肌钙蛋白实验室检测的干扰因素与质量控制要点
袁慧，医学博士，教授，博士生导师。现任首都医科大学附属北京安贞医院检验科主任。主要从事心血管生物标志临床应用和基础研究，临床实验室检验新技术及标准化研究。现任北京医学会检验分会常务委员、中国中西医结合学会检验分会常务委员、中国医师协会检验医师分会甲状腺疾病专家委员会副主任委员、心脑血管疾病专家委员会委员等。主持国家自然科学基金、北京市科委培育项目、教育部重点实验室开放研究课题、科技部重点研发计划项目等。
杨家树，首都医科大学临床检验诊断学博士研究生。主要研究方向为探索心力衰竭、心肌梗死的新型标志物；肺动脉高压的机制研究。
随着人口老龄化进程，心血管疾病的负担越来越重。急性冠脉综合征（ACS）和急性心肌梗死（AMI）的早期诊断及危险分层，对于患者的预后十分重要。肌钙蛋白（Tn）是ACS和AMI中非常重要的生物标志物，对疾病的早期诊断、危险分层及预后具有重要指导价值。在2023年ESC发布的ACS管理指南中，高敏肌钙蛋白（hs-cTn）在ACS诊断方面推荐证据等级为：IB类[1]。Tn是肌细胞收缩中比较重要的一种肌动蛋白，主要在心肌细胞和骨骼肌中表达。Tn是一种三聚体复合物，包含TnI（inhibitory Troponin I）、TnT（tropomyosin-binding troponinT）及TnC（calcium-binding troponin C）三个亚基。心肌肌钙蛋白（cTn）主要存在心肌细胞中，主要包含心肌肌钙蛋白I（cTnI）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）。当心肌细胞发生坏死、程序性死亡、生理性心脏更新、细胞伤口等因素时，cTn可以被释放到外周血液中[2]。cTn在外周循环中，主要是以cTnI、cTnT和cTnI-cTnC复合物（二元复合物）的形式存在；同时在血浆中也存在cTnT-cTnI-cTnC复合物（三元复合物）[3]。在2018年发布的第四版心肌梗死通用定义中，推荐使用cTnI和cTnT用于排除心肌损伤的首选标志物[4]。cTns作为心肌损伤的标志物，其早期的检测是使用放射免疫分析法，其检测下限为10ng/ml[5]。使用高灵敏度的方法检测cTn,不仅可以提高cTn检测的准确性，同时可以降低检测成本[6]。2018年国际临床化学和检验医学联合会（IFCC）认为定义高敏肌钙蛋白需要满足两个基本标准：（1）在不少于50%的健康男性和女性人群中均能够稳定可靠地检测到cTn并且cTn浓度等于或高于检出限（LoD）；（2）在性别特异性第99百分位值参考上限（99th URL）浓度下的总CV≤10%[7]。由于cTn和hs-cTn的临床意义重大，临床中存在许多干扰检测的因素以及质量控制不达标等问题，积极识别并排除干扰因素和做好质量控制，对于cTn和hs-cTn的检测意义重大。
一、cTn实验室检测的影响因素和质量控制
实验室准确的检验是保证cTn临床应用的关键。由于不同厂家针对cTn设计的抗原表位不同、检测试剂采购原材料的差异等，使得cTn的检测呈现千姿百态的局面。其次cTn的结果不仅与心肌缺血相关，在一些非缺血性心脏病（如：心肌炎、中毒损伤及重度心脏负荷等）也会影响cTn的检测结果[8]。目前已报道，存在许多可影响cTn检验结果的因素，比如，纤维蛋白凝块、仪器和试剂、高胆红素、异嗜性抗体、巨肌钙蛋白复合物等问题[9]。本文简要分析和梳理干扰cTn的检测的因素以及必要的质量控制措施。
1. 抗体介导的干扰：抗体介导的cTn检测异常中，最常见的抗体是IgG[10, 11]。如果去除IgG蛋白后，cTn的回收率＜40%，或者cTn下降的浓度与对照组显著不同，则可以怀疑存在抗体干扰cTn检测[10]。当机体内的抗体与试剂抗体竞争结合cTn时，此时cTn的检测值低于真实值；相反当机体内的抗体与试剂抗体结合时，此时cTn的检测值高于真实值。目前常见的抗体介导的干扰类型包括：自身抗体、异嗜性抗体（包含人抗鼠抗体和类风湿因子）以及巨肌钙蛋白抗体[12]。
（1）自身抗体：有研究统计了心肌肌钙蛋白抗体（cTnAABs）的阳性率，在cTnI和cTnT中分别为：0-12.7%和0-9.9%；而在心脏病患者中，该数值可能会高3倍左右[13]。cTnAABs可与cTn形成免疫复合物。有研究报道自身抗体阳性的患者，其体内cTnI水平相对较高，当发生心肌梗死后，其存在的持续时间较长[14]。自身抗体的存在，也是导致cTnI升高的原因。Warner等[11]发现2次cTnI测定值之间的差异，其中5%差异结果是由于自身抗体-cTn复合物引起的。
（2）异嗜性抗体：异嗜性抗体是由已知或未知抗原刺激人体产生的一种特异性免疫球蛋白，它可以通过非特异性结合、标记抗原/抗体等方式干扰检测结果，引起假阳性或假阴性的结果。异嗜性抗体同样会影响cTn的检测，其在人群中的发生率在0.1%-3.1%不等，而在特定人群（如持续感染的患者）中，该比例可达到50%；需要注意的是异嗜性抗体可以同时影响cTnI和cTnT的检测[15]。部分临床患者采用鼠单克隆抗体制剂治疗后，产生的人异质性抗鼠抗体（HMAM）可与cTn产生非特异性结合，产生明显升高或降低的假性结果。Kavsak等[16]使用Abbott AxSYM试剂检测cTnI，比较异嗜性抗体对cTnI检测浓度的影响，结果显示消除异嗜性抗体后，cTnI浓度由425ug/ml下降到6.1ug/ml。异嗜性抗体是临床检测因素中比较常见的干扰因素，当cTn的检测结果与临床判断不符合时，我们需要积极排除异嗜性抗体的干扰。
类风湿因子（RF）是针对人IgG的自身抗体，主要是以IgM类型的免疫球蛋白为主。Al-Awadhi等[17]发现在50例血清阳性的类风湿性关节炎患者血液中，出现5例cTn的假阳性，相反在血清学阴性的其他自身免疫性疾病中并没有发现cTn假阳性。Dasgupta等[18]进一步使用针对RF的多克隆抗体消除血清中RF影响后，再次检测cTn时，并没有发现cTn阳性的出现。有研究者认为RF对于cTn检测的影响与异嗜性抗体作用类似，易产生假阳性[19]。
（3）巨肌钙蛋白复合物：巨肌钙蛋白复合物通常是由cTn与循环免疫球蛋白结合，形成的一种大复合物。巨肌钙蛋白通常会导致cTn的检测假性升高。巨肌钙蛋白是目前公认hs-cTnI检测之间产生误差的重要原因[20]。在报道的巨肌钙蛋白复合物中，干扰物以IgG球蛋白为主，主要影响cTnI[21, 22]。有研究报道，实验室检测到的hs-cTnI升高的样本中，约有5%是由于巨肌钙蛋白的干扰引起的；而同时存在巨肌钙蛋白和心肌损伤的患者，其hs-cTnI升高的水平持续时间更久[11]。由于巨肌钙蛋白的半衰期普遍长于肌钙蛋白，因此其存在可以对cTn的检测产生长时间的影响，此时cTn的阳性结果，并非代表心肌损伤。一般cTn分子量是小于40KDa，而巨肌钙蛋白复合物的分子量普遍在150KDa左右[23]。二者分量的差异提示我们，分子量可以作为干扰物是否为巨肌钙蛋白的一种方法。但是检测复合物的分子量，比较繁琐，目前普遍采用凝胶过滤色谱（GFC）的方式，可帮助我们鉴别干扰物。
（4）抗体干扰的处理：针对抗体介导干扰cTn检测的因素，首先需要将样本重新离心，排除分析前中的纤维蛋白凝块、微颗粒以及溶血对于cTn结果的影响。处理后结果依旧升高，可更换不同检测方法的试剂和平台。若更换试剂与平台后的结果仍然升高，可逐步使用异嗜性抗体封闭剂、免疫球蛋白结合蛋白（球蛋白A或G）沉淀的方式，减少免疫球蛋白的干扰；也可以采用聚乙二醇（PEG）沉淀和GFC等方式确认干扰物质的性质[11, 12, 22]。PEG的沉淀，可以使得样本中多数蛋白进行非特异性沉淀，因此这种方法无法帮助我们获得cTn干扰的来源[24]。需要注意的是：使用PEG或去除IgG蛋白等干扰物后的cTn浓度，不应该作为患者的cTn浓度出现在医疗报告单中[12]。
2. 凝块和离心及样本稳定性：纤维蛋白凝块或微颗粒是干扰cTn检测最常见的原因[25]。其产生的原因主要是由于血液在采血管中凝固以及血液离心不充分所引起，其造成的影响通常是导致cTn的假性升高[9]。有学者对离心条件与cTn检测影响进行了评估，研究结果发现离心与不离心两种不同条件下，hs-cTnI的CV为：10% vs 41%，cTnI的CV为：11% vs 15%[26]。由此可见，离心的条件对于hs-cTnI的影响较大。由于hs-cTnI的灵敏度较高，其结果的差异更容易受到外界干扰，从而影响临床决策。Kavsak等[26]进一步探索了不同保存条件对hs-cTnI稳定性的影响。作者将同一标本分为三份，储存条件分别为：第一天（1st，-20℃和4℃）、第二天（2nd，-20℃和4℃），结果显示-20℃条件下的CV分别是：1st vs 2nd（130% vs 30%）；4℃：1st vs 2nd（16% vs 9%）。Wu等[27]研究了室温放置时长对于cTnI的影响。研究者通过将健康患者cTnI样本分别放置1小时、≤6小时、≤48小时后再-80℃冻存，其CV和检测浓度分别为：＜1%（0.62-5.59ng/L），＜3%（0.47-3.29ng/L），14%（0.44-14.53ng/L）；而胸痛患者的cTnI在室温6小时后-80℃冻存，其相应变化为＜3%（0.80-8.26ng/L）。不同的保存条件，对于hs-cTnI的稳定性影响非常大，在临床检测中，我们需要注意样本存放条件，以免检测物质降解，造成检测结果的假阴性。
3. 生物素干扰：在自然界中亲和素和生物素是一对相互作用的亲和蛋白。目前它作为一种信号放大系统，已经广泛应用于微量物质的检测，显著提高了检测灵敏度[28]。免疫反应的基础是基于抗原抗体反应，生物素在检测方面带来益处的同时，也会带来负面影响。有研究报道样品中高浓度的生物素可以与生物素化抗体发生竞争反应，在夹心法测定中导致假性降低，而竞争法中导致假性升高[29]。Trambas等[30]通过向血清样品中分别加入15.6ng/ml和31.3ng/ml的生物素溶液，使用Cobas 8000 e602仪器观察不同浓度的生物素在夹心法检测模式下对cTnT的干扰。在15.6ng/ml浓度下，生物素对cTnT的检测造成负偏倚且偏倚程度约10%；当生物素浓度为31.3ng/ml时，同样也会造成负偏倚，偏倚程度约20%。生物素浓度越高，其对cTnT检测更造成假阴性的影响越大。Willeman等[31]使用Siemens Dimension Vista 1500仪器进一步细化生物浓度，发现50-200ug/L的生物素浓度中，cTnI的检测并没有受到影响。Trambas与Willeman的研究结果中生物素浓度对cTn的影响并不一致，一方面考虑检测对象（cTnI和cTnT）不同，另一方面使用的检测平台不同（Cobas和Siemens）；不过二者均指出生物素会导致cTn的假性降低。
4. 质量控制要点：第四版心肌梗死定义中将cTn在心肌损伤的诊断界值确定为cTn在人群中第99百分位点[4]。hs-cTn在ACS和AMI中具有重要的阴性排除价值，但是由于其灵敏度要求较高，干扰因素对其结果影响较大，因此cTn及hs-cTn的质量控制显得尤为重要。针对实验室的hs-cTn来说，一般每天至少3种浓度水平各进行一次的的室内质控检测[7, 9]。针对各浓度的要求如下：浓度1：要求浓度1的水平介于LoD和最低性别特异性99th URL之间的浓度；浓度2：其浓度可略高于较高性别特异性99th URL，且不超过URL的20%，CV≤10%；浓度3：实验室可报告的最高浓度或者临床可见样本的最高值，且CV≤10%。针对普通cTn样本，其室内质控要求，每天至少进行2种浓度水平的室内质控各一次，且CV≤20%，其浓度要求如下：浓度1：接近99th URL；浓度2：实验室可报告的最高浓度或者临床可见样本的最高值。针对高浓度水平质控物，其具体浓度值取决于各自医院的患者类别，没有统一要求。cTn和hs-cTn的室间质评，2021年的《心肌肌钙蛋白实验室检测与临床应用中国专家共识》建议参加高水平的室间质评，针对参评的样本浓度要求：应至少一份包含99th URL的样本，总体误差≤35%[9]。cTn和hs-cTn的临床意义重大，但是其质量控制更是重中之重，只有做好质量控制，才能更好服务临床。
二、肌钙蛋白即时检验的质量控制
即时检测（Point of care testing，POCT）是一种在实验室外便携式的检验仪器，距离患者较近，在床旁可以快速进行检验的微型检测仪器。cTn相关的POCT可以快速为患者提供检测结果，为患者的疾病诊断和救治提供了快速、便捷的方式。为了更快的诊断ACS，《急性冠脉综合证急诊快速诊疗指南（2016）》将cTn的POCT诊断列为IA类证据等级推荐[32]。由于cTn的结果在ACS和AMI的诊断及病情评估中，具有重要作用，因此对cTn结果的准确度要求较高。但是我们需要注意的是目前的POCT准确性远不能替代实验室检测的cTn[33]。目前临床中使用POCT检测cTn的性能依然达不到hs-cTn要求，因此POCT检测的cTn依然属于普通的cTn，hs-cTn的POCT（hs-POCT）研究仍处于探索中。由于市场存在多家cTn的POCT产品，不同厂家产品之间的检测性能存在差异。最近也有研究人员尝试在1086名患者中使用全血样本进行hs-POCT的检测用以识别心肌梗死的患者[34]。研究结果显示：将全血hs-cTnI的截断值设置为小于4ng/L时，排除心肌梗死的敏感性为98.9%（95%CI，93.8%-100%），阴性预测值为99.5%（95%CI，97.2%-100%）。Bruinen等[35]进一步使用POCT比较毛细血管血液、静脉全血及血浆在检测hs-POCT的差异，研究发现毛细血管血和静脉血之间的差异显示出7.1%的恒定偏倚，而在静脉全血与血浆之间没有观察到显着差异。这项研究提示我们在使用POCT检测样本时，一定要注意样本种类对结果的影响。
POCT规范化管理，是它为临床提供准确检测结果的重要保障。相比较与分析中和分析后，分析前（仪器状态、试剂、样本状态等）对POCT的检测影响更大；同时影响患者住院时间[36]。在质控方面，每天需要检测质控品，确保仪器在控。针对室内质控，要求POCT仪器每天至少检测两种浓度的质控品，并且CV≤20%。同时建议参加室间质控， 室间质控的样本需要至少一个包含第99百分位，且总体误差≤35%。在比对频率方面，要求机构临床科室的POCT仪器每半年内至少与中心实验室的cTn检测仪器进行比对一次，测量结果的偏倚≤20%[9]。不经常使用POCT仪器的人员中，其使用POCT的错误率为9.3%，而频繁使用仪器的错误率为5.6%[36]。因此我们在人员管理方面，需要定期进行培训和考核，以提高操作人员的技术熟练度。
三、小结
肌钙蛋白作为心血管疾病的生物标志物，在ACS及AMI的早期诊断及危险分层方面具有非常重要的临床价值。在本文论述中，我们初步总结了肌钙蛋白临床检测中常见的干扰因素及处理措施；同时归纳了肌钙蛋白的质量控制管理。这些措施有助于帮助临床检验人员提高对肌钙蛋白的认识和重视，将肌钙蛋白更加真实的数据报告给临床，帮助临床医生早期识别危险患者。
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