呼吸道病毒感染即时检测技术现状与发展趋势
【摘要】在诸如新冠肺炎（COVID-19）大流行等资源匮乏的情况下，使用即时检测（POCT）技术对疾病进行现场检测正在成为克服危机和挽救生命的关键因素。对于适用的POCT，应在简单便携的平台上进行价格低廉、灵敏和快速的检测来代替实验室设备。在这篇综述中，介绍了检测呼吸道病毒靶点的最新方法、趋势和前景。呼吸道病毒无处不在，是人类社会中最常见和广泛传播的传染病之一，如季节性流感、禽流感、冠状病毒和新冠病毒。呼吸道病毒的现场检测和POCT是该领域最先进的技术，也是具有商业价值的全球医疗保健主题，前沿POCT技术专注于检测呼吸道病毒，用于早期诊断、预防和监测，以防止新冠肺炎的传播。文中强调了传感技术在每个平台上的应用，以揭示开发阶段的挑战，从原理、灵敏度、分析时间和现场应用的便利性等方面总结了最新的POCT方法，还提出了使用POCT技术检测呼吸道病毒存在的挑战和前景，以便提高保护能力和预防下一次的大流行。
呼吸道感染是最常见的疾病之一，在短时间内广泛传播，甚至导致全球大流行。近20年来，由呼吸道病毒引起的严重感染和疾病不时危及公共卫生，造成了严重的社会影响。例如，2003年的严重急性呼吸综合征（SARS）仅在几个月内就造成700多人死亡，2009年的甲型流感病毒（H1N1）造成了41个国家的1万名患者感染，2015年仅韩国的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）造成了185例已知感染，其中38例死亡，被称为COVID-19，SARS-CoV-2引起的全球大流行，迄今（2022年初）在全球造成500多万人死亡。感染检测是控制大流行措施的重要组成部分，通过识别传染人群、监测人群中疾病进展以及为公共卫生措施和适当治疗提供重要数据，有助于控制感染的传播。对感染早期阶段的快速诊断可以实现更有效的隔离、隔离感染者和及时的医疗护理。有效的诊断方法需要足够的灵敏度、特异性和快速的周转时间，并获得快速（约30min）的检测结果，理想的平台需要低成本、便携并且非专业人员经过最少的培训即可使用。即时检测（POCT）是小型诊断设备，可以在实验室之外的非传统检测场所（药店、学校、机场、养老院、企业、医生办公室和家庭使用）使用，并作为非处方药在商店或通过网络出售，用于现场检测病毒病原体。在整个大流行地区，特别是在资源匮乏的情况下，如患者众多的地区，迫切需要POCT。
一、POCT检测技术的发展
由于研究资金和商业投资的增加，在过去的30年中已经开发了各种POCT技术。特别是台式或自动化诊断流程简化并以POCT微流控“芯片实验室”模式操作。基于微流控的POCT随着依靠支持设备（包括离心，磁驱动和热控制的组合）精心制造的芯片而取得了巨大进展。此外，非仪器化的纸基平台，如侧流免疫层析检测，包括用于妊娠试纸和血糖仪的检测，已获得市场上广泛认可。随着纸打印技术和毛细管流动控制技术的发展，除了免疫检测外，使用纳米材料、折纸、核酸扩增分析等的纸基设备的功能和复杂程度也在不断提高。世界卫生组织（WHO）为在资源匮乏的环境中开发理想的POCT制定了七项标准，（1）负担得起；（2）灵敏；（3）特异；（4）用户友好；（5）快速而精准；（6）无其他设备负担；（7）可交付给终端用户。对应于首字母缩写“ASSURED”标准，为开发实用和信息检测的POCT设备提供指导。如图1所示，POCT允许在临床实验室之外，在患者旁进行初级医疗诊断，如医生办公室、路上和个人家中，这可以促进快速和更广泛的检测。
图1. 即时检测（POCT）的优点和POCT流程的四个阶段。POCT是在患者所在或附近进行的医学诊断检测。POCT包括四个分析阶段：样本处理、平台装载、感应分析物和读取结果。
图1描绘了POCT过程的四个分析阶段，大多数情况下在此过程中进行从样本到结果的检测。在样本处理阶段，通过拭子（一种独特的简化过程）收集含有呼吸道病毒的样本，然后纯化和浓缩靶生物分子。下一阶段，将预处理样本加载到检测平台上，该平台允许流体操作以诱导精确的流动或化学和生物反应，POCT平台可能具有泵、阀或离心的微流体通道，易于操作或预混合的溶液以及干燥试剂纸片。在分析物检测阶段，每种呼吸道病毒的生物标志物与识别和报告基因结合，分析物和抗体的特异性结合或核酸扩增过程中独特DNA/RNA序列的识别是该阶段的代表性反应。最后用读取器系统分析传感分子信号，包括比色、荧光和电化学信号，所有信号读数，例如检查颜色变化，检查侧向流动试条上的线、通过移动读取器（包括智能手机）拍摄照片或信号、仪器进行实时监测，都是在读取结果阶段进行的。
本文综述中描述了呼吸道病毒POCT的最新方法，对应用于各种类型的甲型/乙型流感、MERS-CoV和SARS-CoV-2的新型POCT技术进行了调查和分类。文中重点介绍了每项工作的平台和传感技术，特别是从“平台加载”阶段到“分析物传感”阶段，对近年来呼吸道病毒代表性传感技术在溶液、微流控和纸基平台中的应用进行了总结和综述，从最近的论文来看，以微流控为代表的芯片实验室和基于纸基的分析设备是所有POCT领域最有前景的两个平台，描述了免疫诊断中的纸基和分子诊断中的微流体的当前趋势。为了研究各种方法的优缺点，我们比较了每种方法所需的时间、检测限（LOD）和与ASSURED标准相关的其他定性评估。
二、呼吸道病毒感染POCT检测技术
1. 传感技术原理：在呼吸道病毒POCT中，诊断的分析物感应阶段涉及特定生物标志物的分子识别，如病毒衣壳上的独特抗原、核蛋白和DNA或RNA病毒基因组中的特定序列。呼吸道病毒检测主要有免疫和分子诊断两种类型的诊断技术，免疫诊断是基于抗体与病毒抗原或其他病毒特异性分析物的特异性结合。POCT免疫诊断利用特异结合分析物的单克隆抗体与报告基因连接的二抗（如量子点或荧光团）以及与信号产生相关的反应，实现灵敏和特异的检出。分子诊断是一种基于呼吸道病毒特定基因中核酸独特序列的传感技术。呼吸道病毒即时检测的灵敏度对于准确可靠的诊断至关重要，通常需要扩增提高灵敏度，所需的检测限取决于患者样本中的病毒载量，病毒载量可能因感染的类型和阶段而异，了解这些因素对于开发和优化呼吸道病毒的有效即时检测至关重要。随着使用某些DNA聚合酶的核酸扩增技术的进步，分子诊断在早期检测中显示出高度灵敏和特异的诊断结果。许多基于分子诊断的POCT研究已经将其平台与几种技术相结合并整合，以准确、灵敏和特异地检测呼吸道病毒。这篇综述中，从原理、反应条件、常见名称和主要特征方面简要总结了POCT中常用的传感技术。
（1）使用抗体的免疫检测：对免疫系统分子具有特异性结合亲和力的抗体被广泛用于快速免疫诊断POCT。抗原和抗体之间的高度特异性结合亲和力为呼吸道病毒检测提供了一种周转时间相对较短的诊断工具。在各种抗体检测技术中，酶联免疫吸附试验（ELISA）是最常用的抗原检测分析生物化学方法之一，使用具有两种抗体和标记或相关酶活性的夹心检测法产生一些光学变化，例如酶反应结果的比色信号。ELISA通常使用固相固定在含有共价结合抗原或抗体的96孔板，ELISA的多重反应和洗涤步骤在资源匮乏的条件下应用有一些局限性，因此，POCT方法的便利和进展已被广泛报道。另一项值得注意的抗体诊断技术是基于纸条传感器的侧向流动免疫测定（LFA），LFA也称为免疫层析法，通过多孔膜诱导毛细管作用和免疫反应，以条带形式检测目标分析物。LFA具有反应迅速、易于储存和运输、操作方便、成本低、便于大批量生产等优点，纳米金及其含有抗体的复合物已被广泛用作LFA中比色信号的标记探针。与ELISA类似，使用同一分析物不同结合位点的两种抗体对LFA试纸条上的病毒颗粒进行选择性检测。近年来，呼吸道病毒POCT在提高灵敏度、选择性和各种功能的新型附件方面取得了许多进展。免疫分析具有结果快速、使用方便、成本低廉等优点，目前的缺点是灵敏度有限、交叉反应、依赖经过培训的人员以及病毒亚型检出有限。
（2）适配体结合：适配体是一类短单链核酸，可以识别从小分子到蛋白质、细胞和病毒等多种靶标。适配体的分子识别具有与抗体相似的高亲和力和特异性，与抗体相比，适配体具有成本低、易于合成和标记、在各种条件下稳定、批间变化小等优点，基于这些特性，适配体在资源匮乏和恶劣条件下的应用非常有利。核酸适配体结合检测的方案多种多样，如标记DNA功能序列、结合等温扩增、在金电极表面进行电化学检测等。适配体的检测具有稳定性好、通用性强、易于设计和修改的特点，但核酸适配体技术存在灵敏度低、缺乏临床验证、批间变异等问题。
（3）逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）：聚合酶链式反应（PCR）是第一种用于扩增和检测核酸的方法，PCR被认为是核酸分析最可靠的方法。在2020年COVID-19引发广泛的公共卫生问题后，RT-PCR技术被美国疾病控制与预防中心（CDC）认为是第一种诊断技术，作为“金标准”，许多研究小组采用RT-PCR建立核酸扩增测试（NAAT）平台进行病毒检测，通常，在RT-PCR检测中包括热稳定的RT酶和DNA聚合酶，如Taq聚合酶，此外，需要一个一体化荧光捕捉器的良好控制热循环机器。标准PCR过程可能在样本制备后超过2小时才能获得结果，还需要一个仪器来进行精确的温度循环，因此，标准PCR检测仅限于实验室使用，并且可能因为耗时而效率低下。
（4）重组酶聚合酶扩增（RPA）：为了提高扩增系统的效率和便携性，几十年来越来越多的研究人员一直致力于开发等温核酸扩增方法，与PCR相反，等温扩增技术允许在相对较低且恒定的温度下扩增靶标而不损失产量。重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种广泛使用的等温扩增检测法。在应用中可以使用简单的孵育装置。通常，在大约37-42℃下运行，只需要10-20min即可产生可检测的信号。首先，引物与重组酶结合，形成重组酶-引物复合物，通过这种方式，dsDNA与互补的同源序列杂交，促进同源位点引物的链入侵，单链DNA（ssDNA）结合蛋白与从靶标移位的DNA链结合，有助于避免嵌入引物的移位，最后一步，具有链置换活性的蛋白质与3'端的引物结合，进行链延伸，通过重复循环，靶标可以在几分钟内很大程度的放大。RPA在相对低温的简单培养系统中具有反应快、灵敏度高的特点，然而应该在多路复用功能有限、价格相对昂贵、存在假阳性结果和缺乏临床验证方面进行改进。
（5）环介导等温扩增（LAMP）：它与RPA类似，环介导等温扩增（LAMP）是一种简单、快速、经济的流行方法。它与RPA不同，LAMP需要至少2个针对6个不同序列位点（F1、F2、F3、B1、B2和B3）的引物组（FIP/BIP和F3/B3），该特性提供了相对较高的特异性。在适当的温度（~65℃）下，FIP的F2区域由于浓度高于F3，首先与靶标上的位点结合，并被DNA聚合酶延伸，在F3引物与该位点结合后也会被延伸，这导致从F2延伸的链发生位移，新形成的链在其5’末端转变为一个环结构，其中F1和F1c位点是互补的。同样的，在反向侧，BIP的B3和B2将执行与正向侧相同的过程，因此，形成具有双环的哑铃形DNA并进入指数扩增循环阶段，环引物（LF/LB）可作为LAMP的替代方法，有助于加速反应并获得较低的时间阈值。这与PCR和RPA不同，LAMP的扩增产物是一簇可变长度的恒定重复靶点，LAMP技术有望在60min内产生约109个扩增产物，LAMP技术可以与许多检测方法相结合，如荧光读数、侧流分析和CRISPR（规律间隔成簇的短回文重复序列）工具。此外，当与其他等温方法相结合时，该方法能够在一个反应中进行多重靶标检测，以提高其性能。毫无疑问，LAMP可以在即时检测和远程及时检测情况下发挥更重要的作用。LAMP作为目前主流的等温扩增技术，在近年来的研究中发现其具有结果快速、灵敏度高、特异性强、操作简单、多路复用等优点。但尚需更多研究来充分验证其临床应用价值，假阳性、引物设计的复杂性和有限的通量也是LAMP技术面临的挑战。
（6）CRISPR-cas技术与等温技术：近年来，从原核生物抗病毒防御系统开发的规律间隔成簇的短回文重复序列（CRISPR）技术已被应用于基因组编辑，成为一种可编程、高度特异的基因组编辑工具。该技术因其高灵敏度和特异性被应用于单细胞成像、单核苷酸变异分析、DNA/RNA传感等多个领域，也被用于核酸检测。SHERLOCK（特异性高灵敏度酶报告基因解锁）是一种基于CRISPR的高级核酸检测系统，该系统建立在Cas13a酶的基础上，在识别其特定的DNA靶标后，具有混杂核糖核酸酶（RNase）的附带活性。通常SHERLOCK系统中有三个关键成分：Cas13a酶、引导RNA（gRNA）和特异性靶扩增产物。gRNA由两部分组成，一部分可以与Cas酶对齐并结合，另一部分与靶扩增产物互补，形成三联体后附带效应被激活，这样，混合物中具有荧光基团和猝灭剂的双标记探针将被不加区分地切割，导致荧光信号的分离和激活，探针通常用荧光基团或猝灭剂标记。基于这一效应，研究人员对寨卡病毒和登革热病毒进行了研究。最近，开发了一种改进的SHERLOCKv2，它可以在商业侧流条上产生视觉色度的读数结果，这种方法可以简化对检测结果的解释，并避免使用荧光检测仪器。此外，SHERLOCKv2被认为优于SHERLOCK，因为整个过程可以在一个步骤中整合和组合，可以直接将样本转移到条带而无需纯化或分离核酸。CRISPR工具在诊断中的应用越来越多，在COVID-19大流行期间，CDC批准SHERLOCK作为一种用于识别无症状患者的及时筛查工具。
2. 呼吸道病毒的采样：采样是呼吸道病毒POCT的重要组成部分之一。大多数呼吸道病毒的POCT涉及从上呼吸道（如鼻腔、鼻咽或喉咙）收集样本，可以使用拭子收集样本，然后将其处理到下游传感技术。如图1所示，从该拭子或收集样本的处理可能会对检测性能以及其他检测过程产生重大影响，另一方面，人们越来越关注使用呼出气作为呼吸道病毒POCT的采样方法。呼气中可能含有病毒颗粒的飞沫，对呼气进行采样可能是一种无创且经济有效的病毒收集方法。历史上严重的流行病与空气传播病原体有关，在现代全球社会中，有效检测空气传播病原体变得越来越重要。采样系统可以在简单平台上与快速诊断技术整合。已经开发了盒中的生物气溶胶采样/监测系统，这项工作表明，基于合成纳米颗粒的高灵敏度免疫分析可能成为最低配置下快速监测系统的一种有前景的方法。几项研究调查了呼气采样的使用，这些研究取得了有前景的检测结果，呼吸样本和标准液体样本之间具有良好的相关性。然而，包括呼出气体或生物气溶胶在内的空气传播病毒的POCT需要更多的研究来验证气体样本的使用以及在各种条件下的许多可靠结果，空气传播下的POCT是该领域最具挑战性的领域之一。
三、POCT应用案例
诊断技术通常在微流控或纸基平台上进行简化和小型化，以实现该领域的快速、便携和方便使用。一些研究报道了具有高度便捷性和敏感性的独特解决方案，这些结合了磁体、分子探针和信号染料的比色结果，与以往成熟的检测呼吸道病毒的技术相结合，具有高度的便利性和灵敏度。如图2a所示，开发了一种简便的磁体联合移液ELISA检测甲型流感病毒的方法。溶液中的磁珠用于磁珠捕获抗体靶向蛋白质复合物中，通过使用环形钕磁体移液分离靶标。两种抗体与甲型流感病毒的核蛋白结合，通过注入的磁珠复合物过氧化物酶活性溶液，抗体结合辣根过氧化物酶（HRP）产生比色信号，使用磁珠和带磁体的部件在50min内完成ELISA从结合、洗涤和信号产生的过程。移液免疫测定显示甲型流感病毒104 EID50，比侧向流动系统敏感100倍。在图2b中，报道了使用适配体代替针对甲型流感病毒的抗体的酶联寡核苷酸测定法（ELONA），选择的DNA适配体与金电极表面上的H1N1和H3N2病毒结合，产生电化学信号，该测定基于适配体和病毒颗粒之间的特异性结合，在60min内进行，检测限为0.9pg/μl。建立了一种使用酚红pH指示剂产生比色信号的方便的LAMP方法，并用于检测SARS-CoV-2。用COVID-19患者呼吸道拭子的RNA样本验证该方法，并使用具有同等性能的商业RT-qPCR进行了确认。在LAMP溶液管中，基于从粉红色到黄色的颜色变化，在30min内检测到120拷贝的纯化RNA。比色LAMP方法能够在实验室之外进行检测，无需昂贵的仪器，可为COVID-19检测提供一种有效的快速诊断工具。据报道，将RPA和LAMP相结合的单管检测方法“Penn-RAMP”也用于家庭、诊所和入境点的COVID-19检测。使用两阶段等温扩增进行Penn-RAMP。如图2c所示，首先对加有RNA的鼻拭子进行RPA，然后将RPA产物和LAMP溶液混合，其次在封闭管中进行高灵敏度的LAMP，同时产生荧光和比色信号，两阶段扩增技术在40min内可达到7拷贝的检测限。图2d显示了使用CRISPR-Cas12a分子探针在一步法早期快速检出SARS-CoV-2的情况，在靶序列的RPA反应期间，一对crRNA在启动双重CRISPR检测中起关键作用，并提高比色和荧光报告基因的灵敏度，CRISPR-Cas12a系统的分子探针在40min的孵育时间内检测限为10拷贝。这些解决方案在与便携式平台或小型化系统结合后显示出成为POCT的潜力。
图2. 最新的反应管中进行的POCT技术
四、微流控平台的呼吸道病毒POCT
微流控芯片是使用光刻技术或其他成型方法在玻璃，硅或聚二甲基硅氧烷（PDMS）等材料中形成的小型流体电路，微流控系统可以实现复杂的具有减少样本和试剂，更紧密地控制流体流动和快速分析优点的台式机设置。随着制造技术和纳米级通道的进步，微流控组件中的小型复杂技术被称为芯片实验室，可以处理极小的流体体积，成本低，分析时间快，并且可以很好地控制样本浓度。当实验室设备用于免疫诊断或分子诊断系统时，芯片实验室技术专注于医学诊断的应用，在过去二十年中微流控设备的临床性能逐渐发展。然而，微流控芯片通常使用外部设备，如气动泵、阀门和其他通道进行操作，由于这些复杂的流体控制系统，一些微流控平台经常需要中央实验室规模的设备或昂贵的仪器来进行现场分析。在小型化系统上的小体积分析成为了高灵敏度和特异性芯片实验室技术应用的真正障碍。最近，为了克服这些限制，磁力、离心和试剂储存已经有效地取代了泵、混合和洗涤过程，从而形成实用POCT平台。通过这些方法，微流控设备已成为呼吸道病毒感染的快速、准确和自动诊断工具。
微流体平台中POCT的一些最新方法如图3所示，已经在具有特殊应用的微流控芯片中开发并优化了代表性的传感技术，包括抗体的夹心测定，RT-PCR和LAMP。图3a介绍了一种用于多重流感检测的磁珠自动抗体检测方法，利用了磁性和磁珠大小介导的微流控芯片。多重流体阀和计算机程序控制可实现磁珠-抗体复合物免疫测定的自动操作，磁分离后，复合物在检测区被捕获并与量子点反应产生荧光信号，使用不同大小的磁珠可同时检测多种亚型流感，在20min内H7N9和H9N2检测限浓度分别为3.4ng/ml和4.5ng/ml。图3b中是用于禽流感比色检测的智能手机与微流控POCT系统的组合。以ZnO纳米棒在PDMS芯片的表面上形成流感病毒、金纳米颗粒、抗体和银壳复合物的3D纳米结构。在微流体中进行了从芯片表面上的抗体结合、靶病毒结合、金纳米颗粒的夹心检测到银壳的信号增强等多个过程，使用带有的偏振器对智能手机设置进行比色检测，以提高灵敏度。分析在90min内完成，通过偏振器和智能手机设置，该平台甲型流感病毒8×103 EID50/ml，其灵敏度是传统荧光ELISA的三倍以上。文中道了一种利用核酸适配体和抗体磁珠检测甲型H1N1流感病毒的数字微流控免疫检测平台，含有磁珠复合物的液滴由芯片疏水表面的电磁力驱动，通过结合HRP产生荧光信号，像ELISA检测一样，数字微流控磁珠法的甲型流感病毒为0.032HAU/反应，在40min内即可达到临床诊断的灵敏度。图3c为用于快速、甲型流感病毒亚型多重检测的一体化微流控芯片的照片和分解图。使用血凝素和神经氨酸酶阵列的微流控芯片，利用聚糖包被磁珠的RT-PCR对甲型流感病毒进行多重诊断。在多层芯片上，整个分析过程包括样本上样、孵育、磁体洗涤、重悬、病毒热裂解、RT-PCR和检测，均在100min内完成，可同时检测12种甲型流感病毒亚型，检测限为40-3000拷贝，用于实时比色检测多种甲型/乙型流感病毒的等温扩增微流控芯片如图3d所示。用磁珠对溶液中样本拭子进行核酸提取，并与微室集成的八通道微流控芯片中进行靶特异性等温扩增以产生比色信号，使用连接的实时检测器记录多重颜色变化信号，整个过程（包括样本采集，RNA提取，加载，扩增和终点检测）在60min内完成。微流控芯片上的比色LAMP检测限为50-200拷贝/反应，对109份临床样本的灵敏度为96%，特异性为100%。
图3e是使用LAMP快速检测流感病毒亚型的微流体盘，在具有自动流体控制功能的圆盘上同时检测到六种类型的流感病毒，包括甲型H1，H3，H5，H7，H9和乙型流感病毒，用于RT-LAMP扩增和预加载试剂的检测。RT-LAMP离心盘由7层结构组成，包含薄膜盖和双面胶带，具有室温稳定的酶储存区和20个反应室。在圆盘上使用两种荧光染料进行实时荧光检测或肉眼读取，RT-LAMP离心盘在50min内完成了整个过程，每个临床样本的甲型/乙型流感病毒检测限为20-100拷贝。在其他方法中，最近报道了用于SARS-CoV-2检测的高度准确和灵敏的逆转录数字PCR（RT-dPCR）。数字PCR（dPCR）是一种基于微流控芯片中液滴计数的技术，由大量微反应和每个液滴的荧光强度组成。在dPCR中定量是通过统计最初包含一个以上目标核酸的阳性分区中阴性分区的比例来进行。RT-dPCR方法检测限为2拷贝/反应，对真实病例样本的诊断正确率为93%。最近，圆盘中的多重免疫诊断学也已经发表，具有微流体结构的功能化聚碳酸酯圆盘状表面，可一次性分析SARS-CoV-2，甲型/乙型流感，腺病毒和呼吸道合胞病毒的浓度。
图3. 微流控平台的呼吸道病毒POCT
五、纸基设备的呼吸道病毒POCT
纸基分析设备是由纤维素、玻璃、棉花、硝酸纤维素和其他聚合物等多孔材料组成的简单检测设备，在过去十年中取得了巨大进步。纸是制造简单、便携式和低成本生化分析设备的有吸引力的材料，因为纸材料通过其多孔结构通过毛细管力提供天然微流体通道，而无需额外的辅助。随着各种纸图案化方法和改进的发展，可以通过图案化，堆叠和各种其他流体控制来实现多重反应室和多功能纸张装置。
纸基免疫检测因其成本低、反应快、操作简单、产量大等优点而备受关注。LFA是POCT行业最成功的平台之一，以妊娠和尿液检测试纸为代表。许多针对不同靶点的LFAs已在诊断市场上商业化。由于纸质材料为抗体和各种纳米材料提供了生物相容性分析领域，因此许多基于纸基结合先进的纳米颗粒或功能性纳米探针的免疫检测研究取得了进展，许多POCT方法能够接受含有呼吸道病毒的原始样本。LFA中的夹心免疫检测系统可用于检测病毒颗粒，特异性抗体的血清学检测也可能是该领域的有效诊断工具，尽管基于纸免疫分析在高灵敏度和定量分析方面存在局限性，但它仍是一个强大的平台，在POCT中具有实用性和潜力。近年来，利用核酸扩增技术的纸基设备取得了长足的进步，纸基已成功用于简化和小型化的核酸提取、核酸扩增和核酸检测模块，只有少数从样本到结果分析的一体化纸基设备在实际POCT的验证应用仍然存在局限性。尽管纸基分子诊断有待进一步发展，但由于其优势和潜力，许多研究报道了在高收益、快速且可大规模生产的平台上可以灵敏地检测呼吸道病毒。
基于LFA纳米技术的纸基免疫检测是一种具有代表性的纸基材料POCT平台。开发了使用上转换纳米颗粒复合物检测禽流感病毒的LFA。如图4a所示，合成的近红外（NIR）-to-NIR上转换纳米颗粒结合在具有快速和高灵敏度的普通LFA条上。检测线中的病毒结合抗体-纳米颗粒复合物在NIR辐射下从禽类粪便样本中产生强烈的NIR发射。从加样、洗涤、抗体结合到NIR检测的整个分析过程是在包括光学读取器的便携式平台上进行的。由于合成纳米颗粒应用的优势，不透明的棕色样本可以在简单和便携的平台上使用。该方法可在20min内完成禽流感病毒的无背景快速检测，对拭子和粪便样本的检测限为102-103.5 EID50/mL，具有表面增强拉曼散射（SERS）标签替代金纳米颗粒的磁纳米颗粒也被报道为信号报告基因，如图4b所示。磁SERS LFA系统由病毒-抗体合成的纳米颗粒复合物、两条抗体测试线和普通LFA试纸组成。将含有呼吸道病毒PBS缓冲液的样本与纳米颗粒复合物在室温下孵育并用磁体分离，然后用缓冲液悬浮沉淀的结合复合物并加载到试剂条上，利用光学仪器进行SERS读数，在30min内即可检测出50 PFU/mL甲型H1N1流感和10 PFU/mL人腺病毒，比标准LFA试纸条灵敏度提高2000倍。LFA试剂条是纸基平台POCT免疫分析的广泛使用模式，但也报道有其他结构的纸基诊断设备。用于电化学和比色法检测流感病毒的纸堆叠垂直流动结构如图4c所示。在初始阶段，层中的不同孔隙样本垫由两种孔径的纸张组成，以诱导均匀的垂直流动，用于抗体结合和通过过氧化物酶活性产生信号。在优化垂直流动后，在相对较短的分析时间内，在纸张结构的底层进行了酶联免疫检测，由于有重力的毛细管流动，从加样到检测过程中，快速（6min内）发生了通过堆积纸的垂直流动。基于垂直流动纸基免疫检测系统使用比色和电化学法从PBS和唾液中检测到1-4 PFU/mL的甲型H1N1流感病毒。
利用纸基平台核酸检测技术检测呼吸道病毒也在积极开展。使用纸基芯片通过等温扩增检测病毒核酸，图4d是利用金纳米颗粒耦联物和DNA探针对RPA扩增产物进行比色检测的垂直流动芯片。使用RPA从标记引物中制备标记扩增产物，并将其注射到硝酸纤维素膜上，靶扩增产物与抗体-金复合物在垂直流动中结合，阳性斑点显示金纳米颗粒的比色信号。从病毒DNA中检出人腺病毒的时间为60min，包括扩增、纯化、孵育和检测时间，检测限为2000拷贝DNA/反应。在扩增过程中，通过标记在LFA中也检测到RPA扩增产物，使用标记引物对甲型和乙型流感病毒RNA进行双重RPA，产生双标记的双链DNA产物。在一个封闭一次性装置中，通过LFA的双链RPA检测到50-500拷贝RNA，提取的RNA在条带上的双重扩增和检测在40min内完成。
最近，使用CRISPR-Cas技术进行等温扩增的新型检测方案引起了POCT研究人员的特别关注。由T7聚合酶、gRNA序列、标记DNA探针作为信号报告基因和Cas蛋白组成的CRISPR系统在临床诊断实验室之外的POCT中对SARS-CoV-2的高灵敏度检测显示出巨大的潜力。先前已经报道了使用RPA和CRISPR-Cas13的COVID-19检测方案，通过逆转录RPA将SARS-CoV-2病毒基因的RNA片段扩增成双链DNA，然后在含有T7聚合酶，gRNA序列和Cas13a蛋白的CRISPR-Cas系统切割报告基因DNA，最终通过靶标浓度在LFA条带中检测报告基因信号。反应方案和原理遵循先前报道的LFA中使用Cas13a的核酸检测方案，利用合成的病毒RNA片段，基于CRISPR的侧向流动可在60min内检测出10-100拷贝/反应，此外，图4e为LAMP和CRISPR-Cas12a检测SARS-CoV-2。在各自的溶液中使用提取的病毒RNA逆转录RT-LAMP和Cas12蛋白的CRISPR系统等，然后将含有扩增产物和裂解探针的溶液加到LFA试纸条上，通过检测线上产生的比色信号检测SARS-CoV-2浓度。CRISPR联合LAMP对SARS-CoV-2的侧向流动在40min内完成，检测限为70拷贝，在38-42例患者的临床样本分析中具有95%灵敏度和100%特异性。
图4. 纸基呼吸道病毒POCT方法
六、呼吸道病毒POCT检测技术现状与挑战
1. 最新技术的研究与开发：为了实现POCT在呼吸道病毒检测中的应用，已经报道了试管、微流控和纸基平台上的各种研究和开发。对试管POCT的研究集中在磁体、比色染料、方便使用和具有成本效益的即用试剂盒检测，这些研究提供了保持原始技术可靠性能的替代方案，但仍然需要实验室设备，如移液管、冰箱或冰柜，来存储大部分试剂。微流控芯片POCT具有试剂体积小、流体控制、分析时间快，便携、体积小等优点，在最近研究中，微流控芯片已经结合了磁力、离心和多反应室芯片制造，以实现更快速和灵敏的检测性能，大多数微流控芯片需要额外的仪器，如流体泵和阀门以精确控制流体。虽然微流控技术在设备依赖性方面仍有局限性，但小型化、便携化操作设备也取得了进展，微流控技术已被公认为现场诊断中快速、自动化和可靠的平台。纸基POCT作为便携式、低成本和可大规模生产的诊断平台也具纸基生物相容性、成本效益、易于图案化和天然毛细管流动能力的强大的优势。基于这些特性已经报道了纸基平台中的许多传感系统，特别是LFA试剂条中纳米技术。然而，许多领域需要进一步发展，包括将检测过程集成到单个设备中，以及提高灵敏度和进行早期诊断定量分析的能力。
在开发用于呼吸道病毒早期诊断、预防和监测的有效POCT系统过程中，必须从检测所需时间、检测限（LOD）和确保标准的执行情况等方面确定POCT技术的现状。这篇综述简要介绍了最近发表的研究在所需时间和LOD方面的基本原理和性能。这些评价在不同类型的技术之间存在显著差异，因此，将方法分为免疫诊断和分子诊断。表1总结了呼吸道病毒POCT的免疫诊断方法，表中总结了每种方法的目标呼吸道病毒、平台、信号报告基因、分析样本、分析所需时间和LOD。LOD是根据各参考品中使用的单位计算的。为了定性评估POCT的适用性，表中显示了ASSURED标准的一些部分，例如易于制造，操作和存储，便携性，更快速和更具成本效益的潜力以及大规模生产的能力。如表1所示，在分析物传感阶段使用抗体或适配体的每一种免疫诊断都被定性评估为高、中和低适用性。“高”意味着良好的评价和优势，“低”意味着POCT应用的弱点。如表1所示，一些具有较高灵敏度和较低LOD值的研究显示出所需时间较长或定性评价较低的趋势，这是一个合理的现象，因为高灵敏度的分析需要更多的时间或额外的过程来精确控制和操作试剂。纸基平台上的免疫诊断具有相对较短的时间要求，较高的LOD，这意味着灵敏度较低，与溶液和微流控平台相比与ASSURED标准相关的定性方面的评估较高，符合关于POCT平台的一般了解，并显著增加了纸基免疫诊断系统的商业化技术。
它与免疫诊断类似，表2中也总结并比较了分子诊断POCT的最新方法。表2中的大多数分子诊断显示出比免疫诊断更高的灵敏度，即更低的LOD值，这是由于分子诊断的扩增技术，包括RPA、LAMP和PCR。在分子诊断工作中，试管平台的性能在所需时间和LOD方面是最好的。对于快速，准确和高度敏感的POCT，其他平台还有很大的改进和发展空间，分子诊断中的传感技术具有快速和高灵敏度POCT的巨大潜力，因为基于核酸扩增过程具有出色的灵敏度，并且有可能通过提高扩增速度来减少所需的分析时间，在LOD，所需时间和ASSURED标准评估方面的表现与免疫诊断学不同（表1）。可以看出，每项工作都已经在有效放大的基础上达到了较高的灵敏度，并且迫切需要在每个平台的简单、便携、方便操作的开发上取得进一步的进展。作为一种值得关注的方法，大多数关于微流控平台的研究显示出快速的分析时间和高灵敏度，因此，行业内分子诊断技术的发展都集中在微流控平台上。与免疫诊断的情况相比，纸基组在ASSURED标准相关的定性方面的评估并不比其他平台好多少，因为整个分析过程没有集成到一个单一的纸基设备中。在表1和表2中总结了所需检测时限的值以及遵循ASSURED标准的一些因素的定性比较，不考虑技术细节的差异，如光学检测和电化学检测、传统的分析方法和新开发的便携式分析。便携式和高度一体化的设备系统在POCT中发挥着关键作用，这些也是POCT技术要接近理想阶段所面临的关键挑战。
表1. 最新的免疫POCT方法
表2. 最新的分子POCT方法
这其中一些研究进展已在诊断市场上商业化，表3列出了具有代表性的商业产品，根据公开信息评估其对临床样本的灵敏度和特异性。由于商业产品在认证阶段进行了严格的评估，其灵敏度和特异性水平远高于研究文献报道的水平。在表3中，灵敏度和特异性在90%以下为低，在91-97%之间为中，在97%以上为高。在成本效益方面，比较和评估了在美国市场的销售成本，分数越高，说明设备、试剂盒或不用设备的肉眼检测成本越低，分数越低，说明仪器、试剂盒价格越贵。根据重量和尺寸信息对便携性进行了评估，并根据冷冻要求的操作规程和存储条件对操作和存储的方便性进行了评估。每个商业产品在设备和组件中包含独特的技术。例如，Cepheid的GeneXpert包括一个一次性试剂盒和一个操作设备，一次性试剂盒包含用于样本处理和核酸提取、扩增和检测的几个部分。当插入拭子或洗涤样本时，一次性试剂盒中的组分开始起作用，插入样本后，PCR检测从样本处理到结果的整个过程都在设备中自动完成。Abbott Laboratories的BinaxNow，通过试纸条中的层析对含有病毒样本进行快速分析，低成本的一次性试剂盒包括拭子样本的前处理缓冲液和具有完全干燥试剂的试剂条，在其他一些产品中，检测结果会在测试条上显示为一条彩色线，可通过肉眼或智能手机进行分析。
在COVID-19大流行期间，还紧急开发了一些用于快速检测SARS-CoV-2的产品。与甲型/乙型流感试剂盒等之前开发的试剂盒不同，这些LFA试剂盒是基于现有的血清学抗体检测，这些技术也显示出可靠的灵敏度和特异性，但从感染到确认血液中的抗体需要很长时间（几乎5天以上），并且在早期诊断的应用方面仍有局限性，这是免疫诊断技术发展的障碍之一。分子诊断学和免疫诊断学产品的发展趋势存在明显差异，分子诊断的大多数产品是基于PCR和微流控平台，然而，免疫诊断中的大多数产品都是基于纸基LFA平台来快速分析和生成比色信号。一般来说，微流控PCR技术具有很高的灵敏度和特异性，但设备和试剂盒仍然昂贵，且难以移动和储存试剂。LFA试纸等商业化免疫诊断产品具有成本效益高、便携和方便使用的特点，但在高灵敏度和特异性检测方面存在局限性。表3中的特征比表1和表2中研究文章中的更清楚地显示了这些，这些结果清楚地显示了目前在针对呼吸道病毒靶标POCT进一步发展的趋势和仍然存在的挑战。
表3. 商业POCT产品
2. POCT技术的现状：呼吸道病毒POCT的最新方法分为基于试管、微流控和纸基平台的免疫诊断和分子诊断，根据表1、表2和其他参考文献，最新方法的LOD和检测时间见图5。在对流感病毒进行比较研究后，将免疫诊断学中的各种单位（如EID50，ng/μl，HAU等）大致转换为拷贝数。商业化产品也显示了对临床样本的灵敏度。如图5所示，通过灵敏度和检测时间清晰的区分了免疫诊断学和分子诊断学。为两组绘制切线，表明当前最先进技术的局限性。免疫诊断组表现出快速反应和高LOD，表明抗体检测的主要挑战是提高灵敏度。分子诊断组的LOD较低，表明其性能高度灵敏，但需要在开发简单快速平台的方面取得进展才能进一步发展。表3中为商业化技术，根据产品手册中的临床灵敏度（%）标记点的位置。拷贝数检测限的等效程度与灵敏度值相匹配，理想的POCT应具有高灵敏度和快速分析时间，并具有低成本、便携、易于操作和可大规模生产的平台。图5显示了两个主要POCT平台（免疫诊断和分子诊断）的现状和挑战。
图5. 目前用于检测呼吸道病毒的POCT技术
在免疫诊断中，纸基平台中的方法比微流控的方法更快、更灵敏，在当前的趋势下，纸基平台受到了广泛的关注和投资。与之对应的，商业化技术也增加了纸基平台的使用，纸基平台在免疫诊断中表现出巨大的性能和潜力，尤其是LFA试纸。在分子诊断中，微流控方法接近最先进的方法。纸基设备仍然需要整合整个过程，并且在快速和高灵敏的呼吸道病毒检测方面存在局限性。大多数纸基平台的研究仍然需要用于核酸提取和扩增过程的单独溶液室，这是分析时间较长的主要原因。尽管纸基平台在简单，快速和方便使用的POCT中具有巨大的应用潜力，但技术开发中的仍然存在许多挑战。分子诊断技术，不仅是PCR也有LAMP和RPA，由于每次检测的复杂过程需要比免疫检测更长的时间，因此，微流控的高度专业化制造和多种流体控制技术对于开发POCT的小型化平台具有优势。商业化技术主要利用微流控技术实现从核酸提取到高灵敏度扩增的复杂过程。
POCT成本低，可批量生产且便携，很难在简化和方便的操作中实现高灵敏度和快速分析时间。高灵敏度的技术，如核酸扩增、新型合成纳米颗粒、复杂制造的芯片和特定的光学读取器，在诊断阶段通常需要昂贵的试剂或依赖复杂的仪器。有两个产品比其他产品有更高的灵敏度和更快的反应，一种是使用SERS光学仪器的侧流免疫测定，另一种是来自Abbott的ID Now™，RPA试剂盒用于便携式设备上带有配制好试剂的溶液盒中，这两个产品仍然需要复杂的仪器或者在低成本检测和大规模生产方面受到限制。这些技术在开发用于检测呼吸道病毒的理想POCT平台方面取得了有意义的成就，即开即用的新方法仍然具有克服这些局限性的巨大潜力。为了克服当前的限制并在紧急条件下应用POCT，例如在COVID-19等大流行情况下，迫切需要POCT平台在快速操作、便携性、易于制造、存储和高灵敏度、大规模生产方面取得进展。根据目前的趋势，一些领域已经显示出明显的潜力。特别关注的研究领域包括（1）等温核酸扩增（2）纸基平台上的分子诊断以及（3）基于另一种先进技术的高灵敏度免疫检测。以LAMP和RPA为代表的等温核酸扩增技术，因其在恒温下快速、简单且不损失灵敏度，在开发便捷检测平台方面具有很强的优势。在分子诊断的最新方法中，许多使用等温扩增技术的POCT研究显示出高灵敏度和快速反应，具有便携性和易于操作的步骤。结合等温扩增技术的独特特性的各种比色检测方法，例如LAMP溶液的颜色信号变化取决于pH值，双链扩增产物、二价离子浓度以及CRISPR与RPA结合的侧流线信号，已经开发出来以增强检测系统的便携性。通过提高扩增速度和一体化操作过程，逐渐减少等温扩增所需的分析时间，因此，等温扩增技术是呼吸道病毒早期诊断、预防和监测的关键技术。
如前所述，纸基平台在低成本应用方面具有许多优势，并得到了高度评价，如表1、表2、表3所示。分子诊断中的纸基平台显示出比其他纸基诊断方法低得多的LOD值，因为它们具有极其敏感的核酸扩增过程。然而，大多数分子诊断研究仍然需要单独的溶液室进行包括核酸提取和扩增的过程。纸基平台将整个过程集成到单一纸基设备中仍然存在挑战，随着纸基平台一体化的改进，研究可以克服局限性并接近理想的POCT类型。免疫诊断特别是用于廉价快速检测的LFA试剂条被评估为过去几十年中最成功的POCT平台之一，LFA试剂条的应用性能一直存在灵敏度较低和定量分析困难的弱点，这些问题在最近的研究中得到了解决。
随着纳米技术的进步，继合成纳米颗粒的卓越性能后，新型纳米颗粒和抗体复合物的新应用也被报道，普遍应用的金纳米颗粒信号增强的研究也可能对POCT高度敏感有一定的潜力。另外，基于各种纸材料和纸芯片结构对流体流动进行更精确的控制可以在诊断阶段产生更高的灵敏度，最近，一些POCT研究显示出比ELISA更灵敏的结果，因为各种纸张材料和基于生物相容性的独特结构的适当组合可以显著提高快速免疫测定的灵敏度。
七、结论
过去几十年来，呼吸道病毒的传播经常影响全球社会，全球COVID-19大流行在公共卫生和全球经济方面造成了严重危机。正如在COVID-19中观察到的，呼吸道病毒的现场检测在预防和监测大流行性感染方面发挥着关键作用，可以根据准确的诊断结果为适当的区域和患者提供快速有效的医疗护理。即时检测（POCT）是在患者附近进行的医学诊断检测，它可以改变医疗服务的模式，并大大提高社会在大流行期间维持人们生活的能力。POCT在其他资源匮乏的环境中也很有价值，例如发展中国家、农村地区以及需要大量检测的情况，如在高风险患者群体中或在大流行期间进行连续监测。因此，POCT已逐渐发展成为一种简单、便携、低成本的医疗诊断平台。在这篇综述中，介绍和分析了最新近的呼吸道病毒POCT方法，为了确定最先进的技术和当前的趋势，对2018年后发表的研究进行了回顾，重点回顾了POCT研究的平台和传感原理，以确定技术发展的当前趋势和存在的挑战。在对病毒颗粒或特异性核酸检测进行了基础研究之后，将这些生物传感技术应用于现场POCT平台的研究已取得了很大的进展。本文介绍了关键技术（第2章）和平台应用实例（第3、4章），为了清楚地了解总体趋势，文中简单地将各种已发布的商品区分为微流控和纸基，微流控平台和基于纸诊断平台的POCT被开发用于简单、小型化和便携的系统，无需中心实验室仪器就可以进行医学检测。因此，在当前POCT技术的发展中，纸基平台的免疫诊断和微流控平台的分子诊断尤其受到关注。POCT市场上的商业化产品主要使用这些类型的检测平台。POCT技术的成功商业化需要考虑高度一体化、手持和便携式平台，检测结果的准确性和可靠性对于确保偏远或资源匮乏环境中的患者安全和健康至关重要，高收益的POCT技术可以增加检测的机会和大规模生产的能力。
本文排除了关于POCT系统完整性或便携性的讨论，但最终这些方面取得的有效进展将带给当前技术水平更大的进步。对于理想的呼吸道病毒POCT，需要在短时间内使用简便、便携的检测系统完成高灵敏度的检测，如WHO提出的ASSURED标准所描述的，在诊断市场成功应用还需要低成本、批量生产、简单制造和无需培训的容易操作。呼吸道病毒POCT研究正在朝着这一最终目标迈进，通过这些努力，先进的POCT可以成为医疗系统的核心技术，用于呼吸道病毒感染导致重复性危机的早期诊断、预防和监测。
本文编译自：《Analytica Chimica Acta》Volume 1264, 11 July 2023.
