药物基因组学检测与他汀类药物精准用药临床应用价值

刘朝晖，分子生物学硕士，副主任技师。现任中国医学科学院阜外医院实验诊断中心分子组组长，云南省阜外心血管病医院检验科轮值主任。主要学术任职为：中国老年医学学会共病精准诊疗分会委员，北京市中西医结合学会检验分会青年委员，北京市医学检验质量控制和改进中心专家库成员，中国抗癌协会肿瘤病理专委会肿瘤性心脏病学组秘书。主要研究方向为心血管药物基因组的检测及临床应用。主持中国医学科学院阜外院所青年基金1项，云南省阜外心血管病医院院级科研基金1项。参与首都卫生发展科研专项基金1项，参与科技部重大研发1项，参与并获得2017年首都转化医学创新大赛三等奖，2020年第三届中国医疗器械创新创业大赛“体外诊断（IVD）产品类”决赛三等奖，2022年第五届中国医疗器械创新创业大赛医院专场优秀奖，中华医学会第11次全国检验医学学术会议优秀论文。

一、药物基因组学概述

1. 国际观点：2021年，曾经领导人类基因组计划的美国国立卫生研究院（NIH）主任Francis S. Collins在cell上发表了一篇评论文章，展望了未来10年精准医疗的持续发展及改变医疗保健的七大机遇。精准医疗的风向标已经从20年前的“怎么测”，向“怎么用”进行转变。作为七大机遇之一的基因组学，尤其是药物基因组学，结合我国国情，在提高药物疗效、减少药物不良反应、降低用药成本等方面，有许多可以发挥作用的场景。近年来我国的心血管疾病总患病人数持续增长，据中国医学科学院阜外医院在近日发布的《2022年中国心血管健康和疾病报告》中的数据显示，我国心血管疾病总患病人数高达3.3亿，心血管疾病高居疾病死亡构成的首位，在农村更为明显。同时，2022年美国心脏协会（AHA）联合美国国立卫生研究院（NIH）发布了最新的统计数据，显示心血管疾病的各项危险因素越来越多被认为是影响脑部健康的最重要的危险因素。指出保持心脏健康的七种方法，除了要保持运动、维持健康的体重、不吸烟、注意健康饮食之外，还明确提到了要关注血脂、血压、血糖等各项指标。

2. 心血管系统用药风险：心血管疾病患者往往需要终身用药，包括抗心绞痛、降压、降脂、抗凝、抗血小板用药等几大类。药物规范化应用的理念已经深入人心，成为心血管科医生的基本功，但是如何实现个体化用药仍是难题，在临床上也缺少高效和实用的检测工具。据《国家药品不良反应监测年度报告》2021年数据显示，2021年国家药品不良反应监测中心共收到196.2万份报告，其中心血管系统用药占9.5%，心血管系统用药不良反应前三位分别是降压药、抗心绞痛药和抗动脉粥样硬化药。

3. 基因组法规性指南：除了人群临床基础信息的个体差异如体重、身高、年龄、合并用药、性别、疾病等，也要考虑遗传基因造成的个体差异，所以对患者进行心血管药物的相关基因检测，进行个体化用药，是提高疗效、降低不良反应的有效途径。PharmGKB数据库由NIH创立于2000年，收录了关于人类相关基因遗传变异及其如何影响药物反应等信息。从数据库可以看到，美国、欧洲、日本和加拿大的药监部门，包括我国国家卫健委，同时在上面发布了一些和药物基因组相关的生物标签，可以提示哪些药物使用前可以或者必须做基因检测以及基因和药物的相关性信息。

4. 国内对于药物基因组学项目的管理政策及收费标准：为了推动我国基因检测技术在临床上的开展和应用，2007年原卫生部发布了关于印发《医疗机构临床检验项目目录》的通知，目录里新增了第五条临床细胞分子遗传学专业。来自检验科或者分子检测实验室的老师们对此应该都不陌生，在进行临床基因扩增检验实验室扩增技术审核的时候，主管部门审核后会在医院或医疗机构的营业执照后增补一个诊疗科目，就是临床细胞分子遗传学专业，有了这个专业，医学实验室才能合法合规地开展相关的分子检测。同时所开展的药物相关基因检测项目也要符合《医疗机构临床检验项目目录（2013版）》，只有在目录的指导下才能开展相关项目。关于收费，以北京市为例，北京市在2019年6.15医改政策之前，沿用1999年版的《全国医疗服务收费标准》，当时的收费名录有两个，分子生物学病理探针和DNA序列测定；6.15医改之后，目录和《医疗机构临床检验项目目录》里化学药物用药指导的基因检测越来越靠拢，比如CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4基因的相关检测都有收费名目，2021年调整收费，区别在于去掉上述基因，目的是让项目的内涵更加灵活，只要符合化学药物用药指导相关的基因都可以纳入到收费条目里进行收费，当然在开展之前一定要到国家或者省临检中心报批临床基因扩增检验实验室的增项。

5. 药物基因组学项目应用的分子检测技术：目前国内市场上用于临床分子诊断的IVD产品的检测技术包括荧光PCR、熔解曲线、毛细电泳片段分析、基因芯片、金磁微粒和二代测序等，数字PCR、核酸质谱等新的技术也逐渐应用到临床。这些技术从操作的复杂程度、结果判读的难易程度、位点检测多少、检测通量高低、检测周期以及检测费用上各有优劣。以CYP2C9基因检测产品为例，查询NMPA网站现有CYP2C9基因检测产品22个，包括POCT，其中技术最成熟、最普及的是荧光PCR，占比55%。近5年间，研发多位点基因检测产品的公司越来越多，可以实现多个心血管或者精神类用药的基因在一个反应体系中一次检测即可得到结果，同时也能保证检测质量，降低检测成本，缩短报告周期。以下这4种方法学是目前较为常用的：（1）核酸质谱：结合质谱技术的高灵敏度、高特异性，基因芯片技术的高通量和低成本的特性，单次反应最多能达到40重检测，是药物基因组学以及肿瘤基因突变检测领域常用的技术；（2）毛细管电泳技术：利用一代测序平台，其原理是MPCR，利用PCR引物扩增，通过毛细管电泳在一代测序平台跑胶，可以检测SNP；（3）高通量荧光定量PCR：基于12K Flex OpenArray平台，属于纳升微流体技术，可以用于超小体积的液相反应；（4）多色/多重熔解曲线分析：基于现有的荧光定量PCR平台，一管反应可以实现多靶标的扩增。需要指出的是，目前的测序成本和费用持续降低，全基因组测序仅需525美元，相当于0.006美元/Mb。所以未来单位点、多位点检测技术，慢慢可能会被高通量测序技术取代。未来的难点在于如何在海量数据中，以最快的时间，依靠生信分析的设备、人员，获取更高质量、更精准的数据。

6. 心血管精准用药指导策略：如果药物基因组学是个体化用药的左膀，那么代谢组学(治疗药物浓度监测，结合代谢物的液相色谱串联质谱技术)就是个体化用药的右臂，联合药物基因组学、代谢组学等多组学探索标准化的个性化用药临床路径也成为目前研究的热点。2022年7月27日，国家卫健委、国家中医药管理局联合下发了《关于进一步加强用药安全管理提升合理化用药水平的通知》，指出要通过血药浓度监测、基因检测等，识别用药风险，制定个体化用药方案，优化药物品种选择，精准确定用药剂量。

二、ApoE和SLCO1B1基因多态性检测

1. 高脂血症流行病学及治疗药物：根据《中国血脂管理指南（2023年版）》数据表明，中国成人血脂异常患病人数高达40.4%，人群血清胆固醇的升高将导致2010-2030年期间我国心血管病事件增加约920万，我国儿童青少年高TG血症患病率也有明显升高，预计未来中国成人血脂异常患病及相关疾病负担将继续加重。绝大多数国家和地区的血脂管理指南均推荐降低LDL-C作为降脂治疗的首要的目标。目前把抑制胆固醇合成的他汀类药物作为指南推荐的首选，只有当他汀类药物治疗后LDL-C不达标时，考虑联合胆固醇吸收抑制剂和/或前蛋白转化酶枯草菌素9（PCSK9）抑制剂进行治疗。

2. 他汀类药物的个体化用药：相关研究表明，中国人群服用他汀类药物发生副作用的风险比欧美人群高10倍，而且服用他汀类药物后的疾病发生率也高达7%-29%，同时部分患者应用他汀之后的血脂控制状况仍然不能令人满意，加大药物剂量有时达标率也不是特别理想。他汀类药物的安全性、有效性的个体差异很大，受患者的基因、年龄、性别、合并用药等多种因素影响，从他汀精准用药的角度考虑，遗传因素是需要特别关注的问题。参与他汀类药物肝脏代谢的关键性转运蛋白如阴离子转运多肽（OATP1B1）（SLCO1B1编码）及载脂蛋白E（ApoE编码）的基因多态性可影响他汀的血浆及肝脏浓度，从而影响他汀类药物的安全性和疗效。

3. SLCO1B1基因参与他汀药代动力学：SLCO1B1基因在人群中已发现超过40个突变位点，其中4号外显子SLCO1B1 c.388 A＞G（rs2306283）和5号外显子SLCO1B1 c.521 T＞C（rs4149056）突变率高，且意义显著。当388、521这两个位点发生基因突变，会导致有机阴离子转运多肽的活性下降，使血液里的他汀转运到肝脏的转运代谢能力不足，导致血药浓度的升高，对细胞尤其是线粒体产生毒性，从而影响骨骼肌产生毒性，最终引起横纹肌溶解或者肌痛的不良反应。SLCO1B1 c.388A＞G和c.521T＞C共形成4种单倍型1*a（c.388A+c.521T），*5（c.388G+c.521C），1*b （c.388G+c.521T），*15（c.388A+c.521C），4种单倍型构成9种不同基因型。521位点突变会导致中度或者重度横纹肌的溶解或者疾病的风险，而这种风险也提示可能需要使用较低或者是中等剂量的他汀进行个体化的用药。

从PharmGKB网站上也可以查询到，2022年CPIC更新中，7种他汀SLCO1B1基因CPIC LEVEL均为A级，对于不同的他汀类药物，阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀等临床注释的等级也都升到了A级，这提示SLCO1B1基因的变异可能导致肌病的风险升高，他汀类药物转运到肝脏的减少，增加血浆中的浓度。临床药物基因组学实施指南（CPIC）2014就指出，521位点突变提示要使用低剂量辛伐他汀或者其它他汀并应常规监测肌酸激酶，在2022版指南进一步说明了，当出现521位点的基因突变，这提示他汀属于中风险或者高风险等级，在运用不同的他汀强度治疗的情况下，应该怎么选择，风险等级的制定是根据SLCO1B1 c.521 T＞C多态性进行分类。

4. 几项国内外的既往的研究：（1）发表在2010年《柳叶刀》上非常经典的SEARCH研究，其纳入到12,064人参与的辛伐他汀预防心梗的随机对照试验，研究发现其中有一个SNP和疾病显著相关且与rs4149056 （c.521 T＞C）连锁遗传，通过这个结论可以发现，SLCO1B1基因CC纯合肌病6年累积发生率为18%，而CT基因型的6年肌病累积发生率为3%，TT纯合的6年肌病累积发生率仅为6%，预示着基因产生突变和肌病风险紧密相关。（2）研究涵盖了14项荟萃分析（美国或加拿大3，英国5，荷兰1，意大利1，巴西1，日本1，捷克1，中国1），包括3265名肌病患者和7743名对照组。不管纯合、突变个体和野生、杂合个体比较，还是分别比较或者基因频率之间碱基突变进行的比较，都认为当521位点发生突变会导致他汀诱发的肌病风险更大。另外一个结论，当受试者接受辛伐他汀或者瑞舒伐他汀的时候，与521TT相比，521CC+TC与肌病变风险增加相关。（3）发表于2018年、由杜克大学精准医学中心的研究团队在国际首次颁布应用SLCO1B1基因检测指导他汀重启的前瞻性随机对照研究，纳入了159例明确有他汀肌病史的患者，分成常规的对照组和实验组，实验组用基因检测进行指导之后，分为突变组和非突变组。非突变组的患者已经停药，重启他汀使用没有服过的他汀，突变组指导服用瑞舒伐他汀、普伐他汀或氟伐他汀的任何一种，常规治疗组服用之前没有用过的他汀。主要终点事件：重启他汀治疗的依从性；次要终点事件包括：重启他汀的患者例数，LDL-C水平以及患者对他汀治疗的看法。通过结果可以看到，与常规治疗组相比，GIST组的新他汀处方更多，治疗3个月时的LDL-C水平更低，虽然没有完成主要终点事件的预期，没有证实基因检测可以改善他汀用药的依从性，但是研究证实基因检测能够帮助更多有肌病史停药的患者重启他汀治疗，并更有效地降低LDL-C水平。

5. ApoE基因参与他汀的药效动力学：ApoE基因与他汀类药物的降脂效果密切相关。ApoE基因主要有两个SNP，分别为ApoE c.388 T＞C，ApoE c.526 C＞T，可以形成三种单倍体，分别是ApoE2、ApoE3和ApoE4，有研究报道显示他汀的降脂疗效欠佳和ApoE4紧密相关，疗效明显低于ApoE2、ApoE3。上文提到了心血管疾病的各项危险因素被认为和脑部健康息息相关，而ApoE基因除了和他汀类药物的疗效相关以外，也被证实和阿尔茨海默症（AD）发生紧密相关。在AD的风险基因中研究最多的就是ApoE基因，发现ApoE4参与调节β-淀粉样蛋白的生成，也影响星型胶质细胞和神经元对蛋白的清除。通过PharmGKB网站查询，可以看到临床注释，针对阿托伐他汀疗效CPIC LEVEL是D级，对阿尔茨海默症的临床注释为LEVEL3的级别，等级并不是特别高，分析可能与纳入研究的中国人群比较少有关。我国自己研究数据表明，中国人群的AD患者比全球患者高出了近20%，《中国阿尔茨海默病痴呆诊疗指南（2020年版）》、《阿尔茨海默病源性轻度认知障碍诊疗中国专家共识2021》把ApoE纳入到检测范围，不管阿尔茨海默症还是轻度的认知障碍，ApoE基因的检测都会起到非常重要的作用。

综上所述，ApoE基因的3种单倍型两两组合，可以组合成6种基因型别：E2/E2、E2/E3、E3/E4、E4/E4、E3/E3、E2/E4，主要是E4基因的突变，不管杂合突变还是纯合突变，都会影响他汀的降脂疗效以及患阿尔茨海默症的风险，倍数逐级增加。

6. 国内外既往研究：（1）2011年的一个研究结果显示，ApoE基因型与高血脂症临床年龄以及降脂疗效显著相关，ApoE4与高血脂症临床发病年龄靠前相关，ApoE4基因型携带者LDL降低率11.8±2.3%，降脂疗效低于非ApoE基因型携带者（LDL降低率19.98±2.3%，p＝0.003）。（2）2019年我国的一篇研究，纳入1002例来自武汉大学中南医院、武汉市中心医院和山东省立医院的血脂异常的ASCVD患者，均接受药物阿托伐他汀（10mg/d）或瑞舒伐他汀（5mg/d）治疗至少4周，并检测ApoE E2/E3/E4等位基因型。结果发现，E4组LDL-C基线最高，E2、E3、E4之间有显著性差异；与其他表型相比，E2表型对TG、总胆固醇（TC）和LDL-C降低百分比有更好的反应。（3）首都医科大学贾建平教授团队在《英国医学杂志》发表了一篇健康生活方式延缓记忆衰退的文章。从2009年开始，有2.9万人参与，进行ApoE基因的检测，研究目的是确定一种最佳的生活方式来防止老年人的记忆丧失，健康的生活方式包括6条：健康饮食、体育锻炼、社会接触、认知活动、戒烟限酒，根据这几项分成几个组别，占4-6项是良好的生活方式组，占2-3项为平均的生活方式组，0-1项是不良生活方式组，通过分组人群进行比较，结果发现，即使是ApoE基因携带者健康的生活方式也能减缓记忆衰退。这项研究说明，基因检测报告解读有风险的时候，通过健康的生活方式，也可以改善、减缓记忆衰退的风险。（4）中国医学科学院阜外医院他汀用药基因检测从2016年开展，至今已经检测了7万多例，简单汇总4个位点的基因频率，与gnomAD官网数据进行比较，发现数据基本符合已经报道的东亚人群数据，中国医学科学院阜外医院统计数据报道人数更多、更完整，期待在最短的时间内发出文章、更新数据。蔺亚晖副研究员团队发表了一篇文章，针对冠心病患者ApoE基因型与脂蛋白谱的相关性，纳入了360例冠心病人群，进行基线资料、临床生化指标的收集，一些临床指标包括核磁、疾病严重程度的Gensini评分、病变支数等等，进行统计分析。

临床研究发现，（1）他汀治疗后的三组ApoE基因型之间LDL-C水平没有显著差异；（2）NMR检测的脂蛋白颗粒浓度及其组成说明E2和E4组之间的冠心病风险不同；（3）E4组具有更高浓度的致动脉粥样硬化LDL亚类颗粒和血脂成分，而E2组相反。研究结果表明，除他汀类药物外，还应为E4携带者设计个体化和强化的降脂方案。

三、创新源于实践，实践推动创新

检验科需要在最短的时间，把最准确的结果呈现给临床。在样本量越来越大的情况下，如何保证工作效率和检测结果的准确性？笔者认为应该从以下几方面入手：（1）对设备的更新：比如，他汀的药物基因组学检测需检测4个位点，现有的试剂盒都是4个反应，1个96孔板上只能检测24个样本，当每天有100-200个样本的时候，工作量非常大，我们从开始的手工排枪或者单枪加样，尝试去使用新的设备，如可调间距电动移液器，可实现节约成本、提高工作效率；（2）自动化平台：自动化平台在新冠期间发挥了巨大的作用，在后疫情时代，可以在现有工作站的平台基础上去开展现在所有的分子检测项目，当然需要和工作站的程序开发人员沟通开发新的一套程序；（3）研发结果判读软件：从2016年起，我们与中国医学科学院阜外医院信息中心共同研发分子定性项目重复开单提醒软件，并在2019年更新到V2.0版本。当患者曾经在我院做过他汀药物基因组学检测或者从一个病房转到另一个病房又开具一套检测，开医嘱的时候软件的医生界面会提示该患者已经做过相同的检测，并提示检测时间和基因型。让医生第一时间知道患者检测结果，第一时间进行主动的调药，把处方开药前置，检测关口前移。