心肌标志物检测临床应用与发展方向
王丹丹，医学博士，副教授，硕士研究生导师。现任中国医科大学附属盛京医院检验科生化专业组组长，加拿大Dr. Everett Chalmers 地区医院访问学者，辽宁省免疫学会临床病原生物学与免疫分会委员，辽宁省生命科学学会分子生物学检测与精准诊断专业委员，主持和参与省部级课题3项，主要从事临床生化、免疫学等专业检验工作。
心肌标志物是反映心脏疾病的生物化学指标，在心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的风险分层、诊断、预后、疾病监测、治疗剂量确定和治疗靶标鉴别中发挥重要作用。自1954年，Karmen等人[1]首次报道血液中可检测到坏死心肌细胞释放的天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase，AST）以来，越来越多的具有更好临床敏感性和特异性的心肌标志物被相继发现并应用于临床，心肌标志物检测的价值日益凸显，为心血管疾病的临床诊疗提供了重要依据。正确合理的使用这些生物标志物，能够对临床决策产生重要的指导作用。本文重点对目前临床上常用的心肌标志物在应用过程中所面临的机遇和挑战进行综述。
一、常用心肌标志物的种类与临床应用
心肌标志物的检测在心血管疾病诊疗当中是不可或缺的，尽管有大量的新型心肌标志物出现，但仅有少数标志物是目前临床常规使用的。理想的心肌标志物应具有在心肌损伤后快速释放且浓度高以利于早期诊断、半衰期长以便于晚期诊断、在非心肌组织中不存在并且在健康个体中含量极低从而具有高度特异性、测量方法经济高效、操作简单、检测时间短、检测准确性高等特点。临床上常用的心肌标志物包括：
1. 天门冬氨酸氨基转移酶：天门冬氨酸氨基转移酶是一种催化氨基转移反应的酶类，是首个用于心肌损伤诊断的生物标志物，常在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）发生6-12小时后升高，并于24-48小时达到峰值。由于该酶在人体组织中分布广泛，除心肌外，还存在于肝脏、骨骼肌和肾脏等组织中，不具有特异性，目前临床上已不建议将其作为AMI的诊断指标。
2. 乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LD）及其同工酶：乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶，广泛分布于心肌、骨骼肌和肾脏等人体组织中。乳酸脱氢酶具有5种同工酶，其中LD1和LD2（尤其LD1）在AMI等心脏疾病中明显升高，较总LD更为敏感。乳酸脱氢酶在AMI时升高时间较晚，但持续时间较长，可以达到10-12天，故可用于病程较长且暂无条件进行肌钙蛋白检测的疑似AMI患者的诊断和监测。
3. 肌酸激酶（Creatine kinase，CK）及其同工酶：肌酸激酶主要存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，是由M和B两个亚基构成的二聚体，其中CK-MB同工酶主要分布在心肌中。CK-MB是上世纪80年代应用最为广泛的反映心肌损伤的实验室指标，其升高幅度大小可以一定程度上反映梗死的范围，并可用于判断溶栓效果，但CK-MB的敏感性和特异性仍不及肌钙蛋白。
4. 肌钙蛋白（Troponin，Tn）：肌钙蛋白是一种异三聚体复合物，包含TnC、TnT、TnI三个亚基，在骨骼肌和心肌中均有表达，是肌肉兴奋收缩耦联中重要的结构蛋白[2]。目前，评估血清中TnT、TnI水平是冠状动脉血管和心室重塑相关心肌梗死早期诊断中最有价值的生物标志物之一[3, 4]。TnT和TnI在AMI发生3-6个小时即可升高，并在10-24个小时达峰，随后缓慢下降。TnT由于相关片段的进一步酶解还可以在第4-5天出现二次增高的双峰现象。由于心肌细胞中的心肌肌钙蛋白I（cTnI）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）由单独基因编码，与骨骼肌细胞中的sTnI和sTnT完全不同，因此具有高特异性的特点，可用于确定临床诊断急性心肌损伤的准确性、对未及时应诊患者的后期回顾性诊断、区别同时有着骨骼肌和心肌损伤时的心肌损伤程度、溶栓治疗再灌注的疗效评估、心脏手术时对心肌损伤程度和修复的评估等[5]。
5. 肌红蛋白（Myoglobin，Mb）：肌红蛋白主要存在于横纹肌（心肌、骨骼肌）细胞中，是一种氧结合蛋白，分子量较小，极易从损伤的肌细胞中释放出出来，因此是一种在心肌损伤早期即可出现的生物标志物，一般在AMI发生1-3个小时后即可升高，并在6-12小时达到峰值，18-30个小时可恢复至正常水平。但由于肌红蛋白不仅存在于心肌中，骨骼肌损伤也可造成肌红蛋白的升高，因而肌红蛋白的临床应用特异性不高，而且其窗口期很短，不能用于疾病发生后的回顾性研究。
6. 心型脂肪酸结合蛋白（Heart-type fatty acid binding protein，H-FABP）：心型脂肪酸结合蛋白是一种比肌红蛋白分子量更小的心肌损伤标志物，而且在正常人体外周血中的浓度更低，因此当发生急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）时会有明显的增高，可以在ACS的早期诊断中发挥重要作用[6]。此外，H-FABP还可用于预测心肌梗死面积，对于急性ST段抬高型心肌梗死患者，其升高速度比肌钙蛋白I更快[7]。但H-FABP作为一种心肌标志物同样存在着短板，由于它主要从血液循环中经肾脏排出，因此肾功能不全患者的结果偏高。此外，当发生骨骼肌病变时，H-FABP同样会增高[8]。
7. 肌球蛋白结合蛋白C（Cardiac myosin binding protein C，cMyC）：肌球蛋白结合蛋白C是一种新的心肌损伤标志物[9]，同肌钙蛋白一样仅表达于心脏，且含量更为丰富[10]，因此，当发生急性心肌梗死后，其升高速度较肌钙蛋白T更快[11]。
8. 脑钠肽（Brain natriuretic peptide，BNP）和氨基末端脑钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）：脑钠肽是由日本学者在1988年发现的一种由心肌细胞合成的激素，当心功能不全，心肌扩张以及血容量增加时会释放。氨基末端脑钠肽前体是脑钠肽前体水解生成BNP过程中的产生的另一个片段，比BNP的半衰期更长、稳定性更好[12]，但由于代谢清除途径为肾脏，其检测结果会受到患者肾功能和年龄等因素的影响。研究证明BNP和NT-proBNP在心血管疾病中的发展及预后中起重要作用，它们是国内外心衰指南均推荐的心力衰竭首选生物标志物[13]。
9. 超敏C反应蛋白（Hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）：C反应蛋白是由肝细胞合成的一种炎症标志物。hs-CRP作为一种非特异性的炎症标志物，在没有炎症（如感染或肿瘤）的情况下，能够可靠的评估心血管疾病的风险[14]。hs-CRP参与血栓形成、动脉粥样硬化等过程，有望在急性冠脉综合征的早期诊断中成为可靠的血清标志物。
二、心肌标志物临床应用中面临的挑战
1. 不同检测平台结果一致性问题：测定心肌标志物的检测体系有很多，这些检测体系所使用的捕获抗体和检测抗体、发光系统以及反应体系存在差异，抗体可能指向位于抗原分子上的不同表位，因此，可能会从不同的系统中获得不同的结果[15]。并且这个问题可能会影响对报告数据的解释，从而为临床和实验室带来实质性问题。除了测定中使用的不同抗体的反应性导致差异之外，对于心肌标志物测定的校准没有使用一致的参考物质，是不同检测平台之间检测差异的另一个主要原因。目前肌钙蛋白检测的唯一的一级参考物质为NIST SRM 2921，使用最终可以溯源到该参考物质的不同检测平台检测肌钙蛋白，可以将不同平台检测结果差异从88%降至16%[16]。
肌红蛋白测定同样也存在标准化问题[17]。对5种不同的商业肌红蛋白测定方法的多中心评价表明，一些测定结果彼此之间存在显著差异。不仅在不同公司的系统之间，而且在同一公司的分析仪之间，都观察到广泛的结果差异，这些差异直接源于缺乏公认的肌红蛋白参考物质和高质量的参考方法的标准化问题[18]。IFCC C-SMCD正在进行一项专门的工作，以选择一种二级参考物质，以便协调不同测定法的肌红蛋白结果[19]。
CK-MB检测标准化问题也在解决过程中。AACC委员会关于CK-MB质量分析标准化的工作使该项目不同方法间系统误差从40%降低到了13%[20]。由欧洲共同体标准、测量和测试计划支持的第二个项目则为已有的CK-MB BCR 608标准物质分配了质量浓化值[21]。
2. 不同检测系统的测量准确性问题：不同商品化的心脏标志物检测试剂盒的检测不精密度也不一致。IFCC C-SMCD建议在心肌梗死判定极限下，肌红蛋白的总不精密度（用变异系数CV表示）应小于6%，CK-MB质量和肌钙蛋白应小于10%[22, 23]。测量精密度不佳的检测体系可能会增加误导性结果的风险，比如假性增高的结果导致的不必要的追加检查和医疗行为，或者报告了错误的正常结果，导致临床的不作为和排除疾病。因此临床实验室在实施和评估用于心脏标志物测定的新检测方法时，应仔细考虑不精确性对临床决策的影响。
3. 不同检测系统抗干扰能力问题：心肌标志物多采用免疫学的方法进行测量，任何抗原-抗体反应均不可避免会出现假阳性或假阴性。尽管目前很多商品化试剂盒已预先进行了抗干扰的处理，但仍无法完全避免。由于很多心肌标志物浓度很低，稍有问题就会对检测结果产生明显的影响，尤其是对低水平结果，可能会导致不同的临床决策。当出现与临床不符疑似存在干扰的结果时，临床实验室可通过倍比稀释、添加异嗜性抗体阻断剂或更换其他检测系统复测等方法确定是否存在干扰。
干扰可以根据来源分为内源性和外源性两种，内源性干扰多是由于患者存在黄疸、碱性磷酸酶浓度过高、异嗜性抗体、自身抗体、巨肌钙蛋白复合物、口服生物素等情况，而外源性干扰则可能是由于标本本身异常如溶血、存在纤维蛋白凝块、标本保存不当或检测体系存在异常等原因。
分析前阶段如样本储存时间和温度对待测物浓度的影响应受到临床实验室的关注。样本放置时间过长可能会导致检测表位的降解，对采用不同抗体对的实验方法的研究表明，使用识别分子中心部分的抗体的检测方法显示出最好的稳定性，而如果其中一个夹心抗体识别分子的羧基或氨基末端部分，由于这些部分更容易被蛋白质水解则稳定性最差[24]。因此，cTnI的体外稳定性似乎与方法有关。
标本类型同样是导致检测结果差异的影响因素之一。一般来说，虽然EDTA血浆可用于cTnT测定，但它在少数cTnI系统中被允许使用。EDTA可以分裂钙依赖的cTnT-cTnI-cTnC复合物和cTnI-cTnC复合物，从而降低cTnI分析的浓度[25]。另一方面，肝素可能与不同形式的肌钙蛋白结合从而在不同程度上降低其免疫反应性，这与测定表位和样本管中的肝素浓度相关[26-28]。因此每个实验室在考虑切换到血浆检测时，必须对抗凝剂的使用进行彻底的研究和验证。
4. 临床医生诊断策略的选择问题：如何对疑似心肌损伤患者选择最合适的心肌标记物使用策略和采样频率同样是临床的关注点之一。欧洲心脏病学会和美国心脏病学会发表的共识文件对使用标志物检测心肌坏死提出了具体建议[29]。心肌肌钙蛋白被认为是目前可用的诊断心肌损伤的生化标志物中最具心脏特异性和敏感性的。临床实验室应根据当地情况和测试结果的使用方式，为疑似急性冠状动脉综合征患者制定诊断策略。如采取用两种标记物的组合策略：一种是快速上升的标记物，如肌红蛋白，另一种则是需要更长的时间上升但特异性更高的标记物，如心肌肌钙蛋白，以便在症状出现后的早期和晚期寻求治疗的患者中检测出心肌梗死[22, 30]。使用这一策略，建议在就诊首次采血后的第4、8、12小时后再进行检查[22, 31]。这种同时检测两种标记物方法可以将肌红蛋白在排除心肌梗死方面的高预测性与肌钙蛋白单一阳性结果的诊断能力联系起来，达到兼顾临床效率和成本效益的目的。
三、心肌标志物的发展方向和展望
1. 心肌标志物临床应用范围的扩展：比如使用肌钙蛋白测定来尝试研究除缺血性心脏病以外的情况，在缺血性心脏病中可能存在轻微程度的心肌损伤，并且早期检测可能有所帮助[32]。一些研究已经证明了心肌肌钙蛋白能够确定新的病理生理状况和相关风险的存在[33]。
2. 疾病早期标志物的进一步开发：疾病早期标志物的检测可以使患者就诊时可靠地排除急诊室的心肌损伤，并在诱导不可逆的心肌细胞损伤之前检测到心肌缺血[34]。由于临床的目标是维持微循环流动以预防轻微梗死，因此只有在坏死之前设置一个标志物以达到预防坏死的目的才能满足新的临床需求[35]。已有很多研究在寻找新的血清标志物，这些标志物在心肌缺血性损伤期间很早就释放出来，或者与冠状动脉斑块不稳定和破坏有关[36]。
3. 检测能力的进一步提升：对于多数心血管疾病，临床的快速诊断、风险评估、预后判断和及时治疗对于降低死亡率、控制病情发展十分重要。提升检验技术，使心肌标志物的检测能够更加快捷、准确，对于提升心血管疾病诊疗水平、增加社会效益与经济效益意义重大。
4. 心肌标志物检测量值溯源工作的进一步推进：标准化与量值溯源是当今检验医学发展的重要议题，标准化是一个非常系统化的工程，需要多方共同努力。
心肌标志物从最开始只能为心脏病专家提供回顾性检测心脏组织坏死的检测指标，比如肌酸激酶和乳酸脱氢酶，发展到20世纪下半叶，可以检测高特异性和高敏感性的肌钙蛋白和脑钠肽，逐步改变了心脏病患者临床管理的场景。在可预见的未来，随着分子研究水平的发展以及检验水平的提升,越来越多的生物标志物将被用于临床,使患者能够得到更精准的治疗。
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