IFCC心脏生物标志物临床应用委员会对高敏心肌肌钙蛋白检测第99百分位值参考上限的建议
【摘要】国际临床化学和检验医学联合会（IFCC）心脏生物标志物临床应用委员会为心脏标志物在临床实验室和实践中的统一解读和应用提供了循证教育文件，该委员会的目标是提高对心脏生物标志物某些关键分析和临床方面的理解，以及这些标志物在临床应用中如何相互作用。高敏心肌肌钙蛋白（hs-cTn）检测是有急性心肌缺血症状和/或体征患者临床评估的基石。心肌梗死（MI）通用定义为提示急性心肌缺血的患者至少有1个cTn浓度高于hs-cTn检测的性别特异性第99百分位值参考上限（99th URL），并要求cTn浓度的动态模式满足MI的诊断标准。本文概述了应如何建立hs-cTn的99th URL，包括预筛选和参考队列中所需人数的建议、如何进行统计分析、最佳的分析前和分析方案以及可能影响准确确定99th URL的分析/生物干扰，还为其他的问题提供了指导和解决方案。
【关键词】高敏心肌肌钙蛋白；第99百分位；胸痛；心肌梗死；心肌损伤；参考区间
心肌梗死通用定义（UDMI）指出，心肌肌钙蛋白（cTn）检测在定义心肌梗死（MI）中至关重要。推荐使用高敏cTn（hs-cTn）检测，在急诊科（ED），hs-cTn检测除了可以识别高心肌梗死（MI）概率的患者之外，还可以早期、快速地排除大量MI患者。即使在没有MI的情况下，hs-cTn检测也可对那些短期和长期存在主要心血管不良事件（MACE）和死亡率风险的患者进行分类。20多年来，UDMI和检验医学界一直认可99th URL作为推荐的hs-cTn阈值。临床诊断标准包括hs-cTn浓度升高和/或下降，并且至少有一个值高于性别特异性99th URL，所有这些都与急性缺血的临床结果结合使用。第99百分位数来自健康队列的cTn测定值，取决于参与者选择、统计学分析以及分析和生物学变异。这些指标在不同研究之间没有标准化,因此，对于相同的hs-cTn检测，建议采用不同的第99百分位数，这可能导致急性MI的诊断不一致。许多中心甚至不使用99th URL，进一步加剧这个问题。对于个别患者来说，因为根据当地医院实施的URL，患者可能会得到不同的诊断。从流行病学的角度这也具有挑战性，同一地区的医院之间难以进行比较，并且可能掩盖治疗、随访和生存方面的差异。为了提高MI诊断的一致性，应在相似的民族/种族人群中应用用于推导99th URL的通用方案。其中一个可行的选择是使用大型高质量研究，得出适用于不同人口地区的99th URL，然后应在制造商的说明书中记录和传达这些信息，再由相关地区的实验室使用。本文概述了99th URL应该如何推导，以及可能对制造商、临床实验室和统一MI诊断研究的有用建议。这与之前的建议相比，包括了一些变化、修改和解释，旨在提高未来99th URL检测的稳健性，包括以下方面：（1）记录纳入前的筛选程序并确保参考队列中的所有受试者都是健康的；（2）男性和女性受试者数量的增加，以提高计算第99百分位性别特异性95%CI的准确性；（3）根据临床评估或异常值统计分析，调查非预期hs-cTn浓度的标本中的生物干扰；（4）分析前因素的标准化和分析干扰的消除；（5）在确定hs-cTn第99百分位时，使用多个批号的试剂和校准品，以减少批号转换的影响。
一、心肌肌钙蛋白第99百分位值参考上限在心肌梗死通用定义中的应用
临床实验室参考区间是医学界和患者用来解释实验室检测结果并区分正常或异常健康状况的基本工具。异常可能意味着疾病，但也可能是无意的发现，没有任何临床意义，因为根据定义，一定比例的健康个体将在URL外进行检测，具体取决于用于区分这两种情况的百分比。hs-cTn检测与许多其他实验室检测的不同之处在于，检测特定性的第99百分位数而不是第97百分位数充当URL，用作任何病因的心肌损伤的诊断临界值（cut-off），并在适当的临床环境中支持急性心肌梗死的诊断。
1. 建议一：高敏心肌肌钙蛋白浓度高于性别特异性99th URL应作为心肌损伤和心肌梗死的诊断阈值，符合心肌梗死通用定义。
心肌梗死第四版通用定义将cTn浓度高于检测的性别特异性第99百分位数定义为“心肌损伤”（图1）。急性心肌损伤需要至少一种cTn浓度高于第99百分位数并伴有动态变化。急性心肌损伤可以是缺血性或非缺血性的，并且由于多种病理甚至生理原因而发生。根据临床，心电图或影像学检查结果和记录，当急性心肌损伤和心肌缺血同时存在时，诊断为急性心肌梗死（AMI）。根据病理生理学特点，MI可分为几种类型，1型心肌梗死是由于斑块破裂伴冠状动脉粥样硬化血栓形成，而2型心肌梗死是在氧供需失衡、在没有急性斑块破裂的情况下发生。后者可能是由多种病因引起的（如，冠状动脉痉挛、栓塞或动脉夹层、持续性缓慢或快速性心律失常、严重贫血、低血压、呼吸衰竭）。非缺血性原因引起的急性心肌损伤可能由非冠心病（如心力衰竭、心肌炎、Takotsubo综合征、心脏手术或挫伤）或全身性原因（如脓毒症、重症疾病、慢性肾脏病、中毒、卒中、肺栓塞，甚至高强度体育锻炼）引起。在急性心肌损伤期间，hs-cTn浓度迅速增加，因此，对于到急诊科就诊的有提示非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）症状的患者，使用低基线和1h或2h的delta值进行心肌损伤低风险的早期排除和预测（图1）。欧洲心脏病学会推荐0/1h和0/2h算法，还包括基于单个高阈值（高于第99百分位）或在1h连续采样中观察到的delta值辅助MI高风险患者“规则”的标准。值得注意的是，这些规则标准并没有取代使用99th URL作为诊断心肌损伤和心肌梗死的标准cut-off。相反，0/1h和0/2h算法中指定的标准可以用作快速识别MI高危人群的替代指标，但其阳性预测值普遍＜80%，在NSTEMI低危人群中，其阳性预测值可能显著降低。因此，MI的诊断仍应根据UDMI中规定的标准进行确认。慢性心肌损伤的特征是非急性变化的hs-cTn系列浓度升高（UDMI建议的≤±20%的变异），通常是由结构性心脏病（高血压或左心室功能障碍等）、心脏长期暴露于多种代谢性危险因素或包括药物在内的毒性物质引起。hs-cTn的慢性升高通常意味着长期预后不良，包括心血管疾病和死亡率的风险增加。大型观察性研究表明，即使低于第99百分位数的hs-cTn浓度也与长期预后相关，并且似乎与测定的检测限存在连续关系（所有正常值到99th URL）。因此，对于到急诊科就诊但就诊期间从未显示hs-cTn＞99th URL的患者（见图1）以及为了进行风险评估而进行hs-cTn的患者，即使hs-cTn浓度介于检测限和99th URL之间，也与风险增加相关。大多数分析物参考区间是使用来自假定健康队列结果的第95百分位数中心分布统计得出。尽管一些人提出使用hs-cTn检测将第97.5百分位数作为心肌梗死的适当诊断cut-off，但第99百分位数仍然是诊断心肌损伤和心肌梗死的参考标准，使用第97.5百分位数会导致健康个体的错误分类率显着升高，自2000年以来已被纳入UDMI，IFCC和AACC指南，目前，检验医学、心脏病学和急诊医学指南继续支持使用第99百分位数。
图1. 不同的hs-cTn cut-off诊断MI（性别特异性99th URL）、早期排除、观察或提示ED中MI的规则和用于患者的风险评估
选择合适的参考队列推导第99百分位数：目前，全球有2种hs-cTnT检测方法和多种hs-cTnI检测方法上市，根据用于cTn仪器平台，所有检测都具有不同的性能特征，并且每种检测都使用不同的捕获和检测抗体，因此，检测方法没有标准化，必须为每个单独的检测和平台确定99th URL。
2. 建议二：hs-cTn的99th URL应来自健康个体的参考队列，年龄在18岁至80岁之间的大约50%的男性和50%的女性，并且应纳入所有相关的民族/种族群体。
参考队列应排除可能影响心脏的合并症或慢性病患者和住院患者。应通过问卷或临床访视（询问参与者的合并症、慢性疾病和用药情况）对参考人群的健康状况进行初步筛查。纳入前的筛查标准还应包括替代性生物标志物检测，以排除未诊断的亚临床疾病，主要是糖尿病、肾功能障碍或心肌功能障碍，建议采用标准化和保守的方法排除可能影响和增加hs-cTn的99th URL治疗或诊断疾病的患者（见表1）。
表1. 应从参考人群中排除的情况
在年龄和cTn浓度之间的关系很复杂，这一些研究提示年龄和cTn之间有直接关系，另一些研究提示，通过适当严格的患者选择，这一关系消失。例如，年龄已被证明是cTn浓度的重要预测因素，但如果通过超声心动图筛查来消除心脏病变，则这一影响将大大减小。理想情况下，所有年龄层在参考人群中的代表性都应该相同，但在合理的时间范围内招募一大批完全健康的60岁以上人群可能会产生问题，因此，不建议使用年龄分层的99th URL，仍然应该尝试合理的年龄分布，所有年龄层在参考队列中都有相当的代表性。据报道，种族之间hs-cTn浓度存在差异，因此，参考队列还应包括反映适用地理区域内区域种族组成的代表性分布。目前，美国可用的hs-cTn检测的某些99th URL与欧盟和/或全球使用的URL不同（取决于检测法），这可能部分反映了这些差异，但也可能表明纳入标准存在差异，因为一些制造商使用便利标本，而不是前瞻性严格筛选的队列。尚未确定是否应在世界其他地区（例如亚洲或非洲）实施特定于区域的hs-cTn的99th URL，但这需要进一步研究。心肌显像可进一步区分心肌健康和心肌病变，而显像标准已被证明可进一步降低第99百分位数估计值。使用影像学检查对参与者进行筛查会大幅增加成本，因此不需要作为参考队列常规预筛查的一部分。然而，使用影像学检查的数据可能是确定第99百分位数的更大数据集的一部分，在这种情况下，可以记录正常的心脏检查结果。
3. 建议三：应确定并报告特定性别的hs-cTn 99th URL，这与患有心血管疾病的男性相比，女性患者的健康和诊断差异很明显，预后更差，hs-cTn测定的性别差异也很明显，女性的第99百分位数较低。这被认为主要是由于心血管生理学的差异（女性的心脏质量相对于体重而言较小），以及男性亚临床冠状动脉疾病在较早年龄的发病率较高。由于hs-cTn检测法的分析灵敏度不同，第99百分位数的差异可能轻微或显著，而在健康队列中显示可测量浓度的检测法在检测女性和男性之间的差异方面似乎更敏感。至于其他分析物，如肌酐或肌酸激酶，如果确定性别特异性参考区间具有统计学意义，则临床实验室应报告。性别特异性的URL可以提高对疾病和可能的心血管风险的认识，尤其是在女性中，hs-cTnI的长期预后能力更高。
与第99百分位数相关的统计建议：用于异常值排除的统计技术和方法极大地影响了第99百分位数的计算，对生成的数据进行适当的统计处理与选择参考人群一样重要。
4. 建议四：应使用非参数方法或具有类似统计能力的方法确定99th URL，并且该队列应优选至少包括400名健康男性和400名健康女性，总共800名受试者，以得出具有足够统计能力的第99百分位，从而可以计算95%置信区间。
建议使用非参数统计方法（或Harrell-Davis方法），而不是稳健方法。稳健方法为了建立一个中心95%参考区间，而不是第99百分位数，因此当受试者数量为>120和生物标志物呈偏态分布时，该方法的准确性较低, 每个分区至少有300名受试者，在第99百分位产生足够的90%的统计不确定性(CIs), 我们正在修改建议，以允许使用95%CI来最大程度地减少异常值的影响，并提高队列之间的可重复性，从而将受试者的最小数量增加到400名男性和400名女性(最少800名受试者)。根据该方法，hs-cTn的99th URL对应的合适截止浓度由4个最高的观察值确定，如果n=400，则低、高95%CIs将分别由编号为391和400的人员确定，第99百分位数将与参考队列中编号为395和396的观察对象之间的浓度相似。对健康队列参与者进行严格的临床选择应将因未被识别的心脏疾病而出现异常值的风险降至最低，因此排除异常值应采取保守措施。Reed/Dixon标准可能是首选，因为它比Tukey方法排除的受试者更少。Bootstrapping方法可以用于计算CIs，因为这将增加估计极限的确定性。CIs不应在临床中报告，但应在临床研究试验和在同行评议期刊上的研究中披露。
5. 建议五：应对hs-cTn结果异常且缺乏有效临床解释的样本进行生物干扰调查。尽管将进行严格的临床筛查，但在推导hs-cTn测定的99th URL时，应考虑生物学干扰因素。与所有免疫测定一样，cTn测定可能偶尔受到结合cTn或测定成分的抗体影响，这些络合作用有时可导致cTn浓度稳定增加至URL的10倍，被称为“巨肌钙蛋白”，巨肌钙蛋白的存在可通过包括去除样本中的免疫球蛋白在内的合理、简单的方法确定，当表面健康的人显示出意外的高浓度时，应考虑巨肌钙蛋白的存在。也可能存在嗜异性抗体（可能干扰不同临床免疫测定的内源性抗体）的干扰，因此嗜异性抗体与cTn抗体发生交叉反应，导致假阳性或假阴性结果。在极少数情况下，循环抗cTn抗体也可导致假的低cTn浓度，但由于99th URL是使用最高cTn值确定的，因此担忧主要集中在巨肌钙蛋白上。我们认识到，在试验设计中尽量减少巨肌钙蛋白、嗜异性蛋白和/或自身抗体的干扰。如果偶然将具有巨肌钙蛋白，嗜异性或自身抗体抗体的健康受试者纳入参考人群，这可能会人为地将第99百分位转移到更高的hs-cTn浓度。因此，如果通过相关分析技术进行诊断，则应根据异常值检测或临床疑似排除这些人。
可能影响第99百分位的实验室变量：除了识别生物干扰之外，严格的分析前和分析标准对于准确计算99th URL也至关重要。
6. 建议六：应标准化和优化分析前方案和分析干扰，以准确确定99th URL。对有许多重要的分析前因素可能会影响hs-cTn结果的准确测定，包括体位、一天中不同时段、离心速度、分析前的储存时间、干扰物质和采集管。hs-cTnT呈昼夜变化，因此，标本采集的时间应该标准化。溶血可能导致假阴性（hs-cTnT）或假阳性（hs-cTnI，依赖于检测）结果，并且标本可能因黄疸或浊度/脂血（hs-cTnI）而受损。在确定第99百分位数时，应在所有标本中验证溶血、黄疸和脂血，并根据适用的干扰＞10%的检测特异性临界值排除。每天食用生物素的个体可能会因某些依赖于生物素/链霉亲和素结合特性的hs-cTn测定而产生假阴性结果，采集管中使用的不同添加剂（例如肝素或EDTA）也可能影响hs-cTn浓度，应评估样本类型，采集管和添加剂，如果存在显着差异，则应针对每种管/添加剂（如适用）得出不同的hs-cTn的99th URL。
7. 建议七：在确定99% URL时应考虑批次间的分析不确定性。研究报告了hs-cTn试剂和/或校准品的仪器批次间变异性，随着时间的推移，浓度变化±1-2ng/L，接近检测限的低浓度受影响最大。因此，如果使用相同的试剂和/或校准品批次测量参考人群的所有样本，定义为第99百分位数的hs-cTn浓度可能会根据特定批次的浓度值向上或向下偏离，临床实验室同时使用多个试剂或校准批的情况并不常见，因此，为了降低这一风险，参考人群的样本可以在不同的实验室或更长时间内进行分析。应在实验室内使用同一仪器的几个模块，以确保将试剂和校准品批次间的变异性以及实验室内和实验室间的差异和不确定性纳入数据集中，以提高统计计算的整体稳健性。这可以通过（1）进行多中心研究；（2）合并基于人群的队列研究中包括的健康个体的数据，或（3）使用跨多个实验室分析的生物库标本，包括使用不同试剂和校准品批次的站点/队列/实验室（见图2）。
图2. 使用不同试剂和校准品批次测定hs-cTn的99th URL
二、未来的需求
增加与hs-cTn检测的诊断和预后表现相关的临床知识可以改善患者分诊和临床护理策略。这对提高cTn检测的分析灵敏度和不精确性的未来发展可能会进一步改善ED患者的分类。人工智能系统和机器学习算法中改进的技术可能会整合有关年龄、性别、种族、合并症和hs-cTn的信息。电子病历中提供的结果，可以自动识别急性或慢性心肌损伤的存在或短期和长期主要不良心血管事件的风险评分，这最终可以在电子健康记录中临床报告，以改善预后和结果。基于可靠的hs-cTn数据测量的高质量研究是未来的关键。
三、结论
在UDMI以及整个常规临床和实验室实践中，hs-cTn 99th URL是一个关键阈值，为了提高急性心肌梗死诊断的一致性，应以标准化/统一的方式确定99th URL，包括严格的临床和分析性筛查程序，纳入的参与者数量足够，确认影响cTn检测的所有分析前、分析中和干扰因素以及适当的统计处理。
编译节选自：Clinical Chemistry，Volume 68, Issue 8, August 2022, Pages 1022-1030.
