器官型组织培养药物敏感性检测在肿瘤个体化精准诊疗中的应用

田力，生物化学研究员，泰康生物（北京）生物技术有限公司 董事长。

【摘要】目前恶性肿瘤的药物方案大多采用美国国立综合癌症网络（National Comprehensive cancer network，NCCN）临床实践指南推荐的标准化治疗方案，因忽略了肿瘤发生、进展的复杂性、异质性及个体化差异，导致有效率低、毒副作用大、费用高等问题。因此，实现肿瘤“个体化精准医疗”是大势所趋，肿瘤患者进行药物敏感性检测，以期达到个体化精准用药，是“个体化精准医疗”的主要内容之一。器官型组织培养药物敏感性检测（(Histoculture drug response assay，HDRA）是将手术切除、穿刺活检或内镜活检获取的活性肿瘤组织块经体外培养后，进行药物敏感性检测的方法。HDRA保持了肿瘤组织的天然结构特征、异质性和微环境，临床一致性较高，实验周期短，是一种比较有前景的肿瘤体外药敏检测技术。本文就HDRA的发展历程、临床研究和应用以及未来的发展趋势做一综述。

【关键词】器官型组织培养药物敏感性检测（HDRA）；恶性肿瘤；个性化精准医学；化学治疗；激素治疗；靶向治疗

2020年全球新发癌症病例1929万例，死亡病例996万例。中国新发癌症病例457万例，死亡病例300万例，5年相对生存率从2003-2005年的30.9%提高到了2012-2015年的40.5%[1]。恶性肿瘤的治疗手段包括放疗、化疗、激素治疗、靶向治疗、免疫治疗、中药及联合治疗等，药物治疗大多采用美国国立综合癌症网络（National comprehensive cancer network，NCCN）指南推荐的标准化治疗方案。

循证医学指南是由荟萃分析或以群体为中心的研究提供信息，并从中得出平均建议，忽略了肿瘤的复杂性、异质性和个体化差异，无法对异常值提供解决方案[2]，由于肿瘤的发生、进展机制极其复杂，肿瘤患者的个体化差异极大，肿瘤存在时间和空间异质性，耐药和多耐药导致肿瘤药物治疗失败，并且肿瘤患者的药物反应受多种复杂多变因素（特别是微环境）的影响，体现于患者之间的个体化差异和患者自身的疾病进展差异，每个患者都有可能因为这些差异而成为异常值，因此需要以个人为中心且涵盖病程管理的精准治疗模式。癌症治疗已经从“一刀切”的方案转向向了更个性化的方案，我们从特定的分子标记开始，发展成为基因组、转录和蛋白质组学特征[3-5]。在未来，NGS技术将被用于描述个体患者的分子特征和预测治疗反应。然而，一方面这些生物标志物的验证和随后在临床中的实施需要广泛研究；另一方面由于治疗反应往往不能仅通过单一的基因标记来准确预测，除了突变状态外，还有许多其他因素会影响肿瘤的行为和治疗反应，如表观遗传因素和肿瘤微环境[6, 7]。同时，当前指南中提出的精准治疗是基于基因、蛋白等生物标记物的检测，生物信息数据统计对患者进行新的分层，仍然是以易感性患者分层做为诊断终点[8]，而对于患者分层如何转化为更好的患者治疗的关键技术，在患者之间的个体化差异和患者自身的疾病进展差异水平的诊断终点仍然是空白。因此，目前很难将遗传信息转化为肿瘤行为，因此需要开发工具，根据肿瘤表型而不是基因型来选择患者进行治疗。预测治疗反应的体外分析可能会填补这一知识空白。

“个体化精准医学”（Individualized precision medicine）却能有效地解决传统治疗手段的针对性低、毒副作用明显、药品无效耗费率高等问题[9]，提高疾病诊治与预防的效益[10-11]。器官型组织学完整性三维组织培养药物敏感性检测（Histoculture drug response assay，HDRA）是将患者来源组织切片/块（手术、穿刺、内镜取样）在保留天然三维组织结构和微环境的组织学完整性三维培养并施予不同药物检测药物反应性的异质性结果，检测不同患者药物反应的敏感程度以及预测不同用药生存受益，指导个性化用药和疾病管理。HDRA在现有指南分层（病理诊断、分子、靶向基因、前期用药）的基础上，利用其保真性保留天然组织结构和微环境的器官型培养，检测不同的药物（如同类药物下不同药物、同靶药物下不同线）、不同的药物组合（如双药联用、多药联用、序贯治疗）、不同的治疗方法（如化疗、内分泌治疗、靶向治疗、免疫治疗）的差异性药物抑制率终点，反映了患者自身当前疾病阶段的药物反应，是实现个体化精准医疗的重要手段之一[12]。

肿瘤药敏试验方法可以预测患者对不同治疗药物的敏感性，实现患者的个体化精准给药，它是个体化精准医疗的核心内容之一[13-15]。肿瘤药敏试验方法共分为体内、外两大类，体外药敏实验包括原代细胞2D培养、3D培养、肿瘤细胞球、类器官及HDRA等。其中，大多数的体外药敏试验需要解离肿瘤组织，分选肿瘤细胞2D培养、3D培养或重构肿瘤细胞球或类器官。分离的肿瘤细胞的二维单层培养缺乏微环境和在体内观察到的肿瘤细胞异质性。三维肿瘤细胞模型或来自同质干细胞群体的肿瘤类器官不包含体内肿瘤的微环境，三维类器官培养是药物筛选、生物标志物发现和耐药机制研究的有价值的工具。然而，该模型缺乏肿瘤微环境的复杂性，不太适合指导个性化治疗。体内方法是患者来源的异种移植瘤模型（PDX），主要缺点是肿瘤移植的成功率不同，建模时间长、成本高且肿瘤间质被小鼠间质慢慢取代。由于器官型组织切片的快速生成时间和反映肿瘤内异质性和肿瘤-间质相互作用，成为功能分析和药物敏感性检测的优秀模型系统。HDRA是20世纪80年代末出现并不断被改进和发展的一种体外药敏实验方法[16]，它不仅实验周期短，还维持了肿瘤组织三维的生长方式、组织结构特征、肿瘤微环境、微免疫环境、细胞异质性和致瘤性等多种体内特性，保持体内一致的细胞外基质、细胞间相互黏附作用、信息传导等，更接近于体内和临床的实际情况[17-21]。本文就HDRA在肿瘤个体化精准医疗中的研究和应用做一概述。

一、HDRA的发展史

莱顿在1951年-1954年首次开发新鲜动物组织的三维培养系统[22-23]。1985年，美国加州大学圣地亚哥分校Hoffman团队证明了腺癌、卵巢癌、畸胎瘤、恶性黑色素瘤、网状细胞肉瘤、淋巴肉瘤、卵巢乳头状腺癌和肝癌等晚期肿瘤的肿瘤组织在三维培养的条件下可以长期存活并维持类似体内环境下的组织结构特征，奠定了HDRA检查技术的基础[16]。这种方法确保了TME内的基质成分保持完整[24-26]。研究发现，细胞维持其体内状态，包括空间组织和分化细胞功能，并观察到单个肿瘤内多种细胞类型的生长。1987年，Hoffman团队又报道了肿瘤组织在三维培养的条件下检查化疗药物的敏感性与体内肿瘤相似，率先提出了HDRA药敏法可为个别癌症患者筛选有效的抗癌药物[17]。组织培养很快被应用于评估化疗反应的药物研究，随后被称为组织培养药物反应试验（HDRA）[27-28]。HDRA研究报告了预测胃癌和结肠癌耐药性的准确率为86%[28]，一项相关的HDRA临床试验显示，预测进展期胃癌和结肠直肠癌临床药物耐药性的相关性为92.1%。许多研究将HDRA应用于预测非小细胞肺癌（NSCLC）的药物反应[29]，也显示出良好的可预测率。目前HDRA在肿瘤研究领域中得到了广泛的应用，比如实体肿瘤的药敏检测、新药的开发和筛选等，特别是在基于恶性肿瘤治疗的化疗、靶向治疗、激素治疗、免疫治疗及联合治疗药物敏感性检测的个体化医疗研究和应用[30-34]。

二、HDRA在各种恶性肿瘤药敏检测中的研究和应用

1. HDRA在肺癌药敏检测中的研究和应用：肺癌高居我国恶性肿瘤死亡和发病的首位[35]。Yoshimasu等[36]回顾性分析了359例肺癌患者的HDRA检测结果，发现HDRA可评价率为97.4%，真阳性率为73.2%，真阴性率为100%，敏感性100%，特异性68.1%，准确性达到了83.0%，具有良好的预测性。而高隆等[37]采用了原代细胞培养法进行肺癌体外药物敏感性测定，与临床治疗结果符合率为89.3%，阳性符合率为90.9%，阴性符合率为77.8%，试验敏感性为96.8%，特异性为53.8%。两种方法相比，HDRA预测肺癌与敏感性、特异性明显优于原代细胞培养法，更有利于肺癌患者的个体化精准治疗。此外，Yoshimasu团队[38]又对22例非小细胞肺癌患者进行HDRA检测，其中包括16个腺癌患者，4个鳞状细胞癌患者以及2个类癌型患者，他们发现，吉非替尼抑制率与其浓度呈剂量－反应关系。非吸烟组腺癌20μg/mL的抑制率（39.2%±35.1%，n=6）高于吸烟组腺癌（2.2%±50%，n=10，P=0.001）及非腺癌组的抑制率（16.9%±23.6%，n=6，P=0.09），研究结果认为，HDRA可以评估非小细胞肺癌对吉非替尼的敏感性。日本滨松市三田原综合医院[39]自2001年9月以来，一直在使用HDRA测量肺癌组织对各种药物的化学敏感性，并将HDRA结果应用于NSCLC的辅助化疗，从482位原发性非小细胞肺癌手术治疗中收集了肿瘤组织，414名患者（85.8%）评估对顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨和伊立替康的敏感性，分为PSG（对两种药物都敏感者）和PNSG（至少包含一种药物不敏感者）两组，PSG的总体5年生存率为82.4%，PNSG的为40.1%，两组之间存在显著差异（P=0.03）；在随访期间，PSG的复发率为29.0%，PNSG为55.8%；PSG组的5年无病生存率比PNSG组更好（PSG：56.5%，PNSG：30.1%，P=0.05）；基于体外HDRA的辅助化疗可能有助于提高接受手术的患者的生存率[15]。德国莱比锡大学[40]医院15例NSCLC肿瘤标本，体外培养评估PD-1抑制剂纳武利优单抗的反应与临床相关性，肿瘤组织培养可独立评价纳武利优单抗的反应，而不需要与淋巴细胞共培养，纳武利优单抗可以改变肿瘤微环境。2例患者接受纳武利优单抗治疗30个月后的临床结果与体外检测结果一致，一名组织评估不敏感的患者对纳武利优单抗治疗无反应，术后15个月死亡；另一名组织评估敏感的患者，术后纳武利优单抗治疗后30个月仍存活，化疗和免疫检查点抑制剂的组织切片培养剂量依赖性、个体反应和临床相关性显示了对患者分层的潜力。

2. HDRA在食道和胃肠道肿瘤药敏检测中的研究与应用：目前中晚期食道、胃肠道肿瘤化疗有效性尚不尽人意[41]。运用HDRA预测胃肠道肿瘤辅助治疗药物的敏感性，有利于胃肠道肿瘤的个体化精准治疗，提高胃癌患者的生存期。Hoffman等[42]纳入107例晚期胃癌和109例晚期结直肠癌患者，并检测其对丝裂霉素C、多西他赛、5－氟尿嘧啶和顺铂的化学敏感性，其中有208例（96.3%）完成了HDRA，38例患者的HDRA结果与临床结果进行了相关性分析，结果表明两者的符合率高达92.1%，真阳性率66.7%，真阴性率100%，敏感性为100%，特异性为90.6%。韩国癌症中心对324个晚期结肠癌患者进行HDRA检测，使用FOLFOX的方案的肿瘤抑制率（34.2-39.2%）高于使用FOLFIRI的方案（24.2-32.7%，p＜0.001），在86个评估的化疗方案中，HDRA与化疗临床效果的相关率为66.3%（57/86），敏感性为72.7%（40/55），特异性为54.7%（17/31）[43]。北京大学肿瘤学院北京肿瘤医院外科[44]采用组织培养药物反应试验（HDRA）对42例进展期胃癌患者进行药物反应检测。21例（50%）在HDRA中检测的至少一种药物敏感；80%（16/20）临床确认为真阳性，敏感性为100%，特异性为83.3%；HDRA的ROC曲线AUC-ROC为0.917（95%置信区间，0.81-1.00）。济南军区医学病理中心[45]选择手术治疗的147例胃癌患者，随机分为接受HDRA检测患者69例，归入肿瘤药敏组，其余78例归入经验化疗组，经验化疗组依据指南治疗。经验化疗组与肿瘤药敏组分别有16例、7例出现复发转移；经验化疗组与肿瘤药敏组的中位PFS分别为84天、162天，肿瘤药敏组PFS显著高于经验化疗组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；经验化疗组与肿瘤药敏组的OS分别为392天、476天。HDRA检测结果符合临床实际，肿瘤药敏指导下的化疗效果优于经验化疗组，是对指南的有效优化和补充，在指导胃癌术后个体化化疗中有很好的临床价值。日本名古屋大学医学院[46]在化疗前对25例食管癌患者和10例胃癌患者进行内镜活检，组织培养（HDRA)测定药物敏感性。20例食管癌患者和8例胃癌患者的敏感性被测定，可评价率80%；HDRA判断为敏感的11例患者中，7例有部分反应；在17例判断为不敏感的患者中，16例有轻微反应或没有变化（NC）；使用HDRA可以准确的预测抗癌药物的作用，术前化疗患者采用内镜活检组织培养药敏检测（HDRA）预测抗癌药物作用是必要的。上述表明HDRA能有效预测食道、胃肠道肿瘤术后辅助治疗、进展期或晚期治疗及术前新辅助治疗药物的敏感性和耐药性，根据其结果指导治疗，有利于胃肠道肿瘤的个体化精准治疗。

3. HDRA在乳腺癌药敏检测中的研究和应用：乳腺癌已经成为全球女性发病率和死亡率的首要病因[47]。加州大学圣地亚哥分校外科和韩国翰林大学圣心医院[48]以HDRA对四种乳腺癌亚型合计50例浸润性导管癌患者进行了11种常用的单药或联合用药分析，化疗药物的平均敏感性与乳腺癌亚型缺乏相关性，提示乳腺癌患者个体化治疗的重要性。日本庆应大学医学院、和歌山医学院[49]对30例乳腺癌患者的原发肿瘤和腋窝淋巴结转移的手术标本进行了组织培养药物敏感性检测（HDRA），所有样本均可以通过HDRA进行评估；原发性肿瘤的化学敏感性高于淋巴结转移的化学敏感性（p＜0.05）；数据表明，应在HDRA中测试来自单个患者的原发性肿瘤和转移灶，以增强化疗的临床疗效。Tanino等[50]研究共纳入24例复发乳腺癌患者和127例原发乳腺癌，比较使用多种化疗药物对原发乳腺癌及复发乳腺癌的抑制率。顺铂，5－氟尿嘧啶和丝裂霉素C作为测试药物，原发乳腺癌与复发乳腺癌在HDRA检测中均加入丝裂霉素C的抑制率分别为59.9%和42.8%；加入5－氟尿嘧啶的抑制率分别为49.0%和33.4%；加入顺铂的抑制率分别为34.5%和16.0%，平均抑制率分别为57.9%和38.6%，其中复发乳腺癌有64.7%对4种药物均耐药，而原发乳腺癌仅有27%，另外，复发乳腺癌仅有5.9%的患者对三种或多种药物敏感，而原发病病例为18%，最后分析了所有患者的HDRA结果与临床结果，发现临床相关性为80.0%。因此，运用HDRA可以为临床决策特别是可以为克服复发乳腺癌多药耐药性问题提供个性化的指导。日本鹿岛大学医学[51]分析38例未接受全身新辅助治疗的原发性乳腺癌患者病理特征和5种抗癌药物丝裂霉素C（MMC）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、盐酸阿霉素（ADM）、顺铂（CDDP）和紫杉醇（PTX）的HDRA结果之间的关系，抗癌药物的抑制率与临床病理特征无显著性关系，提示需要个体化治疗；紫杉醇抑制率与无病生存（DFS）显著相关，是DFS独立预后预测因子HDRA预测芳香化酶（雌激素合成酶）抑制剂对乳腺癌的抗肿瘤作用[52]。小块乳腺癌标本被放置在胶原基质上，基质中含有睾酮（芳香化酶的底物）或睾酮和芳香化酶抑制剂。21例乳腺癌手术标本，6例显示睾酮共培养后对[3H]-胸腺苷的结合有所增加。结果表明，芳香化酶抑制剂对组织培养试验系统中睾酮阳性反应的个体乳腺癌患者有效。组织培养技术有望用于预测芳香化酶抑制剂对个体乳腺癌患者的有效性。韩国肿瘤中心医院[53]对70名乳腺癌患者进行HDRA检测，成功率92.9%（65/70），同一组织的HDRA再现性分别为75%（100%一致）和100%（超过70%一致），不同检测者的重复性分别为78.9%（100%一致）和94.7%（70%以上一致）。

4. HDRA在头颈部肿瘤药敏检测中的研究和应用：头颈部肿瘤是全球第六大常见恶性肿瘤[54]，手术联合放疗、化疗等是其主要治疗手段[55]。HDRA可以预测头颈部肿瘤对化疗药物的敏感性。Singh等[56]运用HDRA来预测头颈部鳞状细胞癌的生存期，该研究共纳入42例患者，其中41例患者成功完成了HDRA，研究结果显示有13例患者（32%）对5－氟尿嘧啶耐药，13例患者（32%）对顺铂耐药，11例患者（27%）对两种药物均耐药。同时也比较了耐药的患者和敏感的患者之间的2年生存率，其结果具有统计学差异，5－氟尿嘧啶敏感组与耐药组2年生存率分别为85% vs. 64%，顺铂敏感组与耐药组2年生存率分别为86% vs. 64%对这两种药物均敏感组与耐药组2年生存率为85% vs. 63%。以上研究表明，HDRA对预测头颈部肿瘤的临床相关性高达70%以上。为无法手术治疗的晚期和/或复发性口腔癌患者和新辅助化疗的适应症患者选择抗癌药物，日本大阪医学院口腔外科[57]评价HDRA在治疗口腔鳞状细胞癌的可靠性和实用性，HDRA可评估率100%；敏感性（86.7%），真阳性率（86.7%），特异性（50.0%），真阴性（50.0%），准确性为78.9%；排除放射治疗的病例后，敏感性100%、特异性66.7%、真阴性率100%、真阳性率90.0%、准确性91.7%。结果表明，对于化疗敏感性试验结果为阴性的病例，联合放疗是必要的。通过组织培养药物反应试验（HDRA），前瞻性[58]地研究了57例未治疗、晚期、不可切除的口腔癌对顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶及其联合治疗的化疗敏感性，并将其与化疗的临床反应相关联。52/57例（91%）的活检标本成功组织培养（有5例显示污染的病例被排除在研究之外）；52例可评估的患者中，47例为原发性牙龈-颊癌，5例为舌/口腔底癌。根据检测，27例（52%）肿瘤对顺铂敏感，27例（52%）对甲氨蝶呤敏感，24例（46%）对5-氟尿嘧啶敏感，38例（73%）对顺铂和甲氨蝶呤联合敏感，36例（69%）对顺铂和5-氟尿嘧啶联合敏感。其中，31例表现良好的患者接受了使用一种或多种试验药物的两个周期的化疗；体外化学敏感性与临床反应之间存在显著的相关性（p=0.03）；该试验的阴性预测值为80%，阳性预测值为69%，敏感性为79%，特异性为71%。该方法的总准确率为74%，HDRA是一个相当好的预测口腔癌化疗反应的预测因子。HDRA优点在于具有较高的成功率，有利于敏感性及耐药性的比较研究，且与头颈部肿瘤临床相关性高。

5. HDRA在妇科肿瘤药敏检测中的研究和应用：美国加州大学圣地亚哥分校和韩国蔚山大学医学院[59]前瞻性地对104例AEOC患者在HDRA检测的前提下进行了紫杉醇和卡铂联合化疗，所有患者首先被分为两组，一组根据HDRA结果对紫杉醇和卡铂（SS）均敏感，另一组对一种或两种药物（R）不敏感。SS组复发率明显低于R组，分别为29.2%和69.8%（p=0.02）；SS组无进展生存期明显长于R组，分别为34.0个月和16.0个月（p=0.025）；HDRA可前瞻性的检测化疗与临床结果的相关性，治疗方案可以在HDRA检测的基础上因人而异。HDRA可用于卵巢癌细胞减少手术后选择初始化疗药物，也可用于复发性卵巢癌的二线药物。日本庆应大学医院[60]的115例子宫内膜癌患者评估了HDRA在预测子宫内膜癌患者化疗疗效方面的价值。肿瘤可评价率为93.0%（107/115），7例患者的MTT检测中颜色较差，1例患者被污染；真阳性率、真阴性率和准确率分别为100%、80%和87.5%；38例Ⅲ、Ⅳ期患者中，23例接受含顺铂的化疗。7例敏感肿瘤未复发，16例敏感性低的肿瘤8例在6个月内复发/进展。Ⅲ、Ⅳ期患者5年无进展生存率差异显著（P＜0.05）；子宫内膜样腺癌顺铂敏感性在不同组织学分化水平间无显著性差异；HDRA可以预测子宫内膜癌化疗的疗效，并可为术后辅助治疗方案选择提供有用的信息。韩国蔚山大学医学院妇产科[61]获得65例宫颈癌患者新鲜肿瘤组织，采用HDRA方法检测了10种化疗药物对肿瘤组织的抑制率。不同组织病理学类型和FIGO分期的化学敏感性无明显差异；在10例初次治疗后复发的患者中，根据HDRA数据选择二线化疗药物。5例患者接受了铂联合紫杉醇的化疗，临床反应和无进展生存率与紫杉醇、顺铂，特别是卡铂的抑制率相关。2例对卡铂的抑制率超过50%，经紫杉醇和铂化疗后无进展时间较长。2例卡铂抑制率低于30%的患者对化疗没有反应。HDRA可以预测每个患者的有效药物，为宫颈癌患者的个性化治疗方案提供有用的信息。

6. HDRA在泌尿系统肿瘤药敏检测中的研究和应用：日本滨松大学[62]医院45例患者，膀胱癌26例，肾细胞癌19例，测试了10种抗癌药物。3例有可评估病变的膀胱癌患者，根据HDRA的结果，选择IR值在50%以上的抗癌药物接受了化疗，随访12个月。可评价率分别为100%、89.5%（17/19）；HDRA敏感性与组织学分级之间无相关性；对其中3例膀胱癌患者，根据HDRA结果进行药物治疗，其中1例CR，2例PR；对个体患者的化疗敏感性测试是必要的，排除耐药方案，选择适当的抗癌药物。Hirano对62例患者（47例膀胱癌、13例肾盆腔癌和2例尿路癌）手术或活检标本进行了9种抗癌药物敏感性测试[63]，选择HDRA有效的细胞毒性药物进行临床治疗。可评价率93.5%（58/62），4例样本污染；化学敏感性显示出广泛的多样性，甚至是相同的组织学类别；组织学分级与化学敏感性之间无相关性；HDRA与化疗临床效果的相关性为66.7%；HDRA可以区分有效药物和无效药物，是预测化疗疗效、筛选个性化敏感治疗方案的有效手段。福建医科大学第一附属医院、华中科技大学附属协和医院[64]采用组织培养药敏测试法，对37例膀胱癌的化疗药物敏感性进行检测。可评价率100%；不同化疗药物对不同个体膀胱癌的抑制率差异明显；THP+MMC的敏感率（81.8%）)和平均抑制率（67.6%）均高于任何一种单一药物，联合用药可以提高化疗效果；复发膀胱癌的药物敏感率和平均抑制率均低于初发者，复发膀胱癌对化疗药物存在一定的耐受；膀胱癌的药物敏感性与分级无关；组织培养药敏测试法可有效地为不同个体膀胱癌选择最佳的化疗方案。周辉良等对31例表浅膀胱癌开放手术和电切标本进行组织培养药敏检测[65]。MMC敏感者的无复发生存率明显高于不敏感者。与临床实际疗效比较,该药敏测试法的特异性为75.0%,敏感性为85.7%，准确率达80.0%。组织培养药敏测试法不仅可以检测表浅膀胱癌对化疗药物的敏感性，还能预测敏感药物进行腔内化疗的预后。法国阿尔比斯大学医学院[66]研究肿瘤切片体外培养预测靶向药物（GDC/SRC、帕佐帕尼、舒尼替尼、替西莫司）在肾癌中的治疗效果，特别是研究了培养组织的组织病理学、分子表型、肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞及间质成分之间的关系，评估肿瘤切片体外培养用于肾患者对新分子靶向治疗的敏感性预测潜力。组织切片体外培养维持了原始肿瘤样本的生物医学特性，包括间质和免疫环境，具有模拟肿瘤免疫微环境和评估肾癌对新疗法的反应的潜在用途。可以快速、高效、准确的检测肾癌患者中一系列复杂的分子改变所导致的功能效应和药物反应策略，提高临床治疗的成功率。西安交通大学第一附属医院和福建医科大学第一附属医院[67]选择表浅膀胱癌患者共81例，分两组，依据药敏结果给药组39人，传统经验给药组42人不同个体表浅膀胱癌的药物敏感率、平均抑制率均不同；依据药敏结果给药组的表浅膀胱癌患者的术后复发率显著低于传统经验给药组表浅膀胱癌患者。随访2年，药敏结果给药组的肿瘤复发最早于术后8个月，复发率20.5%（8/39）；传统经验给药组肿瘤复发最早于术后6个月，复发率47.6%（20/42），P＜0.05。对不同个体表浅膀胱癌患者，HDRA可为其选择最合适的化疗药物，用于术后膀胱灌注化疗，降低膀胱癌复发率，是对指南的有效优化和补充，实现表浅膀胱癌的个体化化疗。

7. HDRA在肝胆胰肿瘤药敏检测中的研究和应用：胆管癌（CCA）患者仅需要手术治疗，还需要辅助化疗来提高患者的总生存期,患者的个体药物反应模式是化疗成功的关键。吉西他滨和吉西他滨加顺铂是临床上常用的方案。泰国孔敬大学[68]针对34例患者进行了吉西他滨敏感性的HDRA检测，对33例患者进行了顺铂和吉西他滨加顺铂的HDRA检测，进一步检测了DCK、hENT-1、RRM1、MT和ERCC1在CCA组织中的表达，以探索它们对吉西他滨和顺铂反应的预测能力。HDRA可评价率100%；吉西他滨和顺铂联合治疗对肿瘤生长的抑制作用明显高于吉西他滨单独治疗；hENT-1（吉西他滨敏感因子的低表达与HDRA检测对吉西他滨无反应的肿瘤组织显著相关（p=0.002）；MT（金属硫蛋白）和ERCC1（切除修复交叉互补基因1）的表达与HDRA检测顺铂的%IR呈负相关；HDRA可以反映临床药物反应，作为优化化疗方案的有效手段。胰腺癌患者预后较差，由于疾病的积极进展，快速选择每个患者最有效的化疗可以改善患者的预后。韩国首尔牙山医院[69]在2015年至2017年期间，胰腺癌手术的52名患者被纳入使用HDRA针对目前胰腺癌诊疗指南推荐的吉西他滨（GEM）、顺铂（CDDP）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、奥沙利铂（OXA）、伊立替康（IRN）、多柔比星（DOX）、紫杉醇（PTX）、多西他赛（DTAX）、贝洛替康（BEL）、表阿霉素（EP）、替吉奥（TS-1）单药特别是组合用药方案进行体外敏感性筛选。HDRA检测可以在体外为胰腺癌患者筛选更加敏感的药物，指导选择有效药物组合方案，实现个性化用药筛选，提高抗肿瘤药物治疗有效性，特别是联合治疗胰腺癌。安德森癌症中心[70]将胰腺导管腺癌肿瘤组织精确切割成均匀的小组织切片，在体外培养，并在3-5天内根据临床相关治疗方案进行筛选，将对组织切片敏感性方案与患者的临床反应和结果之间的相关性进行分析，并用生化方法和体内动物PDX模型进一步证实组织切片培养药物敏感性检测结果。体外组织切片培养维持了肿瘤的微环境和结构；信号通路可以在体外组织切片培养中被靶向；药敏检测中敏感性与患者PFS高度相关（r=0.77，p=0.0002），接受敏感方案的患者平均PFS显著更长（16.33 vs 3.8）。体外组织切片培养药敏结果与患者的临床反应和结果相一致；体外组织培养与移植模型的药物反应一致。使用基于肿瘤组织切片体外培养药物检测方法为个体PDAC患者筛选化疗药物是可行的。

8. HDRA在其他肿瘤药敏检测中的应用：韩国国家癌症中心[71]神经肿瘤科、韩国放射和医学科学研究所对33例恶性胶质瘤进行了手术治疗，并对其肿瘤标本用HDRA进行10种药物的敏感性检测。可评价率94%；敏感性为100%，特异性为69%，准确率为80%；药物敏感组PFS中位数为21个月，非敏感组PFS中位数为6个月。

法国南特大学医学院[72]研究应用器官型组织培养作为骨肉瘤临床前化疗试验的体外快速平台。组织培养作为一种生物学高度复杂、仿生、可靠、经济、快速、易于处理的个性化体外研究药物反应的方法，保存患者肿瘤及基质细胞、组织结构以及生理和病理环境，可用于骨肉瘤的体外药敏检测，使基于个体患者肿瘤特征的治疗分层和预测成为可能。韩国癌症中心医院对36例骨肉瘤样本进行阿霉素（ADM）、顺铂（CDDP）、环磷酰胺（CTX）、异环磷酰胺（IFS）、丝裂霉素C（MMC）、博莱霉素（BLM）、紫杉醇（CTX）、达卡巴嗪（DTIC）、甲氨蝶呤（MTX）、依托泊苷（VP-16）、卡铂(CBP)和长春新碱(VCR)敏感性评价，以确定其在治疗中的有效性。同一组织学分类的骨肉瘤之间的化学敏感性存在很大差异，HDRA是一种用于预测疗效和为个别患者选择合适抗癌药物的可行和有用的技术。日本庆应大学[73]医学院采用HDRA对33例STS活检或手术样本进行检测，研究STS中化学敏感性的变化。38例病例中有33例可以进行评估，评价率为86.8%（33/38），5例取样部分有大量坏死组织，活力较低，无法进行培养；ADM和THP两种药物在33例软组织肉瘤中的抑制率明显高于CDDP、IFOS和VP-16；梭形细胞肉瘤对THP敏感，小圆细胞肉瘤对所有试验药物均相对敏感，多形细胞肉瘤的药物敏感性较低，而对THP的敏感性高于70%左右；药物敏感性测试和设计个体化治疗策略似乎是改善治疗结果的必要条件。

巴黎大学和圣路易斯希望医院[74]对移植后淋巴结转移的3例PDXs进行实验。两个含有BRAF和NRAS突变（Mel-XA和Mel-XB），并以含有KIT扩增的为阴性对照（Mel-XC），评估肿瘤对BRAF和MEK抑制剂的敏感性，在体内使用PDX模型，在体外使用来自PDXs的组织培养，研究了黑色素瘤组织培养对靶向治疗的反应，并与相应的PDX进行了比较。来自BRAF突变黑色素瘤的HDRA和PDX模型对BRAF和MEK抑制剂均有显著反应；来自NRAS突变黑色素瘤的HDRA和PDX模型仅对MEK抑制剂有显著反应。这些数据与黑色素瘤对靶向治疗的反应谱相一致。HDRA在体外的肿瘤抑制与患者在PDXs体内观察到的生长抑制相关，每种药物的反应模式一致。黑色素瘤对靶向治疗的反应可以在组织培养及其相应的PDX模型中进行评估，药物的反应模式一致，有助于发展个性化医疗。

三、HDRA的局限性与未来的发展趋势

HDRA在肿瘤个性化精准医疗中的应用还存在一定的不足。首先，HDRA依赖肿瘤活组织，肿瘤在早期组织较小或者手术可切除率不高，无法获取足够量的组织进行检测，基于HDRA恶性体液和外周循环血肿瘤细胞（簇）类体内培养技术可作为补存。其次，组织培养保持组织活性的时间受限且不能扩增，药敏检测通量受限。为了更好地发挥HDRA检测技术的优势，有研究者将HDRA联合了其他技术方法，以此来取长补短。首先，HDRA联合患者源原位移植瘤模型（Patient Derived Orthotopic Xenograft，PDOX）。利用穿刺活检等方法，获取少量肿瘤组织，接种免疫缺陷小鼠体内成瘤，待肿瘤组织扩增后，再进行HDRA检测，以期为临床个体化药敏方案的筛选和新药的研发作服务。Delyon等[75]完成了2例黑色素瘤PDX－HDRA实验，他们发现，PDX－HDRA和PDX模型的体内药敏法都对鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1（BRAF）和丝裂原活化蛋白激酶（MEK）抑制剂有着显著应答，都与临床患者靶向治疗反应一致。其次，HDRA联合qPCR、Western blot、IHC、NGS、流式细胞技术，能有效地预测肿瘤个体化的生物标记物，研究肿瘤微环境和免疫微环境，比如，中国学者袁庶强利用HDRA联合qPCR、Western blot分析了结直肠癌化疗敏感性与多药耐药基因蛋白表达之间的关系[76]。华盛顿大学医学院[77]评估了利用肿瘤切片培养来研究免疫微环境的潜力。切片培养物保持形态和表面积超过1周；肿瘤微环境的关键细胞成分在切片培养中存活；超过90%的免疫蛋白没有显示出明显的丰度变化，切片培养模型在很大程度上保留了免疫相关蛋白质组；T细胞、巨噬细胞和基质肌成纤维细胞在切片培养中存活；药物治疗的细胞毒性作用可以在切片培养中进行评价；活组织切片癌细胞、免疫细胞、基质细胞活组织染色成像可以研究细胞间相互作用。最后，HDRA联合更多的技术基于形态学、分子学、组学研究和检测还有很多可能需要我们去探索与研究。

四、总结与展望

体外药敏分为两种，一种是基于样本中提取细胞进行二维或三维培养的模型如原代细胞培养（包括2D和3D培养）和类器官培养药敏，另一种是基于样本切片、切块进行三维培养的HDRA器官型培养药敏。二者在技术上的区别在于HDRA不经过组织的解离和细胞体外培养的随机筛选，而是在保留组织天然三维结构和微环境的条件下进行组织学完整的三维培养，能延续性的保持体内一致的三维结构、肿瘤微环境、组织学、细胞形态、多细胞组分和肿瘤标志物[78-80]，并且呈现与体内一致的肿瘤代谢特性[81]，这与体内一致的免疫细胞组分[82]，它与体内一致的基质成分、相互作用、信息传导，scRNA-seq检测验证了与体内一致的主要细胞和分子特征[83]，因此可以为临床提供更加充分和准确的异质性肿瘤细胞群反应以及微环境互作信息。并且肿瘤是时空异质性疾病，肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）在肿瘤进展和治疗反应中起着重要作用，而TME的复杂结构和组分至今无法在体外完全复制[84-86]，而HDRA保留天然三维结构和微环境的器官型培养中的TME特征与患者的生存预后具有相关性[87]，保留含有完整TME的组织学特征是HDRA适用于临床诊断的独特技术优势。随着HDRA检测方法的不断发展完善及联合其他技术方法，在肿瘤领域必将得到广泛应用，同时，有望在肿瘤个体化化疗方案的筛选中发挥关键作用。

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