临床质谱技术在疾病诊疗中的意义与临床应用价值

王占科，博士，主任技师，教授，博士研究生导师。美康生物科技股份有限公司检验医学事业部，美康盛德医学检验所副总经理。原南京军区检验医学专科中心主任，原解放军第九四医院检验病理科主任，南昌大学医学院临床检验诊断学博士研究生导师。学术兼职：现担任中国生化学会生物技术专业委员会委员兼副秘书长，中国医师协会检验分会代谢性疾病专家委员会委员，中国分析测试协会标记免疫分会常务委员，中国卫生产业管理协会检验产业分会常务理事，中国医疗器械行业学会POCT分会常务理事，中国白求恩研究会检验分会常务委员，全军检验医学专业委员会青委会常务委员。担任《国际检验医学杂志》、《实验与检验医学》和《检验医学与临床》杂志编委和审稿专家。在临床检验技术学和临床检验诊断学领域，获国家和省部级科研课题9项，培养研究生10名，在核心期刊以第一或通讯作者发表论文120篇，SCI论文6篇，获省部级科技进步二等奖5项，三等奖4项，国家发明和实用新型专利4项，享受原南京军区一类专家职务津贴和全军二类专家职务津贴。

2017年10月18日，习近平总书记在中国共产党第十九次代表大会报告中提出“健康中国战略”，为人民群众提供全方位全周期健康服务。2019年7月15日国务院成立健康中国行动促进委员会，推动《健康中国2030规划纲要》落实。而检验指标包括疾病的病因学指标和疾病诊断学指标，尤其是病因学指标通过早期准确检测可发现病因，实施提前干预，这些检验指标可用于精准预防疾病，从而有效地控制疾病发生与发展，这对实现“健康中国战略”具有重要意义。疾病诊断学指标通常可以作为疾病确诊和病情变化以及危急值，临床更加重视。疾病的病因学指标比如维生素，和疾病诊断学指标如胆汁酸亚型谱等，具有四无性质，无法或很难用传统方法进行准确检测。而四无性质为：（1）不和其他分子发生颜色化学反应；（2）在体外无法作为某种工具酶的底物；（3）无抗原性，无法获得抗体和通过抗原抗体原理测定；（4）不是核酸分子，无法通过碱基互补原理，进行杂交反应。而质谱技术可准确检测上述四无性质的检验指标，可准确发现亚健康和疾病病因学检验指标，助力健康中国战略实施。

一、质谱技术与质谱仪分类

质谱技术是一种崭新的测定技术，目前人类已经掌握的测定技术包括分光光度技术、抗原抗体反应测定技术、分子杂交技术、PCR技术、离子选择电极法、吸收发射光谱测定技术、压电传感器检测技术、库尔特微孔测定技术以及质谱检测技术。质谱技术检测原理在于：一是质谱的特异性，在相同电离条件下，不同的待测分子产生的质量电荷比（质荷比）不同；二是质谱的定量准确性，控制质谱仪的参数，可以检测不同质荷比的物质含量；三是质谱应用广泛性，理论上，能够被电离的分子，都可以用质谱技术测定，不需要酶、生化试剂、荧光抗体、探针等其他检测试剂成分。质谱仪按结构和原理可以分为六类，包括液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS），飞行时间/轨道离子阱分析器（QToF MS/Orbit），气相色谱-串联质谱（GC-MS），分子量阵列基因分析（Mass Array），电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）。目前检验科常用的还是液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）以及电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）三种。不同类型质谱仪测定不同类别检验指标，例如三重四级杆（LC-MC串联质谱）主要用于生化、免疫小分子物质的检测（如维生素、儿茶酚胺、胆汁酸、药物检测、类固醇激素等）；飞行时间质谱（MALDI-ToF）主要用于微生物鉴定、基因检测；电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）主要应用于各种微量元素检测。

二、质谱技术临床诊疗优势

1. 质谱技术具有以下优势：（1）可以直接测定，质谱被称为微观世界的“称”！先分离各分子，再对各分子进行质谱测定。不同分子质量电荷比不同，先把同一类分子聚集，再通过直接测定待测样品中特征质量电荷比数量，直接测定待测分子的数量！（2）也是精准定性定量的利器，质荷比是某种分子的精准特征，发现即为某分子存在（定性），使用某分子标准品，即可定量测定某分子。某质荷比分子的信号强度（丰度）与分子的数量呈正比。（3）也是准确的标准品，只要有校准品，通过数据库进行检测。标准品是定量测定的参考系，也就是尺子。尺子准不准直接影响到结果准不准。质谱检测的标准品也是校准品，也称标准物，其浓度需要溯源。目前，国内生产的可溯源的标准品品牌，并不很多。（4）不同质谱种类，质谱和色谱组合可以检测不同类别的分子，液相色谱串联质谱主要用于小分子物质定量测定，基质辅助激光解吸飞行质谱主要用于细菌鉴定，耐药基因检测等。

质谱仪是一个高真空系统，其中最重要的技术就是产生离子（离子化技术）和选择/检测离子（质量分析器）。用于生命科学的离子化技术主要有电喷雾离子化（ESI）、基质辅助激光解析电离（MALDI）、快原子轰击（FAB）、电子轰击（E1）。离子化技术目前主要是质量分析器技术包括有四级杆、飞行时间、离子阱、傅里叶变换。电离为什么重要，因为电离就是让待测分子离子化，也就是让分子带电荷。只有带电荷的分子才能在电场中运动。速度与电荷量呈正比，与质量呈反比，电荷越多，运动速度越快，质量越大，运动速度越慢。运动速度与电荷呈正比，与质量呈反比。运动速度与m/e呈反比。最先被检测到的分子m/e最小。色谱用于分离，质谱用于检测，基于上述质谱技术，用于临床的质谱类型只有LC—MS、MALDI—TOF应用最为广泛，可以取代生化、免疫检测。

2. 串联质谱的优势在于：准确度高，不受其它分子干扰；选择性好，是唯一测结构的技术，能准确区分异构体；通量高，同时检测多种标志物优势明显；灵敏度高，比传统方法高5个数量级。检测流程之前操作麻烦主要在标本前处理，如，萃取步骤，像蛋白这种大分子物质无法进行电离（如球蛋白），小分子才可以被电离，如尿素氮、激素、胆固醇等。现在随着技术的发展，标本前处理也可以全自动，再通过液相色谱分离，然后通过串联质谱进行检测。检测后分析质谱图，在质谱图中，横坐标表示离子的质荷比（m/z）值，从左到右质荷比的值增大。对于带有单个电荷的离子，横坐标表示的数值即为离子的质量。纵坐标表示离子流的强度，通常用相对强度来表示，即把所有被记录离子的总离子流强度作为100%，各种离子以其所占的百分数来表示。不同物质的质谱图是不同的，它用于结构复杂分子的定性。如，肿瘤组织和正常组织用飞行时间质谱检测后的质谱图是不同的，即可以判断该组织为肿瘤或者是正常组织。

三、质谱技术的临床应用

串联质谱的临床普及前景良好，相对免疫分子具有强大优势，如维生素、激素、药物等小分子物质定量检测，串联质谱适合所有抗原性弱、化学惰性、其他方法难以检测的小分子物质。

1. 质谱技术在维生素D检验中的临床应用：维生素缺乏是人体亚健康的重要表现，影响健康中国战略实施。大部分维生素具有四无（化学惰性、抗原性、无酶促、非核酸类）性质，缺乏有效的准确定量检测技术方法。质谱技术是目前定量准确检测各种维生素的参考方法。维生素的特点在于结构相对简单，不是机体结构成分，不能提供能量。维持生命活动的元素称维生素，在调节物质代谢过程中起重要作用。主要从食物中来，偏食常引起维生素缺乏。轻度维生素缺乏，不一定有症状，但会影响健康，比如骨质疏松，佝偻病，体质弱等。国家行业标准（WS/T677-2020）推荐用25羟维生素D（25（OH）D）评估人群维生素D缺乏的筛查检验指标并推荐液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）检测25-OH-D。维生素D质谱检测应用于维生素D缺乏症的预防与治疗，用于慢性低钙血症、低磷血症、佝偻病及伴有慢性肾功能不全的骨软化症、家族性低磷血症及甲状旁腺功能低下的治疗。用于治疗急、慢性及潜在手术后手足抽搐症及特发性手足抽搐症。也用于骨科手术愈合者患者、老年人、儿童人群以及糖尿病人群等。血液25-OH-VD指标结果解读为：降低时同低钙的临床意义。见于骨质疏松和骨质增生，骨科患者骨愈合困难，痛风和糖尿病患者。升高一般不常见。25-OG-VD2有关临床科研室目前的检测，糖尿病+维生素D在万方医学数据库网站上，搜索出2690篇文献，维生素D不仅与骨质疏松、糖尿病有关，还与自身免疫性疾病有关。钙离子是体内最重要的活性分子，在各种信号通路中，都有作用。VD和钙同行。

2. 质谱技术用于定量检测人体免疫抑制剂水平：免疫抑制剂主要用于器官抑制患者减轻排异反应，包括肝移植，肾移植和骨髓移植等患者。免疫抑制剂在体内浓度过高或过低，后果都很严重，需要进行准确药物定量检测。他克莫司、雷帕霉素、环孢素A是常用的免疫抑制剂。三种免疫抑制剂毒副作用强，需要纳入药物浓度检测内容。质谱检测可同时检测三种免疫抑制剂药物，技术优势在于结果准。采用液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）可实现单标本多指标(三种免疫抑制剂药物)检测，高检测特异性和检测灵敏度，不受其他分子干扰，线性范围宽，结果更准确；速度快。标本预处理简单，采用96孔板蛋白沉淀法，高通量，测定结果可溯源至参考系统。

3. 质谱技术用于儿茶酚胺类五项激素同时定量检测：儿茶酚胺（Catecholamines）是具有儿茶酚（分子式为C6H6O2）核的胺类化合物，是由肾上腺产生的一类应激和交感“斗或逃”激素。儿茶酚胺不是一种激素！主要包括肾上腺素（Ad）、去甲肾上腺素（NAD）和多巴胺（DA）及其中间代谢产物甲氧基肾上腺素（MN）、甲氧基去甲肾上腺素（NMN）。肾上腺素（NAd）和多巴胺（DA）由苯丙氨酸和酪氨酸合成。血中儿茶酚胺升高可导致高血压和心肌梗塞。低水平儿茶酚胺引起低血压，心肌缺血等。临床上儿茶酚胺常被用来治疗神经源性、心源性、中毒源性休克早期。血液标本内的肾上腺素（AD）、去甲肾上腺素（NAd）和多巴胺（DA）以及甲氧基肾上腺素（MN）、甲氧基去甲肾上腺素（NMN）均可以通过质谱技术进行同时定量测定。儿茶酚胺测定的适应症为高血压患者或人群，疑似肾上腺肿瘤，包括肾上腺嗜铬细胞瘤和副神经节瘤患者。儿茶酚胺类五项用于诊断嗜铬细胞瘤、副神经节瘤，已写进专家共识。

4. 液相色谱串联质谱技术定量测定胆汁酸谱：胆汁酸是胆汁的重要组成成分，由胆固醇经肝组织代谢产生。胆汁酸不仅能够调节葡萄糖和脂代谢，还能与肠道菌群相互作用，参与“肝肠循环”。关于肝肠循环，是初级胆汁酸随胆汁流入肠道，在促进脂类消化吸收同时，受肠道细菌作用而变为次级胆汁酸，肠内胆汁酸约有95％被肠壁重吸收，重吸收的胆汁酸经门静脉重回肝脏，经肝细胞处理后，与新合成的结合胆汁酸一道再经胆道排入肠道的过程。胆汁酸的肝肠循环出现障碍，是导致肝胆疾病的重要机理。胆汁酸谱就是各类胆汁酸的总称。不同来源和生成部位的胆汁酸亚型在临床上具有不同的诊断意义，因此，检测每一种亚型的胆汁酸对肝胆和肠道疾病的筛查、诊断具有重要意义。液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）能有效分离并定量检测血清中各个胆汁酸亚型，检测效率高，检测指标多。妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）是一种严重的妊娠期并发症，发病率为0.8-12％，但围产儿死亡率高。胆汁酸水平改变是ICP主要实验室诊断指标，其中石胆酸（LCA）是诊断ICP病情最灵敏的指标，当石胆酸LCA升高，胆酸CA升高、总胆酸/总鹅脱氧胆酸比值＞1时，则提示妊娠期肝内胆汁淤积症可能。不同肝胆疾病中血浆胆汁酸谱变化不同，15种胆汁酸谱检测，将会提高胆汁酸在肝胆疾病中的鉴别诊断价值。生化法检测总胆汁酸，结果影响因素多，总胆汁酸水平无法具体诊断肝胆疾病中的具体哪一类疾病。而采用质谱技术定量检测胆汁酸谱15项的优势在于高特异性和灵敏度，多种异构体基线分离，精准定量，检测结果更准。同时检测15种不同部位产生的胆汁酸，为鉴别诊断肝胆疾病，提供更全面实验室信息。样本处理简单，通量高，速度快，检测结果可溯源至参考系统。

5. 电感耦合等离子体ICP-MS质谱同时检测19种微量元素：检测原理为当微量元素带一个电荷时，原子量等于质荷比。不同微量元素，在同样电离条件下，产生的质荷比不同。通过ICP-MS质谱可同时检测19种微量元素，结果也能同时检测出来，这其中重要的原因是有校准品的存在。19种微量元素中，有的对机体有利，如钙铁锌，有的对机体有害，如镉汞铅，浓度过高或过低都影响人体的正常生理机能。

综上所述，串联质谱可以检测众多小分子物质，只要能电离成离子碎片，让分子或碎片带电，都可以通过质谱进行定量测定。串联质谱定量检测准确性，取决于标准物质的浓度的准确性，其中标准品浓度溯源也非常重要。本文中讲述的维生素D，免疫抑制剂，儿茶酚胺，胆汁酸谱，微量元素检测在临床中应用，也值得在临床检验中进行推广。为此，质谱技术在临床检验工作中的运用，对于推动临床检验工作发展具有重要意义。