肺炎合并免疫功能低下患者血浆微生物游离DNA测序诊断前瞻性研究
【摘要】目的 肺炎虽然是常见的疾病和导致死亡的原因，但仅在少数病例中鉴定出病原体。而血浆微生物细胞游离DNA的测序，则有望提高肺炎合并免疫功能低下患者的诊断率。方法 在这项前瞻性、多中心、观察性研究中，免疫功能低下的成年人接受支气管镜检查以确定肺炎病因，将血浆微生物细胞游离DNA测序与标准化的常规检查进行比较。肺炎病因由一个独立的盲选委员会裁决。主要结果（实验数据）、附加诊断价值（临床诊断价值），皆符合方案数据分析（具有完整检测结果且无主要方案偏差的患者），并计算通过血浆微生物细胞游离DNA测序完全确定肺炎病因的患者的百分比。在方案亚组，评估其在常规诊断结果阴性的情况下的临床附加诊断价值。结果 257例患者中，173例符合方案标准。52/173例（30.1%）患者通过常规检查诊断出肺炎病因，49/173例（28.3%）患者通过血浆微生物细胞游离DNA测序诊断出肺炎病因，73/173例（42.2%）患者通过两者联合诊断出肺炎病因。21/173例患者仅由血浆微生物细胞游离DNA测序鉴定出肺炎的病因（附加诊断值12.1%，95%可信区间[CI]，7.7~18.0%，P＜0.001）。在常规试验阴性的方案亚组中，血浆微生物细胞游离DNA测序在21/121患者中确定了肺炎病因（临床附加诊断值17.4%，95%CI，11.1-25.3%）。结论 无创血浆微生物细胞游离DNA测序可显著提高经受支气管镜检查、微生物学和分子检测的肺炎合并免疫功能低下患者的诊断率。
【关键词】免疫损害性肺炎；支气管镜检查；恶性血液病；造血干细胞移植；微生物细胞游离DNA测序
肺炎是恶性血液病和造血干细胞移植患者常见的致命性并发症。迅速鉴定出致病菌可以使患者尽快用上有效的抗菌药物，但现有手段很难做到这点。支气管镜是常规进行的一种检查，但是价格昂贵、诊断周期长，且有10%的并发症风险。因此，人们需要新的诊断策略来提高诊断效率，以利减少侵入性诊断程序或不必要治疗所致并发症。这与目前依赖微生物和分子检测思路相比，血浆微生物细胞游离DNA（mcfDNA）宏基因组测序可以提供一种高效诊断和缩短病原体检测时间的非侵入性方法。笔者在对肺炎合并免疫功能低下患者进行的回顾性研究中，血浆mcfDNA测序检测到了只有通过侵入性诊断才能识别的病因，在某些情况下，还检测到了常规检查完全阴性的病原体。
这一研究使用了Karius的试剂盒检测未知病原体（PICKUP），目的是前瞻性评估在接受支气管镜检查的免疫功能严重受损患者的常规测试中添加血浆mcfDNA测序诊断致病菌后的附加诊断价值和治疗效果。
一、研究对象与方法
1. 实验设计与受试者：这项多中心、前瞻性、观察性研究，在美国的10个三级医疗中心进行。接受诊断性支气管镜检查以确定临床疑似肺炎的微生物学病因的住院成年患者，如果他们正在接受活动性血液系统恶性肿瘤的治疗，最近接受了造血细胞移植，或正在接受活性移植物抗宿主病的免疫抑制治疗，则有资格入选。符合条件的患者在入组前不超过1天接受支气管镜检查，或计划在入组后5天内进行支气管镜检查。在过去14天内对新冠病毒进行筛查或任何阳性分子检测之前，已确定肺炎微生物病因的患者被排除在外。完整的研究方案作为“补充1”提供。
记录从入组前3天到入组后14天按照常规治疗进行的所有影像、微生物学、分子和血检的临床医生文件和结果。在入组后24小时内采集的血液样本和鼻咽拭子样本，以及当方案规定的诊断测试没有作为常规治疗的一部分进行时，残留的支气管肺泡灌洗液应被保存并送去参考实验室（印第安纳大学核心实验室）进行补充检测。对患者进行了50天的随访，以获取最终培养或参考实验室检测结果、关键临床结果以及研究完成后的抗菌药作用情况。
2. 血浆微生物细胞游离DNA的测序分析：Karius 公司试剂盒可以用来对血浆mcfDNA进行定性及定量检测。测试方法和验证的详细说明已在前面进行了描述。血浆mcfDNA测序测试程序概述和临床报告示例见“附录2”。血浆mcfDNA测序的结果没有提供给受试者的临床医疗团队。
3. 研究定义：常规医疗检查被定义为协议要求的最低诊断标准加上在常规治疗期间进行的任何额外诊断测试，以确定肺炎的致病原因。最低诊断标准预定义了纳入符合方案人群所需的支气管镜和非侵入性诊断测试的最低集合。方案规定的支气管肺泡灌洗液检测包括细菌、真菌和分枝杆菌培养，以及吉氏肺孢子虫的染色或分子检测。完成最低诊断标准所需的非侵入性测试包括血培养、血清半乳甘露聚糖和鼻咽拭子或洗涤液中的多重呼吸道病毒组。根据方案的人群包括具有完整的最低诊断标准测试、在入组后24小时内收集的有效血浆进行mcfDNA测序（为根据方案处理并通过内部质量控制评估的样本）以及常规治疗对血浆mcfDNA测序测试结果不偏离方案的患者。肺炎的可能原因被定义为通过常规检查或血浆mcfDNA测序鉴定的病原体，在审查所有诊断测试和临床信息后，被判定为致病因。
4. 主要和次要目标：主要研究目的是评估血浆mcfDNA测序在符合方案人群中的附加诊断价值，这与研究登记后7天内可用的所有常规医疗测试结果的裁定复合物相比。次要目标包括分别评估血浆mcfDNA测序与所有侵入性和非侵入性常规医疗测试项目的附加诊断价值，以及血浆mcfDNA测序与所有常规医疗诊断测试之间的一致性。为了保守地估计与所有常规医疗测试的一致性，将RNA病毒（未通过血浆mcfDNA测序检测到）纳入一致性分析。主要结果，即附加诊断值，被定义为通过血浆mcfDNA测序唯一确定的肺炎可能病因的患者百分比。附加诊断值估计了如果在该免疫功能低下人群中将血浆mcfDNA测序与常规护理测试相结合，诊断结果的预期增加。临床加性诊断价值被定义为在常规检查呈阴性的Per-Protocol人群亚组中，通过血浆mcfDNA测序仅鉴定出肺炎病因的患者百分比。临床附加诊断价值预估了在常规检查呈阴性的情况下，血浆mcfDNA测序能够确定肺炎病因的概率。
5. 结果判定过程：由4名传染病（DM、EM、MM、TH）和4名肺科（AB、CB、DG、JT）医生组成专家委员会，他们在照顾免疫功能低下的肺炎患者方面具有丰富的临床经验，通过两个步骤裁定所有研究终点。对血浆mcfDNA测序结果不知情的裁决者首先审查了所有临床文件和常规治疗诊断测试的组合，以确定是否在研究登记后7天内确定了肺炎病因。然后对血浆mcfDNA测序结果进行揭盲和判定。血浆mcfDNA测序报告中列出的所有微生物被分类为（1）肺炎致病菌；（2）不导致肺炎的病原体；（3）正常微生物菌群（共生生物或污染物）。然后，评判人员确定血浆mcfDNA测序结果是否与常规检查一致。当通过血浆mcfDNA测序确定肺炎的可能原因时，裁决者要确定结果是否可用，诊断信息是否可能改变临床管理。每个病例都由传染病专家和肺病学家独立审查。初级裁决之间的分歧通过由至少三名未进行初级裁决的医生组成的委员会的审查得到解决。委员会还对血浆mcfDNA测序结果视而不见，直到常规护理裁决完成。补充资料2中提供了临床事件分类裁决过程的其他详细信息。
6. 统计学分析方法：研究的最小样本量（169）是由相对于方案人群的加性诊断值确定的，这将提供80%的能力来拒绝零假设，即≤5%的患者可能有肺炎的病因，仅通过血浆mcfDNA测序确定，假设加性诊断价值≥10%，单侧I型误差=0.05。在对首批56名符合方案的患者进行评估后，进行了无效性的非约束性中期测试。附加诊断值报告为百分比，双侧精确概率法的95%二项式置信限。所有统计分析均采用SAS 9.4版（SAS Institute股份有限公司）。
二、研究结果
1. 受试者信息：从2020年1月3日到2022年2月4日，来自10个中心的257名患者入选，其中250名（97.3%）符合所有研究资格标准。其中，190／250名（76.0%）患者在入组后45天内接受了化疗；138/250（55.2%）患有活动性复发性血液系统恶性肿瘤，75/250（30.0%）接受了造血细胞移植。在入组前7天，232名（93.2%）患者接受了广泛的抗菌治疗，177名（71.1%）患者接受霉菌活性抗真菌治疗。最终研究评估时（入组后50天）的总死亡率为60/250（24.0%）。在247名接受≥1次诊断性支气管镜检查的患者中，40人（16.2%）至少观察到一次支气管镜检查并发症。5/247（2.0%）患者出现危及生命的并发症（需要入住ICU的呼吸衰竭和不稳定的心律失常）。在250名患者中，173名（69.2%）符合纳入符合方案人群的标准。最低诊断标准测试不完整，主要是39／250（15.6%）患者的血液培养缺失，是排除的最常见原因。所有研究人群中患者的基线特征与符合方案的人群相似。
2. 肺炎诊断结果：根据方案人群中的52／173（30.1%）患者在研究登记后7天内通过常规检查确定了至少一种已判定的肺炎可能原因。其中，3／52（5.8%）的患者中发现了两种可能的肺炎原因。在55种可能的肺炎病因中，通过常规护理测试确定了30种（54.5%）真菌、18种（32.7%）细菌、3种（5.5%）DNA病毒和4种（7.3%）RNA病毒病原体。在21／30（70.0%）的真菌性肺炎患者中，曲霉菌被判定为致病病原体，其中16／21（76.2%）的诊断基于半乳甘露聚糖和影像学标准。对这些患者残留的支气管肺泡灌洗液进行曲霉菌种的事后PCR检测（补充2中的表2）。在13／173（7.5%）的患者中，通过非侵入性常规检查确定了肺炎的可能原因。血浆mcfDNA测序在49/173（28.3%）患者中确定了至少一种可能的肺炎原因。在56个已判定的肺炎可能原因中，血浆mcfDNA测序鉴定出23种（41.1%）真菌、29种（51.8%）细菌和4种（7.1%）DNA病毒。
3. 附加诊断价值：在符合方案的人群中，血浆mcfDNA测序仅确定了21／173名患者肺炎的可能原因，其附加诊断值为12.1%（95%置信区间[CI]，7.7-18.0%，P＜0.001）。血浆mcfDNA测序和常规检查相结合，在73/173名（42.2%）患者中确定了肺炎的可能原因，相当于在8.3名（95%置信区间，5.6至13.0）患者中，诊断率和检测所需数量的绝对增加了12.1%。在通过常规检查确定的121名无肺炎原因的患者中，仅通过血浆mcfDNA测序确定的21名可能有肺炎原因的病人的临床附加诊断值为17.4%（95%CI，11.1-25.3%）。在预先指定的关键亚组和具有有效血浆微生物细胞游离DNA测序结果的所有入选患者中，附加诊断价值相似。
4. 血浆mcfDNA测序的潜在临床影响：在通过血浆mcfDNA测序唯一确定的21名可能引起肺炎的患者中，确定了24种致病病原体，包括16种（67%）细菌、7种（29%）真菌和1种（4%）DNA病毒。裁决委员会确定，血浆mcfDNA测序结果可能改变了17/21（81%）患者肺炎的抗菌治疗。在符合方案的人群中，血浆mcfDNA测序在67／173（38.7%）患者中确定了≥1个临床相关感染（肺炎除外）的可能原因。
5. 结论：在通过常规检查确定的可能导致肺炎的52名患者中，血浆mcfDNA在27名患者中确定了相同的病原体（阳性百分比一致性52%，95%CI，38-66%）。在121名常规检查呈阴性的患者中，100名患者的血浆mcfDNA未确定肺炎的可能原因（阴性百分比一致性83%，95%置信区间，75至89%）。当DNA病毒病原体通过常规检查被确定为肺炎的可能原因时，阳性率一致性最高（100%），而当真菌病原体被确定时，阳性度一致性最低（43%）。在14/15（93%）的真菌性肺炎患者中，曲霉菌属被判定为致病病原体，仅通过常规检查确定。
三、讨论与分析
在这项研究中，将血浆mcfDNA测序添加到常规诊断标准中，绝对诊断率提高了12%。这些发现表明，在诊断性支气管镜检查时，大约每8名患者中就有1名患者的血浆mcfDNA测序可以完全确定肺炎的可能原因。血浆mcfDNA测序在17%的免疫功能低下患者中确定了肺炎的致病原因，这些患者没有通过常规检查进行微生物诊断。此外，在大多数仅进行血浆mcfDNA测序的诊断中，结果被判定为可能导致治疗变化。
尽管进行了彻底的诊断评估，但只有30%的入选患者通过常规检查确定了肺炎的可能原因。这一比例低于以前一些研究报告的比例；然而，我们相信该研究设计为该患者群体的肺炎诊断率提供了一个准确的真实世界评估。值得注意的是，与之前仅基于阳性诊断测试的研究相比，我们实施了一个结构化、集中的临床裁决程序，这可能会导致确诊为微生物原因的肺炎病例比例较低。导致造血干细胞移植和血液系统恶性肿瘤治疗复杂化的急性非感染性肺部疾病尚未得到裁决。虽然所有入选的患者都因临床疑似肺炎接受了支气管镜检查，但其中一些患者可能患有非感染性肺部疾病。此外，无论支气管镜检查的时间与症状发作或既往经验性抗菌药物暴露无关，患者都被纳入研究，这是导致该患者群体支气管镜检查结果低的两个已知因素。由于常规护理比较包括了在常规护理中收集的所有检测，以确定肺炎病因，因此结果反映了诊断检测的范围以及这些患者的本地检测标准和诊断结果的现实变化。总之，我们的研究结果增强了对当代诊断结果的理解，并强调了对接受支气管镜检查的严重免疫功能低下患者进行改进诊断测试以确定肺炎病因的必要性。
常规检查和血浆mcfDNA测序之间的一致性因病原体类别而异，在真菌性肺炎患者中最低。曲霉属是大多数真菌性肺炎病原体的主要来源，仅通过常规检查鉴定。这一发现与先前对侵袭性真菌疾病血浆mcfDNA测序的回顾性研究一致。入选患者中霉菌活性抗真菌预防的高比率是否降低了血浆mcfDNA测序产量尚不清楚。真菌性肺炎的诊断通常依赖于非培养方法，如半乳甘露聚糖，这可能导致过度诊断或受到先前霉菌活性抗真菌暴露的不同影响。
在大多数曲霉菌属被判定为肺炎可能原因的患者中，仅通过半乳甘露聚糖检测就符合真菌学标准。虽然这些患者诊断结果不一致的机制尚不清楚，但血浆mcfDNA测序确实确定了未经常规检查的侵袭性真菌感染。这些发现突出了将血浆mcfDNA测序与现有检查相结合的诊断测试方法的互补性。
本研究的优势包括前瞻性、多中心设计和所有关键研究终点的盲法、多阶段委员会裁决。此外，该研究需要进行严格的日常护理评估，以确保对血浆mcfDNA测序的附加诊断价值进行可靠的估计。我们保守地定义了附加诊断价值，仅包括通过血浆mcfDNA测序专门确定的可能肺炎原因的患者，以方案指定的常规护理测试组为背景。然而，常规护理诊断测试通常不那么广泛，支气管镜检查可能会延迟或避免。因此，这项研究可能低估了非侵入性血浆mcfDNA测序在现实世界中的附加诊断价值。未来的研究应该评估血浆mcfDNA测序与常规护理测试相结合是否可以识别临床相关的合并感染，减少病原体识别的时间，需要额外的诊断测试，成本和手术并发症的风险等，提供其他形式的临床诊断价值。
这项研究是有局限性的。首先，大约四分之一的入选患者被排除在主要分析之外，因为最低诊断标准测试不完整。这些患者中的大多数因血培养缺失而被排除在外，血培养是一种在免疫功能低下的肺炎患者中诊断率较低的检查。由于在符合方案的人群中以及在所有接受血浆mcfDNA测序的入选患者中，附加诊断值相似，因此排除没有血培养的患者不太可能系统地偏向研究结果。其次，由于大多数患者在入组时接受了经验性广泛抗菌治疗和霉菌活性抗真菌治疗，因此无法评估既往用药对血浆mcfDNA测序结果的影响。最后，这项研究不需要曲霉菌血清或支气管肺泡灌洗液PCR检测，这是临床实践指南为疑似侵袭性肺曲霉菌病的免疫功能严重受损患者推荐的。
总之，在接受侵入性检查的严重免疫功能低下患者中，无创血浆微生物细胞游离DNA测序增加了对肺炎致病菌的检出。总之，这些数据支持采用血浆mcfDNA测序来提高这一高危人群的诊断率。
（本文图表略）
本文编译自：Stephen PB，Roy FC，Sanjeet SD，et al. 美国传染病协会《临床感染性疾病》，2023，10，10.
