D-二聚体实验室检测与临床应用中值得注意的相关问题

袁莉，西安交通大学第一附属医院检验科，副主任检验技师，发表论文7篇，SCI收录2篇。参与国家级和省级医工交叉课题2项。专业研究方向：出血性和血栓性疾病的实验室检测和监测工作。

人体在各种病理和生理状态下，激活凝血系统导致凝血酶生成，凝血酶作用于底物纤维蛋白原并对其进行水解，释放纤维蛋白肽A（FPA）和纤维蛋白肽B（FPB），生成纤维蛋白单体和多聚体，形成不稳定的血凝块，容易被高速血流冲散，起不到止血的作用，只有在活化FXIII的作用下，纤维蛋白单体和多聚体进一步形成交联的纤维蛋白（Fb），达到止血作用或病理性的血栓，凝血系统的激活同时导致Fb生成，而Fb的生成又可激活纤溶系统，引起纤溶酶的生成，纤溶酶水解纤维蛋白原、纤维蛋白单体、纤维蛋白多聚体以及交联Fb，生成分子量大小不一的混合物，即纤维蛋白降解产物（FDPs），其中D-二聚体（D-Dimer）是交联Fb特异的降解产物，D-Dimer也是分子量大小不一的混合物。通过D-二聚体的形成可以看出D-二聚体有以下病理生理的一些特点；（1）D-二聚体的形成是纤维蛋白形成和降解的过程；（2）D-二聚体水平的升高提示体内凝血系统激活同时伴有纤溶系统的活化；（3）D-二聚体是交联纤维蛋白的特异降解产物；（4）健康人外周血中仅微量存在，在血栓开始形成2h后即可检测到D-二聚体水平升高，其在体内的半衰期约7-8h。

一、D-二聚体实验室检测相关问题

1. D-二聚体的检测方法：现在实验室使用的各大品牌，不管是欧美还是日本的都是基于乳胶免疫比浊法，也称微粒凝集定量检测。

2. D-二聚体的参考区间：多数研究统计表明，正常人群D-二聚体数据呈偏态分布，通常采用百分位数法，由于增高为异常，因此采用90%或95%的上侧界值。配套检测系统通常给出参考区间，但是由于地域、人群等差异，可能导致不适用，因而实验室应该进行20份健康人群的验证工作，验证不通过再进行第二次的验证，如果连续两次验证不通过，这时要制定当地的实验室参考区间，至少检测120份健康人群，以计算参考区间（18-60岁人群），≥60岁老年人群中需要进行年龄调整，“年龄×10”对其进行调整，妊娠期参考区间也不适用，可参考相应文献，做简单的验证工作，验证通过可以直接使用，如果有条件、精力也可以做自己实验室参考区间。

3. D-二聚体的cut-off值：D-二聚体的cut-off值主要用于VTE低危人群排除的临界值，不同试剂（抗体）和不同方法学，实验室应建立自己的cut-off值，使用ROC曲线建立cut-off值实际操作和流程复杂，有些实验室可能通过大量工作建立了自己的cut-off值，对于VTE排除诊断的cut-off值完全可以在报告单上进行明确的标注，比如在参考区间的下面写0.8或1.2，给临床一个提示。需要注意在老年人群中需要进行年龄调整，“年龄×10”对其cut-off值进行调整，对于妊娠过程和肿瘤患者，由于前者是一个生理性的高凝过程，后者是一个病理性的高凝状态，如果在这两类人群当中应用的时候，还需要更多数据的一个支持，某些试剂用于VTE排除诊断标准是0.5mg/L或500µg/L，数值应用了很多年，现在很多的临床医生、实验室检验人员可能大家印象中也停留在0.5或500数值上，很多并没有做自己的cut-off值，还有某些参考系统使用0-0.5或者0-500参考区间，跟VTE排除诊断的0.5或500刚好是一样的数值，因此可能很多临床老师、检验人员觉得高于0.5或500认为是一个高凝状态或者有血栓风险，其实是把参考区间和cut-off值的两个概念混淆了，cut-off值是用于对某疾病诊断的临界值，参考区间用正常健康人群来做的，是区分健康人群和非健康人群的目的，不同的检测系统对同一种疾病的cut-off值是不一样的，即使同一疾病使用的不同检测系统、不同检测试剂，做出来的cut-off值理论上也不一样。

4. DDU和FEU单位：DDU是D-二聚体单位，FEU是纤维蛋白原等量单位，是将D-二聚体的量用降解前的纤维蛋白原的量来表达，据NCCL调查显示，使用FEU占55.3%，DDU占44.7%，美国CAP调查结果，FEU占59.1%，DDU占40.9%，DDU和FEU大约是二倍的关系存在，但实际应用中大多数情况下结果不可转换，会导致一些矛盾或者误诊，不建议不同量纲/单位进行换算。

5. D-二聚体的标准化和可比性：D-二聚体的标准化和可比性上的难点主要有以下几点：（1）D-二聚体检测试剂使用的单克隆抗体不同（D-二聚体本身并非结构单一的物质，而是含有该结构的大小不同的片段的混合物,分子量差异也很大）、乳胶颗粒大小、结合能力差异、方法学差异；（2）使用单位不一致，DDU和FEU；（3）报告方式不一：µg/ml，ng/ml，mg/L；（4）参考区间的地域、人种等差异；（5）试剂使用单抗不同，其定标品亦不同。综上，目前D-二聚体无法标准化，结果也无可比性。

如果某些实验室确实使用了不同检测系统、不同检测试剂或者区分了门诊病人、住院病人或A病区和B病区，甚至A院区和B院区，那么是否真的不可比么？我们实验室也是两个检测系统，曾经做了一个简单的实验性的系统A、B的比对，发现结果趋势基本上一致，不建议直接进行数值比较，多数情况下可以用阴性、阳性的符合率，甚至可以通过升高程度进行一致性的判断，如果病人从门诊到住院或者从A院去到B院，完全可以通过这样一个形式进行判断和动态监测的比较。

6. D-二聚体检测性能验证的一般要求：检测系统临床使用之前，应进行性能验证和校准，包括精密度、线性和正确度。D-二聚体针对VTE阴性排除价值非常敏感，因此性能验证非常重要的一条就是在对VTE排除诊断时临界值（cut-off值）水平的室内指控CV≤7.5%，D-二聚体检测试剂灵敏度高但线性范围窄，有优势也有缺点，因为D-二聚体试剂目前主要针对 VTE的排除诊断，造成厂商不断的进行高灵敏、低线性的研制。对于校准，目前没有校准品和参考方法，因此一定要使用厂商提供的定标品进行定期定标。

7. 有了D-二聚体是否无需FDP：D-二聚体检测试剂灵敏度高但线性范围窄，容易导致抗原过量，造成假阴性的结果，同时D-二聚体检测使用免疫比浊法检测受到的干扰因素多，可导致DD的假阳性，相反，FDP检测灵敏度低，线性范围宽，相对不易出现假阴性结果，受干扰也相对较小，基于临床的一些应用，某些特殊疾病使用的特殊药物如突聋的降纤药、心梗的溶栓药物等产生的降解片段不在某些试剂包被的抗体覆盖范围内，造成假阴性表现，基于以上原因，建议D-二聚体、FDP同时开展，这样能够避免实验室、临床应用当中出现的一些问题。

8. D-二聚体和FDP假阳性的发现和处理：基于我们实验室使用的检测系统、检测试剂，对一些经验和处理路径的分享，以供各位同道参考。

（1）DD＞FDP（DD和FDP均为阴性时）且FDP低于最小检测限：如下图报告，D-二聚体0.25，FDP 0.16，我们刚才不断强调D-二聚体检测灵敏度非常高，而FDP检测灵敏度比较低、线性范围比较宽，FDP 0.16很有可能在检测灵敏度范围以下，这时结果就非常不可靠，是阴性值，但由于OD值在异常低值部分变化非常大，会造成干扰，在低值部分两个都是阴性的结果的意义并不是很大，怎么避免这种情况？像FDP检测的灵敏度低，可以让工程师在检测系统中进行一个设置，OD值低于多少直接报检测下限就可以，比如我们使用FDP的检测下限2.5，设置OD值＜2.5，低于2.5的结果都报＜2.5，低于检测下限的数字没有意义。我们实验室曾经使用的两个检测系统，D-二聚体和FDP的最低检测限差别很大，所以要关注D-二聚体的低值，同时进行D-二聚体和FDP的检测可能会发现D-二聚体一些假阴性和假阳性的结果。

（2）DD＜FDP（DD和FDP有比例关系存在），分析前影响（凝块）：DD和FDP有比例关系存在，长期做凝血的老师心里都有一个大致的默认比例关系，比例关系不存在，尤其是异常的时候，比如DD异常高值可能稀释倍数不够，需要增加稀释倍数，即使比例关系存在，也有可能是分析前影响，最常见的是血凝块的存在。如下报告，APTT缩短，FIB降低，D-二聚体和FDP升高，这时要查看一下样本，有的APTT接近正常参考下限，FIB正常，可能FIB的基线值比较高，尽管已经发生凝块，启动了纤溶，FIB降解没有到达2以下的水平，所以同时也要看一下前回值的基线值。

（3）DD＞FDP（DD+，FDP-），DD假阳性可能性大：以下5个样本是我们工作中发现的D-二聚体和FDP的倒置情况，病例一和病例二，D-二聚体分别达到21和17.3，但是FDP都是在下限＜2.5，通过不同倍比稀释，发现没有一定规律，存在忽高忽低的情况。高度怀疑是两种检测系统问题，D-二聚体是一个假阳性，因此把5个样本分别用另外1台检测系统或者是不同的检测试剂进行了检测，发现D-二聚体降到了正常的参考区间范围内，通过小样本的观察发现D-D异常升高，而FDP正常，通过稀释不能解决问题的时候，可以采用更换检测系统（试剂）的办法来消除干扰。

为什么不能通过稀释解决问题？有以下几个方面原因：a）方法学，D-二聚体和FDP都采用免疫比浊法，即抗原抗体反应来检测，因此可能受到非特异性干扰，如类风湿因子、嗜异性抗体等；b）抗原抗体反应需要一个适当的比例关系，抗原过量或不足均可影响两者结合的差异；c）干扰物质是未知的，其含量也是未知的，因此在稀释时得到忽高忽低的检测结果；d）不同D-二聚体试剂使用的单抗不同，对干扰物质的反应也不同，因此，对于可疑假阳性结果建议更换不同品牌试剂重新检测。

（4）FDP＞DD（DD-，FDP++），FDP假阳性可能性大：如有一病例，三岁女孩动脉导管未闭术前常规凝血检查，凝血六项中只有 FDP异常升高，这时参考D-D假阳性的处理办法，更换检测系统重新检测，D-D和FDP阴性。导致FDP假阳性的原因与D-二聚体有许多相似的地方：在免疫测定中，影响检测结果的干扰因素较多，这些干扰物是一些与被检物质化学结构不同但活性相似的物质如异嗜性抗体，人抗动物抗体，自身抗体、类风湿因子和其他蛋白等，其中，异嗜性抗体是影响免疫检测最重要的因素之一，它通过非特异性结合，桥连捕获抗体、标记抗体或标记抗原从而干扰测定，使结果与临床不符可造成误诊。

（5）FDP＞DD（DD-，FDP++），FDP假阴or假阳性：以下收集的数据主要来自儿科急淋患者，我们检测系统A，FDP增高，检测系统B，FDP正常，D-二聚体阴性或者轻度增高的状态，通过了解，急淋患者的一线治疗药物是培门冬酶，培门冬酶治疗急淋患者会对患者的凝血和纤溶指标有哪些影响？通过参考文献进行一个解释，文献做了一系列降解产物的凝血和纤溶指标的统计，最终结果表明培门冬酶可以导致患者的纤溶亢进，增加t-PA，PAI-1、FDP和PAP水平，再看急淋患者使用培门多酶治疗，检测系统A可能更能表现药物对患者凝血功能的影响。

（6）突发性耳聋患者DD和FDP：要了解到底哪种检测系统或者哪种检测试剂更能反映真实情况，先了解一下突聋的病理机制，目前临床上普遍认为血栓形成、血管栓塞等引起的微循环障碍在突发性耳聋的发病中起着重要作用，也了解到巴曲酶作为突聋常规的一个药物，可以选择性作用于血浆纤维蛋白原的丝氨酸蛋白酶单成分制剂，对纤维蛋白原具有特异选择性，能够降解纤维蛋白原，但是它不能够活化凝血因子XIII，只有降纤的作用，引起纤维蛋白原降低、FDP升高，D-二聚体可能正常或者是轻度增高的结果。

二、D-二聚体和FDP的临床应用

D-二聚体和FDP的临床应用主要应用领域在DIC的实验室诊断、低危人群VTE的排除诊断和D-二聚体在抗凝、溶栓治疗中的应用。

1. DIC的实验室诊断：在《弥散性血管内凝血诊断中国专家共识（2017年版）》中明确指出DIC的诊断实验室检查，包括两部分（1）反应凝血因子消耗的指标，PT/APTT/FIB/PLT，（2）反应纤溶系统激活的指标，DD/FDP/3P，此外未来有望成为新的分子标志物有TAT等。再次强调不管DIC还是其他疾病的诊断和治疗，实验室指标一定要结合患者的基础疾病和临床表现来进行综合评估，任何单一的实验室指标对DIC的诊断都是十分有限，不能凭借一两个指标就对患者进行诊断或者治疗上的指导。中国弥散性血管内凝血诊断积分系统（CDSS）中也提到D-二聚体在实验室诊断中的作用、ISTH国际血栓与止血学会以及日本的两个学会DIC诊断指南中体现了D-二聚体或FDP的应用。DIC有不同分型，如纤溶平衡型、纤溶抑制型和纤溶亢进型的DIC，可以根据D-二聚体的增高程度进行 DIC的划分。如，ICU常见的脓毒血症DIC患者中常见的是纤溶抑制型，D-二聚体可能是轻度增高的患者，但确实处于高凝状态，如果检测TAT是非常高的值，相反纤溶指标，如PIC比较低，完全不成比例，这时纤溶被抑制，所以D-二聚体、FDP是正常甚至只有轻度增高的状态。

2. VTE（DVT+PE）的排除诊断：深静脉血栓（DVT）易并发肺栓塞（PE）合称为静脉血栓栓塞（VTE），很多指南和文献已经报道了D-二聚体排除DVT的准确性，对于低危人群可以达到98%-100%，强调一下D-二聚体主要用于中低危险度VTE的排除诊断指标，在中高危险度并不适用了，比如肿瘤患者、感染创伤患者，需要进行VTE的排除诊断或者诊断，直接超声或者造影进行诊断。

3. D-二聚体在抗凝、溶栓治疗中的应用：《深静脉血栓形成的诊断和治疗指南（第三版）》中对于溶栓治疗的监测指标，第三点提到了D-二聚体能够非常灵敏地反映溶栓治疗是否有效，如果D-二聚体值由治疗中的高点降低并逐渐趋于正常或维持较低水平而不再升高，提示溶栓药物不再对残存血栓起效，此时可考虑停用溶栓药物，避免因延长的无效治疗而增加出血的风险。现在很多临床医生对服用华法林患者的监测中把PT-INR和D-二聚体作为一个组合项进行监测，即使患者可能INR处于适宜的界值，但D-二聚体可能会在较高水平或者升高的趋势，这时可能需要加大抗凝剂量，患者有再栓的风险。对于VTE、DVT、PE患者当中，指南当中推荐了利伐沙班、达比加群等新型口服抗凝药物治疗，这些药物在很多患者中并没有常规监测，20%-50%患者及时进行了常规的抗凝治疗仍然有可能发展为血栓后综合征（PTS），可能是抗凝不足、抗凝不达标导致的。

三、D-二聚体的应用需要注意的问题

D-二聚体在应用的时候一定要注意连续、动态、多指标联合监测，要看趋势变化，只有这样才能达到个体化、精准化的治疗监测目的。我们医院临床医生就非常注重联合监测，如门诊的流产、多发性流产、习惯性流产或不孕不育的门诊，医生会把D-二聚体和TAT进行组合。还有在三甲医院中有很多的重症患者，重症凝血紊乱时，凝血四项、D-二聚体、FDP，还有血栓PAP、PIC等项目联合应用于凝血紊乱的诊断和治疗。包括ECMO抗凝的指导治疗都可以用凝血六项，包括D-二聚体，甚至AT-Ⅲ、抗因子Xa进行一个联合的检测，事实也表明联合多指标动态连续的监测，看趋势变化，对患者个体化、精准化的治疗监测有重要意义。