全外显子组测序在肿瘤放疗敏感性诊疗中的临床应用与研究方向
郭云涛，毕业于中国农业科学院，现任中国科学院基因生物科技（江苏）有限公司生信负责人，负责医学大数据生物信息分析挖掘和管理工作，在医学遗传、肿瘤、农学等领域的数据分析具备丰富的工作经验，熟悉科研课题设计、申报、测序数据的生物信息学分析挖掘、分子生物学实验验证各个过程，具备丰富的数据挖掘技巧和经验（10年），先后帮助合作客户发表文章数十篇，帮助客户申请各类课题十余项，为公司申请计算机软件著作权30余项，以第一作者身份发表中文核心期刊文章3篇，SCI文章3篇，作为公司方第一参与人辅助客户发表并挂名SCI文章10余篇。
全外显子组（whole exome）是人类基因组全部外显子区域的总和,是基因组上人类疾病研究的首选区域。全外显子组测序（whole-exome sequencing）又称为外显子靶向捕获测序，是指通过高通量测序手段对人类基因组编码区的选择性测序，以发现疾病相关候选基因和突变[1]。随着技术的不断发展和优化，全外显子组测序已广泛应用于许多肿瘤研究领域。放射治疗是针对肿瘤患者最常用的治疗方法之一，癌症患者对放射治疗的敏感性对治疗效果有很大影响。利用全外显子组测序研究放射治疗的敏感性，可以发现不同敏感性患者携带的生物标志物和靶点，为精准放疗提供更多的理论支撑。
一、肿瘤全外显子组测序概述
全外显子组测序作为一项新兴技术，它与全基因组测序相比具有成本低、效率高等优点，在疾病机制研究中具有较好的应用前景。随着2002年人类基因组计划的完成，以及其他生物物种的全基因组图谱的不断完善，研究发现不同种群之间的基因差异仅为1%，主要表现在外显子的差异[2]。外显子作为蛋白质的编码区，是DNA中的重要的功能序列。外显子虽然仅占人类基因组的约1%，但涵盖了与个体表型相关的大多数功能突变，以及约85%的人类致病基因突变[3]。在单基因疾病的应用中，它可以加速确定单基因缺陷疾病的基础，并系统地预测疾病相关基因。在检测癌症、糖尿病等复杂疾病的致病基因和易感基因方面也具有广阔的应用前景[4]。
目前，癌症应用中的全外显子的研究和应用方向主要如下：（1）驱动基因研究。由于外显子的高覆盖率，全外显子测序技术获得了大量的基因组数据。因此，即使样本中肿瘤细胞的含量很小或样本的纯度差异很大，它仍然可以更好地检测外显子区域的基因突变，从而进一步确定与肿瘤相关的致癌基因和抑癌基因，为肿瘤的早期诊断提供证据[5]。（2）肿瘤分子分型。由于全外显子测序可以并行检测微卫星不稳定型癌症的频繁突变，潜在的错配修复机制缺失，甚至可以检测结直肠癌癌症亚型的高频突变，因此它可能成为未来结直肠癌基因分型的工具[6]。（3）转移复发研究。可以通过全外显子组测序研究肿瘤进展的分子特征，明确肿瘤转移前的时间窗口，以便及早发现并预防肿瘤转移、复发[7]。（4）肿瘤个性化用药。通过全外显子组测序技术获得与肿瘤基因突变相关的最佳药物靶点，并改变相应的代谢途径，这种方式有望成为未来癌症个体化治疗的金标准[8]。
二、全外显子测序在肿瘤放疗敏感性中的研究
手术、放疗和化疗是癌症患者最常用的治疗方法。在临床实践中，两种及以上的治疗往往与综合治疗相结合，以控制癌症进展。目前放射治疗的技术方法包括普通放射治疗、适形放射治疗和立体定向放射外科。放射治疗在肿瘤治疗中发挥着越来越重要的作用，约70%的肿瘤患者在整个治疗过程中需要放疗的干预[9]。2014年，世界卫生组织统计显示，癌症治愈率为55%，放射治疗的贡献率为22%。在此背景下，患者的放射敏感性对肿瘤的治疗计划和结果有很大影响。放射治疗敏感性是指患者肿瘤细胞对放射的敏感性。不同人群的肿瘤细胞对放疗的敏感性不同，在相同的辐射剂量、时间和场上有不同的反馈结果[10]。研究发现，影响肿瘤放疗敏感性主要有三个因素：
1. 肿瘤的不同组织来源对辐射的敏感性不同。源自放射敏感组织的肿瘤比源自放射抵抗组织的肿瘤对放射治疗更敏感，如源自淋巴组织的恶性淋巴瘤对放射治疗高度敏感，而源自胃肠道的腺癌对放射治疗不太敏感。
2. 放射治疗的敏感性随肿瘤细胞分化的程度而变化。原发性星形细胞瘤对放疗不敏感，而二级和三级星形细胞瘤相对敏感。
3. 肿瘤生长模式也会影响放射治疗的敏感性。生长到表面的肿瘤，如浅表肿瘤和花椰菜状肿瘤，对放射治疗更敏感，而生长更深的肿瘤，例如侵袭性肿瘤和溃疡性肿瘤，则不太敏感。
目前的研究表明，放射敏感性肿瘤包括：视网膜母细胞瘤、鼻咽癌、卵巢癌症生殖细胞瘤、睾丸精原细胞瘤、肾胚胎瘤、恶性淋巴瘤等。人体各部位的鳞状细胞癌、食管癌、鼻咽瘤、皮肤癌症等对放射治疗普遍敏感，而大多数腺癌通常对放疗不太敏感[11]。
三、全外显子组测序在放疗敏感性中的临床应用
全外显子组测序已逐渐应用于放疗敏感性的研究。本节将以胰腺癌和食管鳞癌为例，介绍全外显子组测序在放疗敏感性研究中的进展。
1. 全外显子组测序在胰腺癌症化疗敏感性中的应用：胰腺癌症（PC）是目前第四大肿瘤相关死亡原因，预计到2030年将成为第二大致命癌症。近年来随着癌症生物学的研究逐渐加深，许多新的治疗方式，如靶向治疗、免疫治疗和放射技术得到了发展，提高了PC癌症患者的生存率。目前在PC的主要治疗手段中，40%的治愈患者是接受了以放疗为主治疗方案，因此放疗治疗作为许多PC患者的优选治疗方案。但许多被诊断为PC的患者由于其固有和后天的抗辐射能力而无法通过化疗获得较好的治疗结果[12]。而PC抗辐射的分子机制仍有待解决[13]，因此目前迫切需要确定预测PC治疗中放疗益处的生物标志物。通过研究发现放疗的效果可能受到与肿瘤本身和周围微环境相关的一系列变化的影响，如抑制细胞凋亡、增加DNA修复、炎症和缺氧等。随着研究深入，PI3K/AKT[14]、ATM/ATR[15]、MEK/ERK[16]、Wnt[17]等以及基因SMAD4、MUC1、RAD54[18]等已被鉴定为参与调节内源性信号并阻碍放射治疗对某些癌症的治疗效果。
基于这一研究背景，研究人员对接受根治性手术和放疗的两组中的6名胰腺导管腺癌（PDAC）患者进行了随访调查，其中3人反应良好（简称N组），3人反应较差（简称S组）。对两组人员的全基因组进行测序，并将数据用作护理治疗的标准。通过生物信息学工具和公共数据库分析体细胞和胚系突变特征，使用功能富集和基于KEGG通路的蛋白互作分析来解析放疗抵抗的可能机制，最后使用细胞转染和集落形成实验进行验证。最终在整个外显子组测序中，441个基因的体细胞突变被检测为放射敏感性相关基因座。其中，270个和187个独特突变分别属于N组和S组。17个基因，包括Smad蛋白家族成员（SMAD3和SMAD4），被鉴定为影响PDAC的放射敏感性。SMAD3和SMAD4基因的突变在放射敏感性和放射抗性PDAC患者之间是不同的，SMAD3的突变增强了电离辐射（IR）对PDAC细胞生长和集落形成的影响，而SMAD4的突变则相反。SMAD3和SMAD4分别通过P21和FOXO3a至少部分调节PDAC的放射敏感性，表明SMAD3和SMAD4通过不同的途径参与调节PDAC放射敏感性。这些结果可能为未来PDAC患者的放射治疗提供一些生物标志物和潜在靶点[19]。
2. 全外显子组测序在食管鳞状细胞癌化疗敏感性中的应用：食管癌（EsC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，具有预后差、死亡率高、流行病学特征明显等特点。根据世界癌症研究基金会2018年的统计数据，EsC是男性第七大常见癌症，女性第十三大癌症。EsC主要有两种类型。食管腺癌发生在食管和胃的交界处。食管鳞状细胞癌（ESCC）发生在食管上部，亚型占绝大多数病例。鳞状细胞癌在局部区域或大范围扩散之前通常保持无症状。手术切除联合新辅助化疗被认为是ESCC的标准治疗方法。然而，有些患者因为不符合手术适应症，只能接受根治性放化疗。尽管放射治疗治愈的几率很低，但相当一部分患者会得到缓解。因此，放疗在ESCC的综合治疗中发挥着重要作用。然而这种疗法的疗效受到患者放射敏感性的限制，抗药性仍然被认为是ESCC患者放射治疗失败的主要原因。由于存在固有或后天的抗辐射能力，一些患者未能获得巨大的治疗效果，导致转移或高复发率，最终导致死亡。因此，有必要确定调节ESCC放疗敏感性的关键因素。而确定ESCC的潜在预测生物标志物和治疗靶点则是一个重要的研究方向[21]。
研究人员对6名自愿的ESCC患者进行了根治性手术，并确保没有肿瘤组织在病理上残留。术后所有患者均接受调强放射治疗（IMRT）。根据对放射治疗的反应，将ESCC患者分为敏感组（S组）和抗放射组（N组）。在研究中通过对患者进行全外显子组测序并对ESCC中的胚系和体细胞突变进行筛选。通过分析研究人员在候选基因中发现了几个可能与放疗反应相关的关键突变。其中344个体细胞和65个胚系差异突变基因被检测为放射敏感性相关基因座。同时对ESCC中NOTCH1与肿瘤免疫浸润的相关性进行了分析。体外研究表明，在ESCC细胞中，NOTCH1缺乏会抑制细胞存活，并导致放疗后更多细胞凋亡，而NOTCH1过表达则具有相反的效果。此外，ESCC中频繁上调的NOTCH1与ESCC中活化的B细胞和未成熟树突状细胞呈负相关。NOTCH1的高表达伴随着一些免疫治疗相关细胞的低水平，包括CD8（+）T细胞和NK细胞。
研究结果表明，ESCC辐射敏感组和抗辐射组的胚胎和体细胞突变存在差异，这提示NOTCH1在调节ESCC辐射敏感性中起重要作用。这一发现可能为提高ESCC对放疗的敏感性提供生物标志物和潜在的治疗靶点[22]。
四、全外显子组测序在放疗敏感性中研究方向与前景
通过对胚系突变和体细胞突变的研究分析，不同癌症下放疗敏感性的生物标志物以及治疗靶点被发现并将应用在肿瘤放疗治疗中。这些研究结果将改善与优化当下放疗治疗手段并提高放疗对肿瘤治疗中的结果。同时随着全外显子组测序技术的不断成熟与成本不断降低，有理由相信全外显子组测序技术将更为广泛的应用在放疗敏感性的研究中，实现真正的精准放疗。
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