
一、血液标志物检查
肿瘤标志物的异常往往发生在影像学检查发现异常之前，而血液标志物检测具有相对简单、微创的优点。由于传统的血清筛查标志物，如Carcinoembryonic Antigen（CEA）和Carbohydrate Antigen199（CA199）的诊断灵敏度低，在多种癌症中存在异常表达，并非结直肠癌特异性肿瘤标志物。随着结直肠癌分子分型的深入发展与液体活检技术的逐渐完善，本文就循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）及多种循环核酸（circulating nucleic acids，CNA），包括循环肿瘤DNA（circular tumor DNA，ctDNA）突变或甲基化，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）等新兴的血液肿瘤标志物进行阐述。
1. 循环肿瘤DNA检测：ctDNA是血液细胞游离DNA（cell free DNA，cfDNA）中具有肿瘤源性的片段化DNA碎片，主要来自于坏死和凋亡的肿瘤细胞，携带肿瘤特异性遗传和表观遗传信息[5]，常用于肿瘤筛查、诊断、术后动态监测及微小残留病灶的复发预测[6]。结直肠癌ctDNA的检测主要包括驱动基因突变和甲基化修饰。常见的驱动基因突变包括APC、TP53、KRAS、PI3KCA、BRAF、CTNNB1等[7, 8]；而常见的甲基化基因包括：Septin9、SHOX2、BCAT1、IKZF1、BCAN、VAV3等。
（1）基因突变检测：ctDNA突变检测是具有前景的CRC非侵入性的早诊早筛方法。2018年，Science发表了一篇一种结合血浆蛋白质与ctDNA突变的血液检测方法。研究共纳入388名I-III期的结直肠癌患者和812名健康人，该方法在结直肠癌中检测的灵敏度为64.9%，准确率（区别于其他7个常见肿瘤的能力）为83.7%[9]。Bettegowda等人通过外周血ctDNA的检测KRAS基因突变，发现在206例转移性结直肠癌患者中检测灵敏度为87.2%，特异度高达99.2%[10]。最近，Panagiota等人开发了一种基于ctDNA中KRAS突变的多重检测快速方法，该法具有高特异度和可重复性[11]。然而由于临床试验的数据有限，需进一步验证该方法的临床效能。
（2）基因甲基化检测：基因的异常甲基化是CRC发生过程中的重要步骤[12]。DNA甲基化可在各种体液中快速检测，包括血液和粪便[13, 14]。因此，在实体瘤中检测到的甲基化特异性DNA位点作为一种非侵入性分子方法应用于早期CRC的诊断。Yuan等人纳入84名健康人、31名晚期腺瘤患者和44名结直肠癌患者，通过Septin9-SDC2-VIM联合甲基化血液检测，构建逻辑回归的早期诊断模型。该方法对腺瘤和CRC的诊断特异度为86.9%，灵敏度分别为83.9%和81.8%，曲线下面积（Area Under Curve，AUC）分别为0.916和0.905[15]。2021年，Gastroenterology杂志发表一种用于检测CRC和晚期腺瘤的多位点特异性DNA甲基化标记的血液检测方法。Cai等人从招募的340名CRC患者，138名晚期腺瘤患者、62名非肿瘤性息肉或其他非肿瘤性疾病以及58名健康个体中发现，该方法诊断CRC的准确性高达93%，对晚期腺瘤及CRC患者的总体诊断准确性为84%，显著优于其他无创筛查方法[16]。
基于ctDNA的肿瘤早期检测方法仍然存在一定局限性。首先，基于血液样本的ctDNA丰度较低，尤其是在晚期腺瘤及早期结直肠癌患者中。其次，ctDNA的平均片段长度范围较广，从细胞凋亡分泌的70-200bp的小片段到坏死产生的200bp-21kbp的较长片段，对ctDNA的分析技术具有较高要求。因此，未来还需要更大规模的临床研究优化与验证ctDNA是否可常规应用于结直肠癌的早诊早筛。
2. 非编码RNA检测：在结直肠癌中，ncRNA在血管生成、迁移、分化和凋亡中发挥重要作用。研究证明，ncRNA在CRC中表达异常是潜在的非侵入性生物标志物。本文主要阐述微小RNA（microRNA，miRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和环状RNA（circular RNA，circRNA）的研究进展。
（1）血液miRNA的检测：近年来，循环miRNA作为癌症的诊断生物标志物引起了众多关注。肿瘤来源的循环miRNA可通过包装成凋亡小体或外泌体，也可通过与蛋白质结合（如AGO或高密度脂蛋白）稳定存在于外周血中[17]，是结直肠癌潜在的生物标志物，如miR-92a, miR-21，miR-103a-3p，miR-127-3p，miR-17-5p，miR151a5p，miR-181a-5p，miR-18a-5p和miR-18b-5p等[18, 19]。但目前，单独的血清或血浆miRNA并不能较完美地区分结直肠癌和健康人，因此多种miRNA联合诊断分析已逐渐成为筛查与诊断结直肠癌的一种趋势。Kota等人通过大型公开的GSE115513数据集中鉴定了一组miRNA，发现4种miRNA（miR-193a-5p、miR-210、miR-513a-5p和miR-628-3p）的组合特征在训练集中AUC高达0.92 [95%置信区间（confidence interval，CI），0.85-0.96]。随后通过149例早发性CRC患者进行的独立队列的验证，发现miRNA组合性能AUC为0.88（95% CI，0.82-0.93）[20]。此外，刘等人通过大样本验证发现组合分析miR-1290和miR-320d可作为结直肠癌筛查和诊断的潜在无创筛查方法。ROC曲线分析发现联合诊断在区分CRC和晚期腺瘤方面显示出优越的诊断准确性。与健康对照（N=30）相比，区分腺瘤（N=50）的AUC为0.82（95% CI，0.75-0.89），灵敏度为77.5%，特异度为88.7%；区分CRC（N=80）时，联合miRNA的AUC为0.91（95% CI，0.85-0.96），灵敏度和特异度分别为81.2%和90.7%[19]。
（2）血液lncRNA的检测：lncRNA是血液系统中由肿瘤细胞释放的长链非编码RNA，涉及多种生物学过程，如表观遗传调控、免疫应答、分化和染色体动力学，是稳定的循环肿瘤标志物[21, 22]。Xu等人首先在生物信息学数据库中分析和筛选出有潜力的lncRNA包括ZFAS1，SNHG11，LINC00909和LINC00654，然后收集临床血浆样本进行验证。研究表明，SNHG11在识别癌前病变和早期肿瘤形成方面表现出最大的诊断能力，AUC为0.868（95% CI，0.787-0.948）[23]。lncRNA在结直肠癌的诊断筛查方面仍处于初步研究阶段，目前还没有相关产品可广泛用于临床，这意味着还需进行更多的研究，以便其应用于CRC临床早筛中。
（3）血液circRNA的检测：circRNA作为一类新型的非编码RNA，其特征在于稳定的闭环结构与独特的组织和发育阶段表达模式，可作为潜在的疾病生物标志物[24]。Hsa_circ_0006282是新发现的一种circRNA，剪接序列长度为198nt，宿主基因TCEB1位于chr8：74868145-74872053。Mohammadi等人通过纳入100例CRC患者和108名年龄匹配的健康对照，旨在评估血浆hsa_circ_0006282对早期和快速诊断CRC的诊断效能。研究发现circ_0006282对CRC的准确度达到0.812（95% CI，0.625-0.801）。当联合hsa_circ_0006282、CEA和CA199进行分析时，可提高诊断灵敏度至78.8%，特异度为76.9%，而单独使用传统的CEA和CA199标志物，灵敏度分别仅为48%和29%[25]。最近，国内一项研究表明，hsa_circ_0001445可作为早期CRC诊断的血清标志物。研究发现，血清hsa_circ_0001445对结直肠癌的灵敏度为75.0%，特异度为83.3%，AUC达0.807[26]。
血清或血浆中的ncRNAs作为CRC早期诊断与筛查的生物标志物具有一定的应用前景。为了实现临床转化，将ncRNAs纳入实验室指标，需进行多中心更大规模的验证。此外，单一的ncRNA可能并不适用于临床应用，ncRNAs的联合检测，甚至结合不同类型的生物标志物，如CEA、CA199等，以进一步提高血液检测的灵敏度和特异度，进而有利于开发新的更准确的CRC筛查与诊断方法。
3. 循环肿瘤细胞：循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）是指血液循环中来自原发肿瘤、转移或复发部位的细胞[27]。CTC可单独或与成纤维细胞、白细胞、内皮细胞和血小板共同构成细胞集群簇，形成肿瘤微栓，具有较强的传播、转移能力[28]。2018年，美国临床肿瘤学会发表了一篇前瞻性的研究。Tsai等人纳入620名受试者进行了一项前瞻性的单中心临床研究，包括138名健康人、327名结直肠癌（结直肠癌I至IV期）及111名癌前病变（腺瘤、息肉）患者。研究结果显示，在癌症疾病的所有阶段，对癌前病变和癌性病变的总体准确率为88%[29]。中国一项研究表明，CTC对CRC和腺瘤的检测灵敏度分别为95%和79%，特异度为86%[30]。但由于CTC的丰度低，具有较大异质性以及检测技术的局限等原因，CTC的临床应用仍面临诸多挑战亟待解决，以便真正转化于临床实践中。
二、粪便肿瘤标志物检测
目前，临床常规的便潜血试验包括：基于愈创木脂粪便隐血试验（guaiac fecal occult blood test，gFOBT）和FIT。但便潜血的检测灵敏度较低，gFOBT和FIT的灵敏度分别为50.00%和75.00%[31]。因此，临床实践中需要具有更高灵敏度、侵入性较小的检测方法。近年来，为实现个性化医疗，新型生物标志物的筛选与鉴定已成为分子诊断和治疗的重要部分。结直肠癌基于粪便样本的无创检测包括：基因突变检测、非编码RNA检测及肠道菌群相关标志物检测等。
1. 粪便基因检测：粪便基因检测是指从肠道中脱落的肿瘤细胞中检测变异DNA（突变或甲基化修饰），可分为单基因和多基因检测方案，也可联合FIT进行分析，从而诊断结直肠腺瘤和CRC。2021年，Keivan等人首次研究发现，SRY-Box 21（SOX21）基因启动子甲基化定量检测可作为早期检测结直肠癌的无创标志物。采用MethyLight法分析80例粪便样本中SOX21基因启动子的甲基化状态，对结直肠癌的诊断AUC为0.875（95% CI, 0.792-0.959），灵敏度为72.5%，特异度100%[32]。此外，多基因的联合检测也逐渐成为结直肠癌筛查诊断的新趋势。Jin等人收集33例结直肠癌患者，16例健康志愿者的新鲜粪便样本，结果发现，SDC2和NDRG4联合基因甲基化的逻辑回归算法，对于结直肠癌的诊断灵敏度为81.8%，特异度为93.8%，AUC值为0.913，表明粪便DNA甲基化标志物可以满足CRC筛查[33]。张等人研究表明，当联合SDC2和TFPI2甲基化分析，对腺瘤和CRC粪便样本的总阳性检出率分别为81.3%和93.4%，特异度为94.3%，且阳性检出率与病变严重程度增加有关[34]。粪便DNA（stool DNA，sDNA）和FIT联合检测也可用于CRC的筛查与诊断。Xu等人通过招募359名患者，采集其粪便样本对KRAS突变、NDRG4和BMP3甲基化进行sDNA检测以及联合FIT进行诊断分析发现，早期结直肠癌（I期+II期）、晚期腺瘤、非结肠癌肿瘤息肉的检测灵敏度分别为95.45%、81.6%、29.63%，特异度分别为75.9%、23.08%和75.17%，AUC值分别为0.945、0.543和0.547[35]。
2. 基于脱落细胞的非编码RNA检测：在粪便或血液循环中检测出的非编码RNA（主要是miRNAs），有望为CRC筛查提供一种新的指标。2008年，粪便miRNA首次被检测出[36]，随后的研究证明miRNA在许多肠道疾病中发生了异常改变[37, 38]。研究者们发现，多种粪便miRNA在结直肠癌中具有显著的差异表达，与健康对照组相比，miR-21、miR-106a、miR-96、miR-203、miR-20a、miR-326、miR-92、miR-421、miR130b-3p和miR27a-3p等在结直肠癌中上调[39, 40]，而miR-320、miR-126、miR-484-5p、miR-143、miR145、miR-16和miR-125b等在结直肠癌中下调[36]。其中筛查应用较为广泛的miRNA包括miR-21、miR-92a、miR-106a、miR-221、miR-18a及miR-20a，CRC检测的灵敏度分别为：56%，72%，34%，62%，61%和55%，特异度分别为：73%，73%，97%，74%，69%和82%[41-44]。与血液检测类似，粪便miRNA的联合诊断同样也是临床筛查和诊断的新方向与新趋势。研究发现，miR-21和miR-92a的联合诊断优于单独使用miR-21和miR-92a检测[41]。但相较于血液学中较为成熟的miRNA 组合研究，多种粪便miRNA的联合检测目前仍处于初步研究阶段，还需更多的临床数据亟待研究。
3. 肠道菌群相关标志物检测：整合微生物组和代谢组数据表明，肠道菌群相关微生物与代谢标志物能够表征生物体及其代谢途径的表型，并能进一步评估宿主和肠道细菌代谢物的相互作用，对CRC发生发展具有关键作用[45]。2015年，Yu等人首次报道了来自多个国家基于CRC宏基因组基因标记诊断CRC的潜在可能性，并通过独立验证数据证明，m1704941（丁基辅酶a脱氢酶，来自核梭杆菌）和m1696299（RNA聚合酶亚基β，来自微小微单胞菌）基因标记的丰度可以显著地将CRC微生物群落与健康对照区分开，AUC高达0.84，灵敏度为72.34%[46]。该研究首次证明了通过粪便样本中微生物生物标志物的靶向检测方法来诊断CRC的潜力。此外，基于宏基因组和16S RNA测序分析，研究者们进一步揭示了小单胞菌P.micra在CRC中呈显著上调趋势，可作为潜在的粪便非侵入性标志物。P. micra是一种厌氧革兰氏阳性球菌，存在于健康的人类口腔和胃肠道菌群中[47]，Xu等人通过前瞻性地招募277名受试者（包括83名健康志愿者，128例腺瘤患者和66例CRC患者），收集其肠镜前的粪便标本检测小单胞菌的表达水平。研究结果显示，粪便中P. micra的表达水平可以有效区分CRC患者与健康对照组，AUC值为0.87。但并不能明确区分腺瘤与健康对照，AUC值仅为0.55[48]。此外，微生物代谢物已在多项研究中被确定为CRC的潜在生物标志物。通过使用气相色谱-质谱检测技术对CRC患者进行粪便代谢物分析，Lin等人发现粪便醋酸盐的变化与CRC组织中葡萄糖和肌醇的改变呈正相关，与其他粪便代谢物相比，醋酸盐在诊断CRC方面表现出最高的诊断性能，训练集中的AUC为0.843，在验证集中同样具有良好的诊断效能[49]。然而，在肠道菌群相关标志物应用于临床常规检测项目之前，仍需要更大规模的合作努力，以充分验证该方法的临床应用潜力。
三、结论与前景
结直肠癌筛查诊断手段应具有可靠、安全、便捷、易被接受且可及性好等特点。基于血液和粪便的实验室检测方法对结直肠癌筛查和早诊具有一定的临床意义。大量研究表明，血液和粪便样本中循环肿瘤DNA、非编码RNA、循环肿瘤细胞及肠道菌群相关标志物的检测，有望为结直肠癌无创筛查提供一种经济、高效的手段。但如何提高筛查与诊断的灵敏度和特异度，是CRC无创检测技术需克服的难题。进一步优化结直肠癌新指标的临床应用，需从证据等级、检测技术和成本等问题多维度评估。相信随着研究的深入和各种高通量研究手段的兴起，基于血液和粪便的生物标志物检测有望成为结直肠癌新的检测手段。
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