核酸检测在儿童呼吸道感染性疾病诊疗中的临床应用价值
朱春梅，主任医师、副教授、硕士生导师。现任首都儿科研究所附属儿童医院呼吸科副主任。学术兼职：现担任中国医师协会儿科医师分会内镜专业委员会副主任委员、儿童呼吸专业委员会委员，中国妇幼保健协会微创分会儿科介入学组常委、中华医学会儿科分会呼吸学组呼吸微生态协作组副组长等。从事儿科临床工作26年，在儿童哮喘、反复呼吸道感染诊治方面积累了丰富的临床经验。在儿科核心期刊发表论文30余篇，SCI论文多篇。
呼吸道感染是危害儿童健康最常见的疾病。2016年，世卫组织（WHO）的数据显示[1]，在5岁以下儿童中急性呼吸道感染的死亡率为十万分之一。在一项对中国医疗机构儿童疾病构成的系统评价的调查显示[2]：住院儿童主要单病种为肺炎、上呼吸道感染和肿瘤；门诊儿童主要单病种为上呼吸道感染、支气管肺炎、支气管炎，急诊儿童主要单病种为呼吸道感染、抽搐待查和肺炎。综上，在我国门诊、急诊和住院的儿童疾病中，呼吸道感染疾病均为最常见的疾病，其中，肺炎占比第一，其次是上呼吸道感染。因此，要尤为重视儿童疾病中的呼吸道感染疾病的早期诊疗和预防。
一、常见呼吸道感染性疾病及病原体
急性上呼吸道感染是临床最常见的疾病，占儿科门诊患儿的60%以上，其中，90%以上患儿的感染由病毒引起，主要为流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒和混合感染。需要特别注意的是，病毒感染引起的疾病不需要使用抗生素，需谨防抗生素滥用事件的发生。急性气管支气管炎大多由病毒感染引起，儿童感染主要由呼吸道合胞病毒和副流感病毒引起，成人感染则主要由流感病毒引起，另外，在病毒感染后期可合并细菌、支原体、衣原体的感染。除以上疾病外，肺炎占小儿内科总住院人数的24.5%~54.2%，主要致病病原体有肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感及副流感病毒等，病毒、细菌混合感染较为常见。
柳叶刀在2019年的一项多中心国际病例对照研究中纳入1~59个月因严重肺炎住院的4232例及社区对照5119例病例[3]，分析儿童重症肺炎病原体的分布。结果发现病毒占所有病因的61.4%。所以病毒是儿童肺炎的主要病原体。儿童重症监护室（PICU）的一个调查研究显示[4]：呼吸道合胞病毒（RSV）、腺病毒(ADV)、人鼻病毒（HRV）、肺炎支原体（MP）等与呼吸道感染重症密切相关，并且重症的比例逐年增高[5]。我国另一项关于急性呼吸道感染流行病学的研究[6]，纳入397560名急性呼吸道感染（ARTIs）接受住院治疗的患儿，结果显示，25.7%的病例一种或多种呼吸道病原体呈阳性，阳性病例中的23.4%为混合感染或多重感染，其中最常见的就是流感与支原体的混合感染，及腺病毒与支原体的混合感染。由此可见我国病原体混合感染多发，呼吸道感染住院患儿混合感染的占比很高，相比单纯感染，混合感染治疗难度往往更大。
在一项研究纳入了312例下呼吸道感染住院的患儿，采集咽拭子后，应用多重核酸PCR检测分析呼吸道病原体的流行情况。其结果显示，25.96%下呼吸道感染患儿检出两种及两种以上病原体阳性，混合感染率排名前五的病原体为：肺炎支原体（MP）、百日咳杆菌（BP）、流感嗜血杆菌（Hi）、甲流病毒（IFV-A）、肺炎衣原体MC。此外，一项纳入1426例年龄在28d~14岁的急性呼吸道感染住院患儿，采集他们的静脉血，采用胶体金法检测分析呼吸道病原体的流行情况。结果显示：10%的急性呼吸道感染的患儿检测出两种及两种以上的病原体混合感染，双重感染为混合感染的主要类型，其中乙型流感病毒（IFV-B）+MP占比最高，其次为IFV-A+MP。由此可见，呼吸道感染住院患儿混合感染占比高，治疗难度也随之加大。
2021年中国细菌耐药监测网（CHINET）共分离菌301917株，其中常见菌为大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等对头孢类、碳青霉烯类抗生素耐药仍在加剧，且维持高水平。病原菌对抗生素的耐药持续增高，不断加大了治疗的难度，抗生素耐药问题不可不重视。
呼吸道感染是门诊最常见的疾病，且大多疾病有许多相似而复杂的临床症状。例如：流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等，他们很多都有咳嗽、发热、流涕、声音嘶哑、呼吸急促、喘息等相似的临床症状，难以确定是哪种病原体感染。此外，新冠常见的11种症状跟流感等其他呼吸道病毒的感染也有很多相似的临床表现，给临床的诊治带来一定的困难[7-10]。
感染特征的早期识别对疾病防控，减少病原体传播和合理用药具有非常重要的作用。根据年龄、临床表现、影像、病原检测和并发症的早期识别对判断一部分疾病有帮助，但是并不能从这些表现上得出准确的诊断，所以病原检测的重要性不言而喻。通过病原检测判断是哪种病原体，评估其发展为重症的风险，为临床防控、减少疾病传播及合理用药提供了重要依据。
以流感为例，流感的并发症多样，包括：肺炎、心肌损害、脑炎、脑膜炎、肌炎、肾炎、中耳炎等。由此可见，流感病毒感染不仅会导致呼吸系统感染，还能累及其他器官，快速进展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、脓毒症、脓毒性休克、心力衰竭、肾衰竭，甚至多器官功能障碍。因此，早期快速诊断是防止并发症的关键。
在一项关于重症监护室（ICU）流感住院患儿不同时间使用奥司他韦结局差异的研究显示[11]，0~48h开始使用奥司他韦治疗，患儿死亡率只有3.5%，3~7d开始使用奥司他韦治疗，患儿死亡率为5.3%，8~14d开始使用奥司他韦治疗，患儿的死亡率高达9.1%，如果在患者感染14d时去治疗，患儿死亡率达到26.1%。所以，流感患儿及时使用抗病毒药物治疗可提高流感危重儿童的生存率，越早干预生存率越高。
综上所述，临床需要全面覆盖呼吸道常见病原体的检测手段，多种病原体联合检测，早期诊断，快速出报告，避免疾病的严重发展。但是特别需要注意的是，病原体检测要保证检测的灵敏度和特异度高，确保结果准确，避免错检漏检。
二、呼吸道感染实验室诊断方法
目前，实验室内呼吸道感染病原体的诊断方法有各自的优缺点。首先病原体培养的特异性很高，是病原体感染的金标准，但是培养条件要求高，操作过程复杂、周期长而无法进行快速诊断。同时因某些病原培养条件苛刻，分离阳性率低且对标本采集、运送要求较高，标本中病原体载量少时，易导致假阴性。而免疫学检测抗原的特异性高，但其敏感性低，受方法学和标本质量影响，人工判断易产生假阴性。免疫学检测抗体简便、快速，缺点是敏感性和特异性偏低，有窗口期，不利于疾病的早期诊断，且易受患者的免疫水平影响。除此之外，高通量测序的灵敏度很高，可检出未知病原体，但高通量测序的价格昂贵、操作复杂、技术要求高，其技术流程和报告解读还需不断完善（它能检测出很多的病原体，但这些病原体是否与临床疾病相关还需要科学的解读）。PCR核酸检测具有高特异性和高敏感性的优点，适用于早期诊断，但操作需特定场地、专业的设备和操作人员。
在疾病的进程中，早期诊断主要依靠病原学检测。病原培养和抗原测定有它的不足之处，核酸检测不仅能在感染早期实现早期诊断，还可以监测临床疗效和疾病进展程度。抗体检测的缺点是有窗口期。IgM检测提示近期感染，IgG检测提示既往感染或处于恢复期，多用于流调和回顾性的研究[12]。
2022年国家卫健委医政医管局正式印发的《2022年国家医疗质量安全改进目标的通知》再次明确提出，要提高住院患者抗菌药物治疗前病原学送检率。该送检率的提升可以有效提高抗菌药物使用的科学性和规范性，对遏制细菌耐药、提升治疗效果和保障人民群众健康权益具有重要意义。
此外，国家卫健委发布的《2022年各项专业质控工作改进目标》中也对感染性疾病专业提出了两大改进目标：一是降低病毒性肺炎患者抗菌药物使用率，二是提高呼吸道病原核酸检测率。《改进目标》中指出，作为儿童最常见的感染性疾病，明确的病原学诊断是呼吸道感染性疾病精确诊疗的基础。提高呼吸道病原核酸检测率有助于快速明确病因和合理使用抗菌药物，并对呼吸道传染病的早发现、早隔离、早报告和早治疗具有十分重要的意义。
同年发表的《儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识》（以下简称《共识》）中指出，荧光定量PCR方法将核酸扩增和检测步骤相结合，无需对扩增产物进行凝胶电泳，具有操作简单、特异性高、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等诸多优点。靶向多种病原体的多重标靶试剂设计以及与核酸提取、扩增、结果读取一体化设备的研发应用，凸显了核酸检测在多重病原体快速检测方面的应用。荧光定量PCR方法覆盖了呼吸道常见病原体及耐药基因的核酸检测，可为临床提供病原体诊断依据，有助于优化诊疗。
《共识》还对核酸检测适用人群做出推荐。例如对门诊患者，急性上呼吸道感染患儿常规不进行呼吸道病原体的核酸检测。有特殊性抗病毒药物的病毒感染，如流感病毒，视条件或在其他检测方法不能明确诊断时，使用核酸检测有利于抗病毒药物的合理应用。急性下呼吸道感染患儿，对有心肺等重要脏器基础疾病、免疫功能异常的急性呼吸道感染患儿，应该根据患儿年龄、临床特征和发病季节，及时选用可疑病原的核酸检测方法进行病原学确定，尽快明确病原体，有助于患儿治疗方案的尽早确定和后续管理。对于急诊及住院患者，若有急诊适应症、因急性呼吸道感染性疾病住院、住院期间新出现呼吸道感染症状（伴或不伴发热），出现不明原因的呼吸窘迫、慢性心肺疾病急性恶化、血液病、肿瘤患儿出现中性粒细胞减少/缺乏伴发热，根据年龄、临床特征和发病季节等，推荐选择核酸检测方法进行病原学诊断，特别对急性呼吸道感染的危重症患儿，推荐首选多重核酸检测。
三、呼吸道病原体核酸检测的临床应用
1. 肺病毒感染的重症肺炎的诊治（临床案例1）：患儿，女，2岁，半月余前无明显诱因下出现咳嗽，气喘1周。门诊先后给予“阿奇霉素、头孢哌酮舒巴坦、甲泼尼龙”静滴治疗，仍有咳嗽、气喘，为进一步治疗，拟“急性肺炎”收住入院。
（1）入院前辅助检查：WBC 17.9*109/L，RBC 5.0*1012/L，HGB 139g/L，PLT 492*109/L。超敏CRP：＜0.2mg/L，前降钙素：＜0.02ng/ml。MP-RNA：阳性。病原学检查：呼吸道病原体多重核酸检测：RSV、ADV、PIV、IFV（A、B）、HMPV、HRV、HCOV、Boca、衣原体均阴性，MP阳性；MP-RNA：阳性；MP+CP抗体：MP-IgG 10.30。血/痰培养：培养5天未见致病菌生长。影像学：胸部CT提示“双侧肺炎，肺透亮度不均匀”。
（2）初步诊断：肺炎支原体（MP）肺炎，给予阿奇霉素抗感染治疗及雾化吸入治疗等。后患儿气喘明显好转，入院4天后出院。5天后，患儿因“咳嗽气喘3天”再次入院。
（3）第二次辅助检查：WBC 7.58*109/L，L 70.6%，RBC 4.34*1012/L，HGB 119g/L，PLT 305*109/L，超敏CRP：＜0.2mg/L。呼吸道病原体多重核酸检测：RSV、ADV、IFV（A、B）、HMPV、RV、HCOV、Boca、衣原体、肺炎支原体均阴性，PIV阳性；MP+CP抗体；MP-IgM9.5。呼吸道病原体多重核酸检测提示偏肺病毒阳性，MP-IgM的滴度下降，提示在MP肺炎恢复期，合并偏肺病毒感染，综上：给予对症支持及雾化治疗等，入院4天出院，体温正常，有时有连声咳嗽，无气促气喘，精神胃纳可，后患者出院1周后复诊，仅有单声咳嗽，无气喘。因而，通过呼吸道病毒核酸检测有效判断出第二次是偏肺病毒的感染，不是支原体肺炎再次反复。
2. 肺炎支原体肺炎合并偏肺病毒感染（临床案例2）：患儿，女，3岁，急性起病，以“发热6天，咳嗽3天”主诉入院。精神差，鼻翼微煽动，咽充血，三凹征阳性，双肺呼吸音粗糙，右肺呼吸音低，未闻及干湿啰音。经询问曾有偏肺病毒感染者接触史。
（1）入院辅助检查：WBC 11.82*109/L，N 62.4%，L 27.2%，RBC 4.52*1012/L，HB 125g/L，PLT 271*109/L。CRP：29.38mg/L，SAA：167mg/L；ESR：35mm/h，PCT 0.25ng/ml。胸部CT+支气管三维重建：双肺透光度良好，肺纹理增重，右肺可见多发斑片状高密度影，边界不清，双侧胸膜未见明显增厚，胸腔未见积液，气管/支气管三维重建未见明显狭窄及异物影。病原学检查：DAY 2呼吸道病原体多重核酸检测：偏肺病毒阳性，肺炎支原体阳性，血支原体抗体滴度：1:160，结核杆菌感染T细胞检测（-）。从血象来看细菌或支原体感染可能性较大，在多重核酸检测后，提示合并偏肺病毒阳性。综上，初步诊断：“支气管肺炎”，根据病情，给予患儿鼻导管吸氧、抗感染、雾化、补液等对症治疗。Day 4患儿仍高热，咳嗽减轻，精神欠佳。
（2）第二次辅助检查：血常规：WBC：9.57:*109/L，N 65.2%，L 21%。CRP：19.8mg/L，ESR：29mm/L。凝血：D-Dimer 0.93mg/L。血清铁蛋白：660μg/L。PCT 0.2ng/ml，PPD试验（-）。血培养（-）。
（3）后续：患儿阿奇霉素使用五天，仍持续发热，增加了痰热清清热解毒，穴位贴敷等治疗。DAY7患儿体温恢复正常，CRP指数10.8mg/L，DAY10患儿血常规、CRP、血沉无异常；复查胸部CT：肺部炎症较前明显吸收。
综上，最终诊断为“肺炎支原体肺炎合并偏肺病毒感染”，患儿带药出院。2周后门诊随诊，患儿已无咳嗽，且双肺听诊无异常。
3. 流感后肺炎（临床案例3）：患儿男，5岁，无明显诱因出现高热，咳嗽。入院前血常规提示：WBC 3.9*109/L；流感病毒抗原提示：甲型流感病毒阳性。胸部CT提示：肺炎。
辅助检查：（1）呼吸道多重病原核酸检测：提示甲型流感病毒H3N2阳性、鼻病毒阳性。（2）行支气管镜检查：左右支气管粘膜充血肿胀明显，各支气管开口内可见大量黄白色粘稠痰，通气不良。（3）肺泡灌洗液检测：甲型流感病毒、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌阳性。
给予抗流感病毒药物和抗菌药物等抗感染治疗后好转出院。此案例提示在流感病毒感染对呼吸道粘膜造成损伤后，容易合并细菌感染，常见合并肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的感染，感染后容易出现病情反复加重的情况，此时需要给予抗病毒治疗和早期的抗生素治疗。此外，流感后期合并肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的感染，严重时可以出现塑性形支气管炎，呼吸困难，严重时可出现死亡病例。
4. 病毒混合感染导致的儿童支气管肺炎（临床案例4）：患儿4个月，急性起病，咳嗽5天，加重伴喘息2天。主要表现为鼻塞、咳嗽、喘息。既往体健，足月儿。
入院辅助检查：（1）查体：呼吸稍促，口周无发绀，轻度三凹征阳性，双肺可闻及痰鸣音及喘息音，呼气相延长。（2）肺CT平扫：示右肺上叶见条状、小斑片状高密度影，密度不均，边缘模糊。（3）病原学检查：呼吸道合胞病毒RNA（+），乙型流感病毒RNA（+）。予以对症支持及抗病毒治疗，预后良好。不同病原体用药和治疗方案不同，早期快速诊断致病原，能够帮助我们合理使用抗菌药物，提高患者的生存率。针对病原使用药物要精准治疗，缩短疗程，节约医疗费用。精准的治疗配合合理的用药方案，让患者早诊断，早治疗、早受益。
四、小结
呼吸道病原体感染病情复杂，疾病早期临床症状不典型，难以通过临床症状等进行有效的诊断，需要结合临床实验室检测结果进行判断。快速准确的病原学诊断对于呼吸道感染的临床诊疗及防控具有重要意义。
常见病原菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等对头孢类、碳青霉烯类抗生素耐药形势仍较严重。在此形势下，降低抗生素的使用/滥用，减少抗生素耐药，提高住院患者抗菌药物治疗前的病原学检测至关重要。
针对呼吸道病原体混合感染的情况，以往病原学检查手段有限，常用的血清学抗体检测手段检测快速，但在感染早期阳性率低，有窗口期；而呼吸道病原多重核酸检测灵敏度高、特异性好，为临床早期明确病原学诊断提供了有力支持，目前成为呼吸道感染病原体诊断的主要方法。
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