自身抗体实验室检测规范化的相关问题
仲人前，研究员、博士生导师。原上海长征医院实验诊断科和全军免疫诊断研究所主任。主持各类国家和省部级科研基金20多项，发表SCI论文90多篇，出版专著12部，授权专利6项，获省部级科技成果奖7项。先后担任中国免疫学会临床免疫分会主任委员、上海市医学会检验分会主任委员、上海市免疫学会理事长、中华医学会检验分会副主任委员、中国抗癌协会肿瘤标志物分会副主任委员、全军检验学会副主任委员、中国医学装备协会检验医学分会副主任委员、中国研究型医院协会临床检验分会副主任委员、中国卫生产业企业管理协会医学检验产业分会副会长等。
一、自身抗体实验室检测的现状
自身抗体检测在临床上的应用日益广泛，开单科室从传统的风湿免疫科到肿瘤内科、血管外科等。检测方法也层出不穷，从定性、半定量到定量，从手工、半自动化到全自动化，不断改善。临床意义也更加多样，包括筛查、诊断、预后判断、疗效监测、复发判断等。但是，自身抗体的实验室检测仍存在许多挑战，例如，如何做好自身抗体实验室检测的质量控制、不同方法学之间的比较、如何进行有效的项目组合以及人员培训、临床沟通以及技术准入、如何做好自身抗体检测的规范化等等，本文将从这些角度进行概述。
二、自身抗体检测的规范化进展
中国免疫学会临床免疫分会在2020年发表《自身免疫病诊断中抗体检测方法的推荐意见》中涉及的自身抗体种类众多，涵盖7个领域共52种抗体，抗体按疾病分类逐一解读，方便读者查找。推荐意见根据评分量化，细化检测基质推荐，优化方法学推荐，进行不同等级的推荐。同时还更新了对自身抗体检测的最新认识，纳入新抗体，添加新的方法学（如化学发光法等）。
1. 风湿性疾病相关自身抗体：风湿性疾病相关抗体有ANA、抗dsDNA抗体、ANCA、APL、自身免疫性肝病相关自身抗体、胃肠道疾病相关自身抗体、肾脏疾病相关自身抗体、中枢神经系统疾病相关自身抗体、自身免疫性皮肤病相关自身抗体等。
（1）ANA：抗核抗体在临床上开展最多，间接免疫荧光法（IIFT）是ANA筛查的参考方法，是美国风湿病学会（ACR）、欧洲自身免疫标准化促进会（EASI）、中国免疫学会临床免疫分会等专业机构推荐的ANA筛查参考方法。IIFT筛查、LIA确认作为Ⅰ级证据，同时推荐ELISA法、CLIA法和LIA法检测，不同抗体有不同的检测方法的推荐，CLIA大部分作为Ⅱ级证据推荐。
ANA核型分类的更新每年一次，在2021年国际抗核抗体核型共识（ICAP）中把Topo I（AC-29）和胞浆散点型（AC-18）分别单独列为细胞核核型和细胞浆核型。美国55%的ANA筛查采用IFA，22%采用ELISA，12%使用微珠法，18%为其他方法，仅39%实验室在报告中注明方法。644家实验室中，80%使用Hep-2细胞基质，18%为Hep-2000（过表达Ro60的Hep-2细胞株），另有2%为其他。人工制备载片占67%，自动化制备占33%。人工判读占84%，自动拍照判读占16%。而中国有80%以上使用IIFT，其他方法则为ELISA法等。
ANA特异性自身抗体包括抗ENA抗体、抗组蛋白抗体、抗核小体抗体、抗着丝粒蛋白B抗体、肌炎相关自身抗体等。这些抗体可采用多种免疫学方法检测，不同的检测方法具有不同的临床应用优缺点。ELISA的优势在于高敏感性、可定量和易自动化，缺点是需对抗体逐项检查。LIA则操作简便、易自动化、检测成本较低、一次实验可同时检测多家，但是结果半定量，某些自身抗体的特异性偏低。CLIA具有高敏感性和特异性、可定量且自动化，但其检测成本高，需对抗体逐项检测。应综合考虑临床实际需求和实验室条件来选择检测方法。
（2）抗dsDNA抗体：抗dsDNA抗体是SLE分类标准条件之一，抗体滴度与病情活动程度、肾损害相关，应定期使用相同定量方法检测，以便监测疗效和评价预后。公认的最佳检测方法为IIFT和RIA法（Farr法），虽然Farr法敏感性和特异性均优于IIFT，但鉴于实验操作和硬件要求，目前越来越少被采用。故推荐以绿蝇短膜虫为基质的IIFT检测为首选方法，当然也可采用ELISA、CLIA等方法。
（3）ANCA：ANCA是诊断微小血管炎的重要指标。1999年ANCA检测方法国际共识建议采用IIFT，并使用ELISA确认靶抗原。2017年建议对GPA和MPA患者可采用高质量抗原特异性方法（包括第二、三代ELISA、CLIA等），直接检测针对靶抗原PR3和MPO的自身抗体。如果特异性检查结果为阴性，但临床仍高度怀疑GPA和MPA时，则可使用IIFT或另一种抗原特异性免疫方法做确认实验，或委托高水平实验室复检，并积极进行组织活检，加强随访。对炎症性疾病、自身免疫性肝病、药物诱导的自身免疫性疾病及感染性疾病患者，由于其ANCA靶抗原可能是PR3、MPO以外的抗原，故仍应采用IIFT，并使用ELISA加以靶抗原的确认。
（4）APL：抗磷脂抗体（APL）的检测对抗磷脂综合征非常重要。抗心磷脂抗体（aCL）和抗β2糖蛋白I抗体（aβ2GPI）是APS的分类标准指标。根据2023年ACR/EULAR最新分类标准，推荐采用标准化ELISA进行定量检测IgM和IgG二种亚型，检测样本应为血清。当检测结果均为阴性但仍怀疑为APS时，则可补测IgA亚型或其他磷脂抗体；当使用血浆样本时应注意抗凝剂对检测的干扰和稀释作用。
2. 自身免疫性肝病相关自身抗体：在自身免疫性肝病中抗体联合筛查有助于提高检出率、提升诊断效率。抗平滑肌抗体的高滴度阳性支持自身免疫性肝炎诊断，其主要靶抗原是微丝肌动蛋白（包括G肌动蛋白和F肌动蛋白）。对于抗F肌动蛋白抗体的检测，建议以猴肝、Hep-2细胞、VSM47细胞等为基质，而对抗非F肌动蛋白抗体，则以大鼠肾为基质。抗肝肾微粒体1（LKM1）抗体、抗肝细胞溶质抗原1（LC1）抗体的检出率较低；抗LC1抗体滴度与疾病活动性有关，且常与抗LKM1抗体同时检出；约10%的Ⅱ型AIH患者仅能检出抗LC1抗体。建议采用ELISA或以大鼠肾和大鼠肝为基质的IIFT检测抗LKM1抗体和抗LC1抗体。
3. 胃肠道疾病相关自身抗体：不同的自身免疫性胃肠道疾病如乳糜泻、炎症性肠病、自身免疫性胃炎等，有不同的相关自身抗体。乳糜泻（也称麸质敏感性肠病）的特异性自身抗体包括抗肌内膜抗体（EMA）与抗组织型谷氨酰胺转移酶（tTG）抗体。二者识别的主要靶抗原均为tTG，因检测基质和方法学不同而命名不同。同时检测抗tTG抗体和EMA抗体（包括IgA和IgG亚型）可兼顾诊断敏感性及特异性，确保正确率。候选的自身抗体还有抗脱酰胺醇溶蛋白肽（dAG）抗体，其靶抗原是tTG催化醇溶蛋白而产生的产物。建议使用以灵长动物肝（最佳基质）、食管和小肠为标准基质的IIFT检测EMA，ELISA检测抗tTG抗体、抗dAG抗体。
4. 肾脏疾病相关自身抗体：肾脏疾病主要相关自身抗体有两种：抗GBM抗体和抗PLA2R抗体。抗GBM抗体是肺肾出血综合征的标志物，由于Ⅳ型胶原中除了α3链非胶原域（α3NC1），还有α5NC1、α4NC1也参与致病过程，因而仅以α3NC1为靶抗原的ELISA（市场上多数试剂盒）检测，存在一定的假阴性结果（23%），建议联合使用ELISA和以灵长类肾、肺为基质的IIFT检测抗GBM抗体，从而兼顾检测敏感性和特异性。抗PLA2R抗体时原发性膜性肾病的标志性自身抗体，起初膜性肾病以病理诊断为主，但自2009年发现抗PLA2R后，在临床上得到了广泛的验证，如果病人的临床表现为三高一低的肾病综合征同时伴有抗PLA2R阳性，即不再需要活检即可作出诊断。该自身抗体可用于诊断膜性肾病，诊断敏感性约为75%；该抗体滴度可监测疾病活动度和治疗效果，可辅助临床制定合理的治疗方案；该抗体高滴度预示肾功能衰竭的风险。建议使用ELISA和以PLA2R转染细胞为基质的IIFT检测。
5. 中枢神经系统疾病相关自身抗体：自身免疫性脑炎的确诊需要在脑脊液和/或血液中检测到针对神经元表面抗原或胞内抗原的自身抗体。抗NMDAR抗体是自身免疫性脑炎最常见的特异性标志物，靶抗原是突触受体NMDAR NR1亚基的细胞外区域，参与信号转导和突触可塑性调节。对于大多数患者，抗NMDAR抗体的鞘内合成比较突出，单独检测血清抗体可能出现假阴性，需平行检测脑脊液。因NMDAR为细胞膜受体蛋白，抗体识别表位为构象表位，建议采用以转染细胞为标准基质参考啮齿类小脑基质荧光结果的IIFT检测。
抗GAD抗体见于僵人综合征和部分小脑共济失调患者。靶抗原GAD见于脑灰质、胰岛β细胞等。抗GAD抗体还是I型糖尿病的重要指标，但抗体滴度远远低于神经系统疾病。建议采用以灵长类小脑为基质的IIFT筛查，以ELISA或LIA确认靶抗原。
神经系统副肿瘤综合征和免疫检查点抑制剂相关自身免疫事件中的自身抗体主要针对神经元胞内抗原。采用至少两种非相关方法进行检测，脑脊液和血清同时检出高滴度相关抗体可作为确诊标志。建议采用灵长类小脑、小肠和胰腺为基质的IIFT筛查，使用LIA确认靶抗原。
6. 自身免疫性皮肤病相关自身抗体：自身免疫性皮肤病相关自身抗体主要包括表皮内自身免疫性大疱性皮肤病（天疱疮）和表皮下自身免疫性大疱性皮肤病（类天疱疮）。建议使用灵长类食管、舌、盐裂皮肤为基质的IIFT初筛，使用ELISA进行靶抗原确认和抗体水平监测。例如《大疱性类天疱疮诊断和治疗的专家建议》中对于表皮下自身免疫性大疱性皮肤病的确诊依据是典型临床表现+组织病理+直接的间接免疫荧光及特异性的自身抗体（BP180/BP230）阳性。
三、自身抗体检测实验室自动化建设
自身抗体检测的实验室自动化建设越来越受到关注。如欧蒙的间接免疫荧光法独具特色，通过全自动免疫荧光核型及滴度判读系统可自动操作和读片。免疫印迹自动化检测平台从经典的手工操作逐渐到新一代全自动的印迹检测系统。以吖啶酯为标记物的化学发光法则在发光强度强和发光效率高基础上，便于获得更好的重复性、一致性和标准化，实现自身抗体单项定量检测、任意组合检测及急诊优先检测，既满足临床预期用途，又符合DRG等相关政策。
