高灵敏度心肌肌钙蛋白即时检测临床应用与面临的监管挑战
【摘要】国际临床化学联合会（IFCC）心脏生物标记物临床应用委员会（C-CB）的主要作用是提供有关心脏生物标记使用的教育材料，强调高灵敏度心肌肌钙蛋白测定。这篇是关于高灵敏度和即时心肌肌钙蛋白检测的小型综述文章，本文提出了：（1）新的IFCC C-CB/AACC学会实验室操作建议；（2）心肌梗死第四次通用定义的新概念和更新；（3）即时检测在实践和研究中的作用；（4）关于即时检测的监管挑战；（5）在COVID-19流行期间进行检测。高灵敏度心肌肌钙蛋白检测的实施在现在和未来的临床实践和研究中都有很大的不同。适时提供即时的高灵敏度心肌肌钙蛋白检测并优化研究，以保证监管机构及时批准这些检测项目，可能会改善患者管理和结果。
如何在实践中实施高灵敏度的心肌肌钙蛋白（hs-cTn）检测并不是一个统一的过程。国际临床化学联合会（IFCC）心脏生物标志物临床应用委员会（C-CB）提供了关于心脏生物标志物的教育材料，强调了hs-cTn检测。hs-cTnI和hs-cTnT检测监管许可的增长（图1）可在IFCC C-CB网站上找到。这篇关于hs-cTn检测的小型综述（1）强调了新的IFCC C-CB/AACC学会实验室实践建议；（2）阐述了第四次心肌梗死通用定义（UDMI）建议中的新/更新概念；（3）讨论了护理点(POC)检测在实践中的作用；（4）确定与POC测定有关的监管挑战。
注：IFCC C-CB/AACC科学院hs-cTn实验室实践建议
图1. 临床使用hs-cTn测定的监管许可的代表性时间表
AACC学院与IFCC TF-CB合作提出的共识建议涉及将当代检测方法转化为hs-cTn。专家意见和临床实验室实践建议hs-cTn分析集中在10个主题：（1）质量控制（QC）的使用；（2）可报告分析下限的验证；（3）用于报告患者和QC材料的可测量浓度单位；（4）第99百分位性别特定参考界限（url）；（5）定义hs-cTn测定所需的标准；（6）与临床医生就分析前和分析中混淆结果的问题进行沟通和教育；（7）作者如何在hs-cTn研究中记录分析测定细节；（8）协调分析结果和可交换材料；（9）从样本采集到收到结果报告的时间；（10）连续hs-cTn浓度随时间的变化以及生物变异在解释结果中的作用。表1所示的新做法包括在性别特异性URL中使用QC，强调不要进行一项能力不足的研究来建立URL，适当的统计数据在定义第99百分位数中的作用，检测限（LoD）在定义单独测量≥50%正常男性和女性（不合并）的hs-cTn分析中的重要性，以及用整数（指定ng/L）报告hs-cTn结果，以区别于当代测定。
最近的一项研究使用健康问卷和替代生物标志物筛选的通用样本库，确定了9项hs-cTnI和3项hs-cTnT测定的总体和性别特异性第99百分位数。受试者年龄、民族和种族多样化。总体和性别特异性的第99百分位数显示hs-cTnI和hs-cTnT检测之间和内部存在实质性差异。男性的第99百分位数高于女性（图2，A-cTnI；B-cTnT）。根据所使用的统计方法和测定方法，总体和性别特异性的第99百分位数都有所不同。并非所有的检测都能在女性中提供足够高的可测量浓度百分比，从而符合hs检测的资格，而且用于定义正常的替代排除标准往往会降低第99百分位数。
图2. 它与大多数女性相比，男性的多项hs-cTnI（A）和cTnT（B）检测的第99百分位URL更高。经Apple等人许可复制。
在美国检验医学、急诊医学和心脏病学生物标志物专家与FDA召开会议后，针对寻求cTn 510k检测清除率的制造商进行的研究，发布了统一的分析和临床标准指南。建议涉及：（1）确定第99百分位数的参考个体数量；（2）定量限度；（3）总不精度要求；（4）诊断研究的受试者入登记；（5）患者裁决程序；（6）临床终点和结局。重点是确保hs-cTn测定适用通用协议。不幸的是，公布的建议并没有得到FDA的认可。
一、心肌梗死第四个通用定义的建议
为了对出现心肌损伤症状的患者进行全球协调，UDMI协助临床医生共同关注如何根据IFCC C-CB和AACC Academy指南利用生物标志物。首先，它建议在有证据表明cTn增加且至少有一个值高于第99百分位性别特异性URL时使用心肌损伤。在连续采样期间，cTn升高和/或下降被认为是急性心肌损伤。图3为代表性心肌损伤。临床情况的复杂性可能使区分损伤的具体个体机制变得困难。其次，更多地关注2型心肌梗死的识别，这是在与急性冠状动脉血栓形成无关的氧气需求和供应失衡的环境中定义的。如果心肌损伤不是急性的，并且与慢性结构性心脏病有关，那么cTn序列值可能是稳定不变的。第三，cTnI和cTnT仍然是诊断心肌梗死和心肌损伤的标准生物标志物。cTn释放到循环中取决于损伤心肌周围的血流，并且由于cTn测定没有标准化，因此增加、峰值和下降值的动力学取决于测定。利用hs-cTn分析，大多数规则进入/排除的决定是在初始采样后3小时内做出的，基于分析相关算法。第四，hs-cTn检测提供的分析灵敏度对于早期排除至关重要，并有助于确定检测依赖的δ。建议强调临床医生应接受实践中使用的具体测定方法细节的教育。第五，UDMI支持IFCC指南对hs-cTn检测的定义，该指南基于不精确性（性别特异性URL值为10%CV）和在男性和女性中分别测量高于LoD≥50%的正常受试者的能力，将hs检测与当代和POC检测区分开来，后者通常在分析和临床诊断用途上较差，无法定义生物学变异。
图3. 心肌损伤和心肌梗死的概念模型。经Sandoval许可复制
二、POC检测在实验室hs-cTn时代的临床应用
1. POC检测的基本原理：使用POC检测的基本假设是，快速提供结果将对临床决策产生直接影响。证据有限。表2总结了比较POC和中心实验室检测的随机对照试验，结果不一致。研究表明，根据治疗效果或住院时间判断，结果有明显改善，而一些研究则没有影响。一个一致的发现是，为了对临床决策产生影响，生物标志物的测量必须整合到一个明确的临床途径中。在使用心脏标记物面板分析的随机评估治疗试验中，对患者流量的详细分析显示，由于不同医院使用的临床途径，住院时间之间存在明显差异。对POC测试进行的系统性循证审查发现，需要将POC纳入决策途径，作为证明效益的关键要求。研究使用了cTn POC方法，其分析灵敏度与进行试验时中心实验室的方法相当；使用基于超过使用中的诊断临界值或第99百分位数的诊断。尽管这些研究支持POC检测的作用，但它们与当前的临床诊断策略不兼容。任何研究的两个关键要求是POC检测具有与中心实验室cTn检测（现在是hs-cTn）相当的分析性能，以及提供测试结果显然是诊断途径中的限速步骤。
2. hs-cTn和快速诊断算法时代的临床决策：将hs-cTn检测引入常规临床实践，导致cTn测量在决策中使用的方式发生了转变。诊断途径不再仅仅基于入院后6小时（或更长时间）的连续采样，直到连续测量值（δ值）之间的显著变化超过第99百分位数。诊断途径现在利用了这种检测方法的两个关键特征，即测量低值（如LoD）和高于LoD的低cTn值的能力，两者都具有可接受的CV%。用户需要对欧洲心脏病学会（ESC）最近发表的0小时/1小时和0小时/2小时算法的测定特异性hs-cTn截止浓度保持谨慎，因为ESC指南表5中公布的值与2020年指南中未引用的循证文献不一致。测量高于LoD的hs-cTn值已被证明是测定特异性的，这也可靠地识别出30天内不良事件（心肌梗死、损伤、死亡）风险低的患者。根据入院时的单一cTn测量，结合临床评估和心电图，患者通常可以安全并立即从急诊科（ED）出院。这种策略对急诊科医生很有吸引力，因为它允许≥20%出现缺血症状的患者立即出院。用低CV%的hs测定法测量低cTn值的能力也被用于使用短采样间隔。cTn测量在入院时进行，并在1、2或3小时后重复进行，从而可以快速分类患者是否出院（排除）、立即入院（纳入）或需要进一步调查（观察）。当初始cTn仍然小于与性别相关的第99百分位URL，但还没有低到足以推动“一次完成”协议时，就会采用这种方法。欧洲心脏病学会支持这种快速诊断算法。英国国家健康与护理卓越研究所对基于hs-cTn算法的快速诊断的支持进行了系统评价。当入院测量超过第99百分位数时，需要进行连续检测，以确定心肌损伤是急性（上升模式）还是慢性（静态，平缓模式），以便进行适当的分诊，并可能需要再6小时的样本。
快速诊断算法似乎非常适合POC测试。绝对需要注意的是cTn POC测试必须证明高灵敏度的分析性能。目前，大多数POC cTn测定最多只能作为伴随测定。这种系统完全足以判断心肌损伤，但需要重复采样，通常在入院后3-6 小时，以获得足够的临床敏感性来排除。事实上，通过POC对cTn的入院测量在诊断上可能不如单独的入院风险评分。当将超过6小时的采样与基于单一测量的立即出院的可能性或在入院后1-3小时内完成诊断分类的可能性进行比较时，基于中心实验室的hs-cTn测定的优势是明显的，即使周转时间为60分钟。入院1至3小时诊断必须等待3-6小时POC检测，即使全血样本可以在10-15分钟内获得结果。
3. POC检测：分析证据与临床证据：对假定的hs-cTn POC测定的性能声明进行独立分析验证很重要，但这只是临床实施和使用的背景。POC测试必须能够通过单个样本排除或支持快速诊断、串行测试算法来允许立即安全放电。大多数POC分析研究声称在诊断临床效用和不良后果方面与hs-cTn分析具有可比性，但没有得到适当地执行。评估快速排除算法的POC分析研究使用了储存的血浆样本，而不是新鲜的“全血”，这将是一个普遍可接受的验证所必须的。迄今为止，还没有全血或前瞻性研究，无论是观察性试验还是随机对照试验，证明POC检测具有高灵敏度分析性能，在临床上是可靠的、安全的，并能给患者带来益处。这与中心实验室的hs-cTn方法形成对比，试验荟萃分析证明了这一点。虽然有一种检测方法（Pathfast）获得了FDA对POC的许可，其初步数据符合IFCC指南的hs标准，但在实践中，这种大型仪器的用户通常是实验室人员，而不是指定的POC操作员。一些新的、正在开发的POC技术有望很快提供诊断数据，用于实践。
4. cTn POC测试的作用：cTn-POC测试确实具有临床作用，但它是对hs-cTn实验室测量的补充。当无法及时进入实验室进行决策时，POC测试可能是一种解决方案。在农村医疗保健中尤其如此，样本运输时间可能会影响周转时间，将患者转移到更集中的设施进行干预的决定可能需要长途陆路旅行或空中疏散。POC cTn测量已被证明可显著改善澳大利亚农村环境中疑似急性冠状动脉综合征患者的管理。在使用心脏标志物小组测定的随机治疗评估试验中，采用基于第99百分位的现代POC测定和诊断，入院时和90 min时对低风险患者诊断准确且安全。这项研究没有评估单一样本的排除，但确实证明了POC的系列测试表现良好。然而，过度依赖不够敏感的测试测量可能会错过诊断。必须认识到POC cTn的局限性（由于缺乏分析敏感性，入院时可能出现假阴性结果）并将重复检测的必要性（最多6 小时）纳入诊断协议中以排除。然而，通过POC检测的阳性结果可以立即确定患者特征并加快管理。如果将POC和中央实验室检测混合在一个卫生系统内，则存在风险。由于cTn测定既不标准化也不协调，因此试图通过任意匹配诊断截止值来协调不同的测定方法可能会导致诊断灵敏度的降低。
三、POC创新与监管
研发方面的创新和投资带来了颠覆性技术，从根本上改变了患者管理和/或提高了检测性能。创新必须证明其价值，才能被利益相关者（医生、监管机构、付款人）广泛接受。将新产品推向市场时的潜在危害是真实存在的，监管机构的任务是确保设备的安全性和有效性。
在美国以外的监管机构批准后，在众多出版物的支持下，制造商花了近十年的时间才说服美国食品药品监督管理局，hs-cTn检测不仅更具分析敏感性，而且对患者护理也安全有效。为了解决这一问题，2016年签署成为美国法律的《21世纪治愈法案》旨在帮助加快医疗产品开发，并更快、更有效地为需要的患者带来新的创新和进步。它为美国食品药品监督管理局提供了新的权力：（1）改善科学、技术和专业专家的招聘和保留；（2）在保持足够质量的数据的前提下，接受监管批准的替代数据来源，如真实世界的证据；（3）建立新的快速产品开发计划，包括突破性器械计划。如果存在捕捉高质量真实世界数据的技术，这为制造商提供了扩大市场上设备索赔的机会。《体外诊断医疗器械条例》的出台正在加强欧盟的监督和审查程序。目前批准的体外诊断医疗器械制造商将有5年的过渡期，以满足《体外诊断医疗设备条例》的要求。一些关键变化是更严格的文件、严格的临床证据以及根据风险对设备进行重新分类。
随着技术的进步，提供POC hs-cTn测定的能力已经得到发展。监管机构的新指南要求制造商在预期护理环境或尽可能类似的预期护理环境中进行临床研究注册。在美国，如果制造商希望获得POC设备的CLIA豁免，则该设备必须在该环境中由典型的最终用户使用和在操作的环境中受到质疑。美国食品药品监督管理局的研究极难执行，而且成本高昂，因为大多数应用研究机构更喜欢提供专门的研究人员，符合CLIA资格的人员，将研究与临床工作人员分开。美国食品药品监督管理局有一种误解，认为研究人员在进行测试时可能与管理患者护理方面的典型最终用户不同，并没有受到同样的压力。然而，美国食品药品监督管理局要求这些POC研究由负责日常临床职责的典型最终用户（如护士）进行，而不是让研究人员只专注于测试。在世界医院正在经历的新冠肺炎大流行时，在一个已经经济紧张、全职员工不足的情况下给护士增加了负担，这是不现实的。
目前，市场上没有CLIA豁免的POC hs-cTn测试。cTn在获得CLIA豁免方面面临的挑战在于测试的解释和判断方面。CLIA豁免要求操作员能够在没有正式培训的情况下进行测试。测试的设计必须确保非专业人员只需按照试剂盒中的说明即可进行测试，并能够轻松解释结果。除了提供者（护士、临床医生、住院医师、技术人员）之外，除非受到机构内协议的驱动，否则其他工作类别的CLIA豁免操作员很少知道如何处理这些结果。技术的进步使得这些设备很少关心测试的简单性。在最终用户知识有限的情况下进行全血测试，并且与校准和质量控制几乎没有互动，这是POC设备的基线期望。
制造商的任务是证明典型的最终用户可以执行测试，并且结果与同类设备相当。对于POC hs-cTn，期望是制造商将他们的POC设备与510K清除的实验室cTn仪器进行比较。分析精密度、线性度、准确度和证明可报告范围，因为只推荐对hs-cTn进行定量分析。POC设备需要建立自己的第99百分位URL研究。诊断的准确性需要执行，这意味着分析的准确性不足以证明FDA批准的安全性和有效性。预计POC hs-cTn检测的验证与中心实验室方法没有什么不同。然而，在美国，FDA对POC分析清除率的要求比中心实验室方法更困难。
四、未来监管策略
在全球范围内，必须考虑两个重要问题：（1）如果可以从一个平台到下一个平台证明分析的有效性，那么临床研究是否仍然是必要的；（2）在POC研究的新鲜全血采集中，是否需要重复显示血浆和全血相似性能的基质研究？目前尚不清楚在成本、时间表和创新方面，更多的监管将带来什么，以平衡体外诊断产品的安全性和有效性的提高。
需要一个监管系统，允许对特征良好的测试进行评估，以进行修改，而无需提交新的性能证据，等待数年才能将下一代测试推向市场。相信该系统能够在不扼杀创新的情况下进行监管，可以更有效、更安全地将设备推向市场。根据为已知预期用途收集的循证分析和临床文献，如今将新型hs-cTn设备推向市场的“风险”大大降低。上市后分析可以帮助降低新的预期用途或前几代产品的增量改进的风险，而无需重新申请新的监管许可。能够通过创新的监管流程减轻这些风险，将在不影响患者安全的情况下平衡对改进产品的需求。随着患者管理的改善，将更好地预测患者的不良后果，为医院和患者节省大量成本。
我们建议美国食品药品监督管理局考虑以下程序，将患者纳入制造商的510 K提交。
1. 包括美国食品药品监督管理局在内的监管机构应编写一份指导文件，描述提交审批所需的最低要求，就像他们对葡萄糖POC测试所做的那样。有了指导，制造商将有更一致的研究方案、人群和上游器械的潜在用途。目前，研究方案之间存在太多差异，制造商收到的反馈也不一致。
2. 使用基于新抽血的IRB知情同意流程，修改ED中确定的受试者入组的不一致和有偏见的情况。这种做法耗时，昂贵，并且错过了超过70%符合入组条件的患者，使得研究人群与实际做法相比存在偏见。
3. 从患者的临床指征中获得IRB批准的废弃样本，这些样本已经在实验室中用于检测血浆和血清，以及可能的EDTA全血残余样本，除了需要新鲜的毛细血管样本。
4. 当患者前来治疗并在进入医院系统前进行登记时，应向患者提供一份授权和同意表格，其中包括明确规定该机构进行研究的部分。病人可以自行选择同意或不同意参加医学研究，以便更好地了解疾病和如何提供护理，并通过签署文件同意调查人员可以使用已经收集的健康信息和废物标本。这将允许患者全天候连续登记，而不会因知情同意而延迟抽血，用匹配的血浆或血清样本实时检测全血，从而实现快速样本处理，并使用与实际测试相匹配的新鲜样本进行分析，而不是冷冻和解冻，通常是分批进行。
5. 这种新的做法将允许制造商在3到4个月内在3个以上选定的机构招募2500多名患者，允许更快速地获取和汇编数据，更快地创建文件草案提交给美国食品药品监督管理局审查，并通过将2到3年的流程缩短到1年以下，节省大量资金。
最后，美国食品和药物管理局能够进行快速审查，并且在新冠肺炎大流行期间非常灵活（审查时间为数天至数周，而正常情况下为数月至数年）。我们认为美国食品药品监督管理局也应该找到更有效的途径来获得510k的许可。FDA应考虑在新冠肺炎大流行期间，在不牺牲质量的情况下，对新型hs-cTnI和hs-cTnT POC设备和测定进行紧急使用授权。虽然可以理解的是，当紧急使用授权期结束时，该测试将需要510k的许可才能留在市场上；这段时间将使制造商能够收集510k份提交的数据。这将有助于市中心和农村的提供者快速测量hs-cTn，这是一种在现在和未来都会产生影响的心脏生物标志物；“时代在改变。”
本文编译自：Clinical Chemistry，2021，（67）：1，70-78.
