循环肿瘤DNA在肺癌诊疗中的临床应用价值
杜鲁涛，医学博士、教授、博士生导师。国家自然科学基金优秀青年获得者、山东省泰山学者青年专家，齐鲁卫生与健康杰出青年人才、山东大学杰出中青年学者、齐鲁青年学者。现任山东大学齐鲁医院检验医学中心常务副主任、山东大学齐鲁医学院临床检验诊断学系副主任，现兼任中华医学会检验医学分会青年委员、中国医师协会检验医师分会委员、山东省医学会检验医学分会委员兼秘书等。主要研究方向为肿瘤新型生物标志物的发现及应用。主持国家重点研发计划项目课题1项、国家自然科学基金优秀青年基金1项，面上项目2项，山东省重大科技创新工程1项。以第一或通讯作者在PNAS、Nature Communications、Hepatology、Cancer Research等发表SCI论文32篇，第一发明人授权国家发明专利5项。以第一完成人获山东省科技进步二等奖1项。
【摘要】肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，近2/3患者发现时已是中晚期，治疗效果差，早期发现提高肺癌患者的五年生存率的关键。目前肺癌的诊断主要依靠影像检查和组织活检等，而这些诊断方法在临床应用中均存在一定局限性。液体活检具备高灵敏度、特异性以及可多点采样的优势，其主要检测对象循环核酸成为一类应运而生的肿瘤新型生物标志物。其中，循环肿瘤DNA（ctDNA）是来源于原发或转移肿瘤组织细胞的DNA，存在形式稳定且保持着与肿瘤组织样本一致的遗传信息，是肺癌重要的标志物之一。本篇综述主要总结了近些年ctDNA在肺癌的诊断、疗效评估及复发监测等领域的研究进展。
【关键词】肺癌；游离DNA；循环肿瘤DNA
肺癌是我国的高发肿瘤，国家癌症中心于2022年发布的最新统计数据表明，肺癌占所有癌症新发及死亡病例的20%和27%，严重威胁我国居民健康。临床显示，及时有效的诊断和监测对于改善肺癌患者预后具有重要意义。目前临床上对于肺癌的诊断金标准主要依靠手术或者通过使用穿刺针取得组织标本后再行组织病理检查，其权威性毋庸置疑，但同时也具有侵入性、创伤性、对身体条件存在一定要求以及经济成本高等局限性。而且由于肿瘤本身具有异质性，约四分之一的肺癌针吸活检因获取组织过少而影响诊断与病情评估。此外，影像学检查是目前肺癌治疗后随访的常用技术，可监测残留疾病病灶、复发或远处转移。然而受到灵敏度的限制，往往导致微小转移灶难以检测，而灵敏度相对较高的影像检查如PET-CT等价格较高[1]。它与之相较，液体活检是一种以血液等体液为样本来源进行分析的技术，能够反映其来源组织的相关信息，可以实时重复进行，且具有非侵入性，因此在肿瘤诊断和监测等方面显示出广阔的应用前景[2]。其中，循环肿瘤DNA（ctDNA）作为液体活检最重要的检测目标之一，它与常用蛋白质生物标志物相比，蕴含更特异的肿瘤信息，成为目前肺癌相关的实验室检测研究的热点和焦点[3, 4]。本文就ctDNA作为肺癌生物标志物的临床应用价值进行论述，以期为肺癌的诊断和监测提供新的思路。
一、循环肿瘤DNA及其检测方法
循环核酸是存在于人体体液的细胞外游离状态的核酸，最初在1948年被Mandel和metais观察到，他们发现在血液中含有自由循环的DNA片段。但直到1977年Leon等人发现来自癌症患者血液中的总游离DNA（cfDNA）水平与肿瘤转移之间存在相关性，其临床意义才得到进一步阐释[5]。此后，cfDNA的临床应用潜力激发了科学家对其在癌症领域的应用进行了更深入的研究，发现肿瘤患者血液中的cfDNA，即ctDNA不仅来源于原发性肿瘤，也可来源于循环或播散的肿瘤细胞[6-10]。ctDNA长度一般为90-150个碱基，是携带特异性改变的DNA片段，包括体细胞DNA的点突变、杂合性丢失、基因融合、拷贝数变异以及DNA甲基化等修饰。在血浆中，ctDNA可用于准确监测接受手术或化疗的癌症受试者的肿瘤动力学[11]，肿瘤特异性DNA甲基化也可以通过ctDNA进行分析，进一步拓展了其在肿瘤临床检测中的应用潜力[12-15]。目前ctDNA的检测分析方法主要有实时定量PCR（qPCR）、突变阻滞扩增系统PCR（ARMS-PCR）、BEAMing技术、微滴数字PCR（ddPCR）以及高通量测序等[16-20]。利用BEAMing技术和ddPCR对ctDNA的检测分析可用于测定已知的突变，且与肿瘤组织细胞中测得结果高度一致；高通量测序技术可获取全基因组表征，以及患者肿瘤中的点突变、拷贝数变异和特异基因分型等信息，以此评估肿瘤异质性及指导治疗等。
二、循环肿瘤DNA在NSCLC早期诊断及治疗监测中的应用
非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺部恶性肿瘤的85%，其中约70%被诊断为非鳞状组织学，如腺癌或大细胞癌[21]。在过去的20年中，晚期NSCLC患者的治疗手段不断完善，预后提升显著[22]。首先，针对癌基因依赖性肿瘤的靶向治疗的引入，对提高NSCLC的治疗效果和改善生存具有重大作用；靶向EGFR、ALK或ROS1等分子的NSCLC患者治疗效果表明，以上靶向药可有效抑制肿瘤细胞增殖。ctDNA目前常用于监测EGFR突变NSCLC中的酪氨酸激酶抑制剂治疗。且大量研究已证明，ctDNA中检测到的EGFR基因突变与NSCLC患者的肿瘤组织中检测到的EGFR基因突变高度一致[23]。2016年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准液体活检ctDNA用于检测EGFR突变，ctDNA分析已从作为EGFR突变检测肿瘤组织的替代方式发展为临床应用中的最佳方式[24]。近几年，靶向程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）或程序性细胞死亡配体1（PD-L1）的免疫检查点抑制剂（ICI）已应用于NSCLC治疗。有研究提出ctDNA浓度作为免疫治疗应答的预测标志物，最终结果显示ctDNA浓度的变化可作为评估抗PD-1药物治疗患者的肿瘤应答的标准[25]。Giroux Leprieur等人报道了首次评估时，低ctDNA浓度与纳武单抗的长期获益有关，表明ctDNA水平可能是评估肺癌免疫治疗效果的早期标志物，并可预测免疫检查点抑制剂治疗NSCLC患者的疗效[26]。新辅助化疗免疫疗法后的ctDNA清除最近也被证明是评估患者预后的可靠指标，而且还可以在化疗-放疗后的巩固免疫治疗期间促进个性化治疗策略的制定与实施[27-29]。
随着对ctDNA研究的不断加深，ctDNA已可作为监测肿瘤进程的生物标志物。例如，释放到血液循环中的ctDNA片段能够反映原发性或转移性肿瘤中的肿瘤状态、肿瘤演变和基因组改变等。Bettegowda等人通过对640名癌症患者研究发现，ctDNA分析可以帮助临床医生通过跟踪耐药性监测治疗反应，并且能够实现早期检测局部恶性肿瘤[30]。研究还指出肿瘤负荷与疾病阶段之间具有相关性，IV期患者的ctDNA浓度中位数比I期患者高近100倍。研究已经证明cfDNA，特别是ctDNA，作为肿瘤负荷替代标志物的巨大潜力。Silvia Waldeck等人收集了21名早期或局部晚期的非小细胞肺癌患者在术前、手术期间、手术后1-2周和随访期间共96份血浆样品，运用高通量测序的方法检测到12名患者ctDNA存在肿瘤特异性突变，同时有4例患者在术后1-2周时仍为ctDNA阳性，而这4名患者在随后的时间点均出现疾病进展。该研究表明，分析ctDNA浓度能够区分原发性NSCLC（I-III期）的患者与健康个体，且部分IA期患者也会表现出ctDNA浓度升高；此外，还可以根据ctDNA定量和微卫星改变分析来发现早期复发[31]。
三、循环肿瘤DNA在SCLC早期诊断及治疗监测中的应用
小细胞肺癌（SCLC）约占全球肺癌诊断病例的15%，占肺癌死亡病例的25%。大多数SCLC患者发现时已存在转移，预后较差，五年存活率不到5%。由于SCLC肿瘤生长迅速和转移能力强，SCLC患者血液中含有高水平ctDNA，ctDNA分析可以更显著地反映肿瘤的变化。然而研究分析ctDNA在SCLC中作用的报道却并不多见。Fernandez-Cuesta等人对使用ctDNA样品检测SCLC患者中TP53突变的可能性进行了研究，结果显示在49%的患者（具有不同的肿瘤阶段）ctDNA检测到可能的TP53突变，此外，研究者证实了ctDNA具有早期检测TP53突变SCLC患者的潜力[32]。
基于高通量测序检测，Almodovar等人使用SCLC肿瘤中常见突变基因（包括TP53和RB1等）分析了11例局限期小细胞肺癌患者和16例广泛期小细胞肺癌患者的系列血浆样本。结果显示，在85%的患者中检测到了突变，其中TP53和RB1是最常见的突变基因。该研究结果还显示，ctDNA监测可以在影像学检测到疾病进展之前或在模糊成像的情况下发现SCLC复发。此外，SCLC患者中增加的ctDNA水平与更差的总生存期相关[33]。
为了明确SCLC的亚克隆及其在治疗期间的分子进化，Nong等人使用覆盖癌症中改变的430个基因，分析了来自22名SCLC患者在治疗开始前和治疗期间不同时间点的ctDNA样品。该研究在所有患者的基线ctDNA样品中检测到最常见突变是TP53突变，可在91%（20/22）的患者中观察到，RB1突变在64%（14/22）的患者中观察到。此外，在8名患者中，同时检测分析了血浆和组织样品，显示突变的一致性为94%，表明ctDNA测序是检测SCLC患者中体细胞突变的敏感工具。此外，高ctDNA水平与更差的生存率相关，可用于预后预测。该研究证明了组织和ctDNA之间具有类似的DNA亚克隆结构，支持使用ctDNA检测体细胞突变和研究SCLC的分子异质性[34]。Devarakonda等人使用高通量测序技术分析了来自更大SCLC患者队列在诊断和疾病复发时的ctDNA。结果表明609例患者中有552例（94%）至少有一个点突变或拷贝数变异，最常见的改变基因是TP53（72.5%）和RB1（18%）。此外，作者观察到在复发时获得的样品中APC和AR的突变率更高[35]。以上研究表明，ctDNA分析是SCLC诊断、治疗方案制定和病情监测的有力工具，其应用可改善SCLC的诊断及预后。
四、循环肿瘤DNA应用中存在的问题及展望
研究证实ctDNA可作为肺癌检测的良好血液生物标志物。ctDNA检测具有实时性、无创性和准确性等优势，其无创性对缩短肺癌患者的治疗恢复期具有重要作用，且可获取肺癌进展的动态信息，在患者治疗效果评估和病情变化监测等方面具有重要应用前景。目前，ctDNA检测为达到较高的灵敏度和准确度，检测成本也随之升高，对其临床推广应用有一定阻碍作用。临床应用中需要进一步提高ctDNA的富集技术，并通过技术革新降低检测成本，解决ctDNA临床推广应用中的实际难题[36]。Jamal-Hanjani等人使用多重PCR和二代测序（mPCR-NGS系统）能够鉴定早期NSCLC患者ctDNA中的特异和非特异突变[37]；不过该研究样本量较小，因此需要增加队列规模进一步验证mPCR-NGS分析ctDNA在检测早期癌症中的作用。与肺癌诊断生物标志物相关的其他研究方向包括检测某些基因中的高甲基化和/或低甲基化水平，例如p16、DAPK、APC、MGMT、BCAT1、CDO1、TRIM58和ZNF177等，在ctDNA检测中也具有较高的应用潜力[38, 39]。在这篇综述中，我们总结了ctDNA检测在肺癌诊断、个性化治疗指导和预后预测方面的作用，但临床中仍不能将ctDNA检测结果作为唯一参考，而是需要将ctDNA检测结果与病理组织结果、影像学结果及其他检测结果结合起来系统分析，获取更准确的肺癌诊断及治疗方案。
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