全自动数字PCR核酸检测在恶性肿瘤诊疗中的临床价值
随着癌症诊疗技术的不断进步与发展，WHO指出，癌症有1/3完全可以预防；还有1/3的癌症通过早期发现能得到根治。而其中早诊早治是提高癌症生存率的关键。
在临床实践表明，准确有效的癌症检测方式有利于癌症患者的诊疗，肿瘤分子标志物的发现也使得癌症诊疗方式得到了快速发展。数字PCR（dPCR）作为一种新兴核酸检测技术，能将单个核酸分子分配到独立的微反应单元，实现核酸模板的绝对定量，耐抑制性强并具有极高的灵敏度，突破了qPCR的局限性，能够广泛应用于肿瘤的诊疗。现将数字PCR核酸检测在肿瘤诊疗中的应用价值作如下介绍。
1. 肿瘤的早期诊断：早诊早治是提高癌症患者生存率的关键。基于数字PCR的高灵敏度，通过患者的体液就可以检测出较低丰度的基因突变，从而对肿瘤患者进行早期诊断和早期治疗。
dPCR的高灵敏度使我们通过患者体液就可以检测出较低丰度的基因突变，从而进行肿瘤早期诊断。甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，很多肿瘤的发生都涉及基因组甲基化的改变。因此Vedeld HM等[3]使用dPCR对胆管癌（CCA）患者胆汁样本中CDO1、CNRIP1、SEPT9及VIM基因甲基化水平进行定量分析，揭示了通过dPCR可提早最多12个月预测原发性硬化性胆管炎（PSC）患者在移植手术前发展为CCA的风险，并且建立的dPCR分析方法较CA19-9与病理学检测更为有效（图1）。
图1. CCA-PSC≤12：从胆汁取样到CCA诊断的时间≤12个月；CCA-PSC＞12：从胆汁取样到CCA诊断的时间＞12个月
2020年，结直肠癌（CRC）是全球发病率排名第三的恶性肿瘤，目前甲基化Septin 9已用于结直肠癌（CRC）的非侵入性筛查，qPCR为常用检测手段，但检测结果准确度较低。Ma ZY等使用dPCR对CRC患者血液样本进行了检测，与健康受试者相比，CRC患者血样中甲基化Septin 9的浓度明显升高（1.47 versus 0.78 copies/μL），CRC患者和健康受试者能得到较好的区分，联合甲基化Septin 9含量和CEA浓度也可以显著提高结直肠癌检测的准确性（图2）。数字PCR减少了样本使用量，并且得到更加精准的结果，为患者的诊断提供更好的检测方法。
注：a：甲基化SEPT9/非甲基化SEPT9；b：甲基化SEPT9含量；c：甲基化SEPT9含量和CEA浓度
图2. 用于区分CRC患者和健康受试者的ROC曲线
2. 肿瘤治疗方案的选择：通过dPCR进行肿瘤基因检测，发挥了独特的优势，对于一些无法进行或需要较长时间进行组织活检的患者而言，也是一种有效的检测方式，能在部分靶向治疗中为患者选择更适宜的治疗方案。烷化剂如达卡巴嗪等常用于黑色素瘤、淋巴瘤等的治疗中，而MGMT是一种修复蛋白，其缺失使肿瘤更易受烷化剂的细胞毒性作用。Barault等采用dPCR对使用烷化剂治疗的胶质瘤患者的肿瘤组织和血浆cf DNA同时进行检测, 发现发生MGMT甲基化的患者总生存率（OS）和无进展生存率（PFS）更高（图3），因此，通过检测MGMT甲基化水平可预测烷化剂治疗效果，辅助临床医生指导患者用药。
图3. MGMT甲基化的患者总生存率（OS）和无进展生存率（PFS）更高
3. 肿瘤的耐药监测：肿瘤靶向治疗易发生获得性耐药，因而对化疗反应或耐药性的早期预测可能对临床管理和生活质量具有重要意义。Louise Faaborg等应用dPCR筛选出的甲基化基因HOXA9与复发性卵巢上皮癌症患者的不良生存率显著相关，有可能在早期观察疾病的进展，并使患者免于无效治疗（图4）。
图4. HOXA9甲基化程度增加的患者生存率更低
4. 残留病灶的监测：微小残留的监测可以帮助部分癌症患者选择合适的停药时机, 也能预测部分患者化疗后复发的可能性。但残留病灶会随着治疗进程逐渐缩小, 因此需要提高检测方法的灵敏度指导患者用药。在使用酪氨酸酶抑制剂（TKI）治疗慢性粒细胞白血病时，通常对BCR-ABL1减少情况作为TKI治疗剂量减少或中断的金标准，但约60%患者终止TKI治疗后很快又复发。因此Goh等使用dPCR对BCR-ABL1进行定量分析，结果显示dPCR对残留量持续下降的监测表现优异，为癌症患者的疾病监测提供了技术平台（图5）。
图5. 使用dPCR监测7个q-PCR检测结果阴性的患者，样本中BCR-ABL量持续下降
肿瘤生物学和医学技术的发展影响着癌症患者的诊断与治疗，而dPCR技术的发展与进步也能够助力癌症诊疗效果的提升。迈克生物始终坚持“科技服务人类健康”，通过技术创新拓宽产品应用领域，基于振动微滴（OsciDrop®）核心技术推出的D 600全自动数字PCR分析系统，将其核酸定量的高灵敏度和特异性与液体活检技术的非侵入性相结合，能够为癌症诊疗提供更安全可靠的检测平台（图6）。
图6. 迈克生物D 600全自动数字PCR分析系统
目前D 600除配套试剂检测盒以外，已开发出配套的EGFR基因T790M突变检测试剂盒、PIK3CA基因E542K、E545Q、H1047R突变检测试剂盒等，并且我们还能提供个性化的定制选项，项目涵盖感染、肿瘤、遗传等相关疾病，总计达400余项，能够满足大部分临床与科研需求，探索更多诊疗领域。
参考文献
http://www.caca.org.cn/system/2023/01/09/030025706.shtml
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Vedeld HM. Early and accurate detection of cholangiocarcinoma in patients with primary sclerosing cholangitis by methylation markers in bile[J].Hepatology, 2022; 75: 59–73.
Ma Z Y,. Application of droplet digital polymerase chain reaction of plasma methylated septin 9 on detection and early monitoring of colorectal cancer[J]. Scientific Reports. (2011)11: 23446
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Barault L,. Digital PCR quantification of MGMT methylation refines prediction of clinical benefit from alkylating agents in glioblastoma and metastatic colorectal cancer[J]. Ann Oncol, 2015, 26 (9): 1994-1999．
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Faaborg L. Prognostic Impact of Circulating Methylated Homeobox A9 DNA in Patients Undergoing Treatment for Recurrent Ovarian Cancer. Cancers (basel) 14, doi:10.3390/cancers14071766 (2022).
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