单细胞测序技术在慢性乙型肝炎临床诊疗中的应用价值
欧启水，医学博士，福建医科大学附属第一医院副院长，主任技师、教授、博士生导师。主要从事临床免疫学检验与分子生物学检验工作。主要学术兼职为中华医学会检验医学分会副主任委员，中国医师协会检验医师分会副会长，福建省医师协会医学检验科医师分会会长，创建了福建省检验医学重点实验室、福建医科大学基因诊断研究中心并担任主任，任福建省临床免疫学检验临床医学研究中心主任，系国家卫生健康突出贡献的中青年专家，福建省特级后备人才，福建省科技创新领军人才。主持完成国家自然科学基金重点项目等国家级、省级课题20余项。在国内外杂志上发表论文100余篇。主编、副主编和参编了人民卫生出版社的《临床免疫学检验》等教材和专著10余部。持有国家发明专利4项，以第一完成人获得福建省科技进步奖一等奖2项，三等奖2项，曾获得福建青年科技奖、福建运盛青年科技奖等奖项。
廉芳，在读博士研究生。就读于福建医科大学第一临床学院，攻读临床检验诊断学专业博士学位。主要研究方向为慢性乙型肝炎免疫细胞功能与分子作用机制的研究。
【摘要】全球范围内感染的慢性乙型肝炎（CHB）是一种严重影响健康的疾病，可引起广泛的肝脏疾病，包括慢性肝炎、肝硬化和肝癌等。到目前为止，尚无清除感染者体内乙型肝炎病毒（HBV）的方法。肝脏的病毒防御系统主要取决于复杂的免疫细胞网络。因此，绘制CHB患者肝脏的免疫细胞图谱可发现新的治疗靶点，干预疾病进程。随着单细胞测序技术的成熟，对CHB临床治疗和预后结局的应用前景广阔。本文论述了单细胞转录组测序、单细胞染色质可及性测序和空间转录组测序在CHB免疫细胞的应用。
【关键词】单细胞测序； 慢性乙型肝炎； 免疫细胞
乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染呈世界范围内流行，2019年全球约有2.96亿慢性感染者，150万新发HBV感染者[1]，尤其是在亚洲和非洲的地区高发。自1982年乙肝疫苗问世，虽能够有效预防HBV感染，但对于感染者彻底清除体内的HBV仍没有很好的治疗方法。大多数慢性肝病患者没有明显症状，但随着病情的发展，最终可导致肝硬化或者肝癌的发生。近年来，基于基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等高通量单细胞测序技术的发展，疑难疾病将可以从器官组织的单细胞水平异质性、分化和细胞间相互作用等方面进行深入的研究探讨。本文重点讨论单细胞测序技术在慢性乙型肝炎中的应用。
一、肝脏与主要的免疫细胞
肝脏是一个复杂的器官，由不同的细胞类型组成，具有多种生理功能，包括消化、合成、代谢和解毒。同时它也是一种重要的前哨免疫器官，在抗感染、免疫自稳和抗肿瘤作用中发挥着至关重要的作用。肝脏检测经肠道进入人体的细菌、病毒和大分子，从而捕获并清除，因此相比其他器官或组织更容易接触到微生物和内毒素。肝脏通常保持耐受性免疫状态，以防止不必要的免疫激活和过度的自身免疫反应[2]。然而，肝脏这种耐受性允许病毒、寄生虫和其他微生物在机体长期存在，也可造成机体长期损害[3, 4]。在急性和慢性感染期间，肝脏从耐受状态转变为主动免疫状态，并构成抵御入侵微生物的重要防线[5-8]。这种免疫力和耐受力之间的平衡对肝脏功能至关重要，在没有感染的情况下过度炎症会导致无菌性肝损伤、组织损伤和重塑；免疫力不足则会导致慢性感染和癌症[9]。肝脏参与众多免疫细胞群体之间的免疫调节，发挥独特的免疫功能优势。因此维护肝脏和机体的免疫平衡状态，是人类健康和生存的关键。
肝脏的防御机制主要取决于复杂的免疫细胞网络，包括库普弗细胞（Kupfer cell，KCs）、树突状细胞（dendritic cell，DC）、中性粒细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）以及B和T淋巴细胞[10]。
肝脏是人体中含有NK细胞数量最多的器官，约占肝内所有淋巴细胞的1/3到1/2[11-12]。通常固有性淋巴细胞在大多数其他组织中很罕见，在感染和组织病理学筛查中起着关键作用[13]。NK细胞利用自身靶向细胞的缺失，可促进细胞活化，产生IFN-γ细胞因子，释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性颗粒进行靶向杀伤细胞[11]。近年来有越来越多的研究表明，尽管NK细胞是固有性淋巴细胞，但它们能够产生记忆。虽然不像经典淋巴细胞产生特异性记忆，但它确实会对特定病毒病原体的继发感染产生更快速、更强的免疫反应[14-16]。常驻于肝脏中最多数量的巨噬细胞为KCs，35%肝脏非实质细胞和90%组织巨噬细胞是KCs。通过血液的流通，KCs细胞可检测到流经其细胞表面的任何异物，将数百万计的红细胞、血小板、免疫细胞以及突破屏障进入血液的少数病原体区分开来。目前对于KCs的个体发育了解得越来越清楚，KCs最初被认为是以骨髓来源的单核细胞形式存在，并分化为滞留组织高度特异的巨噬细胞[18]，但谱系追踪表明，如来自卵黄囊的脑组织小胶质细胞和肺组织肺巨噬细胞，可能在肝脏有局部复制[19]。
二、单细胞测序技术
对于传统测序技术，使用肝脏不同区域内大量和混合细胞群体进行研究，导致很难解释单个细胞、细胞与细胞之间在维持细胞稳态方面的独特性[20]。例如，全组织RNA测序，也称为“批量测序”，提供了每个样本的分子信号的平均值，该值代表位于同一样本内的不同细胞的混合RNA含量，因此受到细胞类型的显著影响，不能用于研究细胞异质性。随着高通量单细胞测序技术的发展，可以在单细胞水平上了解重要器官和复杂疾病的异质性、细胞分化和细胞间作用。
1. 单细胞转录组测序：单细胞转录组测序（single cell RNA-Seq，scRNA-seq）可以大规模表征单个细胞的完整转录组。这项测序技术通常流程是组织解离、单细胞捕获、细胞裂解和用细胞条形码标记mRNA，可以用最小的起始样本量进行测序分析。在许多研究中，scRNA-seq已被用于研究理解肝脏病理的表型和致病机制，并获得对疾病病理学和生物学新的见解[21-23]。scRNA-seq可与基因组、表观基因组、蛋白质组和代谢组等多组学同时进行分析[24]，可以评估单个细胞的功能状态，以无偏倚的方式识别和发现新的细胞类型；也可用于构建细胞谱系的分化轨迹并绘制细胞发育谱系的分子图谱。与传统测序相比，scRNA-seq在未知序列信息的情况下，有更强发现新基因能力，在罕见基因突变和转录产物鉴定中具有更高的灵敏度[25]。此外，scRNA-seq还可避免聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增的偏差。由于在许多情况下，测序需要PCR扩增，其局限性在相同的体系条件下，不同的核酸序列具有不同的扩增程度，导致扩增后的核酸序列与扩增前的核酸序列不同。scRNA-seq可以避免PCR扩增要求，因为它计算的是扩增前核酸序列的实际值，而不是扩增后核酸序列的相对丰度[26]。
实现高通量单细胞捕获有两种策略。一种是微流控芯片技术，以10X基因组学[27]、Drop-seq[28]和in Drop[28]为代表。另一种是微孔板技术，以BD Rhapsody[29]和Seq Well[30]为代表。基于高通量微滴的微流体技术用于通过微流体芯片捕获油滴中的单个细胞，目的是为不同的细胞设置不同的条形码序列。在构建文库时，具有相同条形码序列的核酸分子被认为来自同一细胞。因此，可以一次为数百个细胞构建一个数据库，同时简单地区分它们。微孔板技术包括将单个细胞和磁珠混合到微孔中，磁珠的序列结构与10X基因组相似，可以捕获游离Mrna的poly A尾部[31]。这两种方法的优点是细胞通量高、循环快、成本低、细胞捕获效率高和仪器操作简单。
scRNA-seq有以下局限性：首先，对细胞活力和质量的要求高，对随后生物信息学分析至关重要，而获得合格的单细胞悬液有时很困难。其次，scRNA-seq仅限于检测RNA水平的表达，不能提供蛋白质表达的信息[32]。从RNA到蛋白质的翻译经过一系列复杂的调控处理，包括转录后修饰、RNA剪切、RNA稳定性和蛋白质降解，这可能都会导致RNA和蛋白质水平之间的差异。因此，为了全面了解单个细胞的转录组和蛋白质组，将scRNA-seq与单细胞蛋白质的技术相结合至关重要。第三，这与批量测序相比，scRNA-seq价格昂贵。最后，scRNA-seq的数据分析是耗时长，需要专业知识进行生物信息学分析。
2. 单细胞染色质可及性测序：单细胞染色质可及性测序（single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin using sequencing，scATAC-seq）是一种在单细胞水平上检测染色质开放区和识别调控区的新技术[33]，染色体开放区与相应转录因子或其他调控蛋白的结合直接影响细胞内基因复制和转录的发生。利用Tn5转座酶切割染色质的开放区域，并应用测序适配器进行高通量测序[34]。scATAC-seq是基于GemCode技术构建的微流体平台。首先，Tn5转座酶进入细胞核，优先在染色质的开放区域切割DNA，同时在DNA片段的末端添加测序引物；其次，条形码凝胶珠和单细胞核被包裹在油滴中。每油滴中凝胶珠溶解，细胞核被裂解释放碎片化的DNA片段。接着，条形码序列被添加到每个细胞核的DNA中，液体油层被破坏后，条形码序列标记的DNA用于文库构建；最后，在Illumina测序平台上对文库进行测序，可以一次性获得大量的单细胞DNA染色质开放区数据。
3. 空间转录组测序技术：cRNA-seq能够测量数千个细胞的全基因组表达模式，但这种技术需要从组织解离细胞，使其每个细胞失去了空间背景[35, 36]。将scRNA-seq与标志基因的原位表达相结合可以推断原始组织的空间基因表达位置，这种方法被应用于解释胚胎发育过程中的空间基因表达特征[37, 38]。肝脏是一个高度复杂的器官，具有不同的空间特性。无论是健康状态还是疾病状态，深入了解空间异质性对于理解肝脏的结构和功能至关重要。空间转录组（Spatial transcriptomics，ST）技术最大优点是组织切片的空间Mrna表达高分辨率模式，避免需组织解离造成的缺陷。将肝脏组织切片的ST数据与肝脏分带知识相结合[39, 40]，可以对肝脏微环境和肝脏大环境中包含混合小细胞的结构进行空间注释。因此，ST在组织切片中的应用可以帮助识别新的肝脏结构在肝脏中发挥重要的作用。
三、单细胞测序技术在慢性乙型肝炎免疫细胞的应用
HBV是一种嗜肝病毒，通过肝脏免疫和炎症反应诱导肝脏损伤，在机体内建立持久和慢性感染[41]，确切的发病机制尚不清楚。因此，迫切需要解决这一问题，HBV感染的结果是由病毒和宿主免疫反应之间的相互作用决定的。外周血单个核细胞是多种免疫细胞的混合群，在固有性免疫和适应性免疫中发挥动态作用。
随着单细胞测序技术的发展，试图寻找慢性HBV感染、CHB进展为失代偿性肝病或肝细胞癌等相关的特异性细胞类型和相关的调控途径。在慢性HBV感染中，表型NK细胞和功能型NK细胞有发生变化[42]，NK细胞表现出强烈的免疫反应，产生IFNγ能力下降[43]。Xu[44]通过scATAC-seq获得了NK细胞簇，其中1220个来自慢性乙型肝炎患者的外周血单个核细胞（CHB-PBMC），占65.17%；另外652个来自健康人群对照的外周血单个核细胞（NC-PBMC），占34.83%。157个峰在CHB-PBMC中特异性表达，在炎症反应、病毒感染和细胞凋亡途径中富集。同时还对NK细胞进行聚类分析，NC组和CHB组比较，获得NK细胞差异TF基序。在NK-0中发现了一个特异性的染色质开放区结合的转录因子，它与乙型肝炎的发展密切相关。NK-1中有10个特异性表达的TF基序。因此，CHB中特异性上调的11个基序对CHB患者NK细胞功能障碍提出新的机制。在CHB组中几乎表达差异的TF基序都包含四个家族，包括Fos相关因子[45]、NF-kappaB相关因子[46, 47]、Jun相关因子[48, 49]和AP-1相关因子[50]。
Zhang[51]在乙型肝炎感染的不同疾病状态下，通过scRNA-seq检测肝脏和血液不同免疫细胞亚群的相互作用。该研究强调了耗竭的CD8+T（Tex）细胞、调节性CD4+T细胞和FCGR3A+巨噬细胞之间的相互作用。介导HLA I类分子及其受体（如白细胞免疫球蛋白样受体）可导致HBV稳定期的免疫失败，可能有助于指导免疫治疗。为了解HBV感染KCs的功能，De[52]通过流式细胞术对C57BL/6小鼠的CD45+CD64+F4/80+肝细胞分选后，进行scRNA-seq分析。在肝脏滞留的巨噬细胞，使用IL-2处理CD45+F4/80+CD11 bint和TIM-4+CD206+ESAM+细胞，依据交叉反应递呈病毒粒子或肝细胞中所含的病毒抗原不同，鉴定出两个不同的KCs簇。因此，KCs的特定亚群被认为是导致HBV特异性CD8+T细胞的肝细胞启动的调节信号通路，这些细胞在IL-2外源性治疗后，可获得致病效应和抗病毒功能。
慢性HBV持续感染是癌症的主要原因之一[53, 54]，调控途径的潜在阻断点可抑制CHB转为癌症。病毒特异性CD8+T细胞有助于控制乙型肝炎病毒感染和肝损伤[55]，Xu[44]对7个T细胞亚群进行生物信息学分析，确定T-3是与慢性乙型肝炎关系最密切的聚类。在信号通路中富集的CHB特异性表达的峰值用于差异表达分析，结果显示由差异峰相关基因YWHAQ富集的TF基序MA0846.1 FOXC2在CHB组中显著上调，而YWHAQ的mRNA表达水平与肝细胞癌患者的预后显著相关[56]。推测YWHAQ在T-3细胞中异常表达，导致基序MA0846.1 FOXC2的上调和FOX因子的增加。Xu[57]报道，癌症治疗的新靶点FOXC2可能通过促进细胞增殖和侵袭在癌症中发挥重要作用。
四、问题与展望
CHB给感染者带来沉重的生理、心理和经济负担，全球学者致力于CHB精准的诊疗研究，目前还没有彻底治愈HBV感染有效的方法。使用高通量单细胞测序技术，加深对肝脏生理或病理结构的理解，绘制肝脏和外周免疫微环境的免疫细胞图谱，将有助于进一步了解人类HBV感染的发病机制，而且有助于发现新的免疫靶点或开发临床治愈慢性乙型肝炎的新治疗策略。针对患者的治疗可选择多样化治疗方案，实现个体化精准医疗。然而，单细胞测序技术还存在一些局限性，如扩增时需要尽量提高覆盖率、降低错配率和减少噪音影响，同时建立更完善的生物信息算法等等。总之，单细胞测序技术的应用将大大促进CHB研究进一步发展。
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