miRNA检测在恶性肿瘤和传染病诊断中的临床价值与检测方法
MicroRNAs（miRNAs）是一类在转录后水平调控基因表达的非编码小分子RNA，它们的生物发生包括一系列复杂的连续过程，并调节参与所有细胞过程的许多基因的表达，其功能对于维持单细胞的内环境稳态是必不可少的，因此，miRNAs异常表达促进了许多疾病的发生和进展，尤其是恶性肿瘤和病毒感染。此外，miRNAs可能与特定疾病的某些状态相关，以对患者微创的方式获得并使用临床实验室中基本的分子方法进行分析，因此，它们有希望成为个性化医疗中非常有用的生物标志物和潜在工具，在这篇编译中主要节选了miRNAs在癌症和传染病中的意义以及目前可用的检测方法。
一、恶性肿瘤中的miRNA
miRNAs影响多种蛋白质的表达，包括抑癌基因和原癌基因的表达，从而使其成为原癌基因和抑癌基因。由于相同的miRNA在不同的组织中具有不同的靶点，因此其在不同类型的肿瘤中的功能也会不同，这取决于细胞内环境和其翻译被调节的蛋白质组，因此，同样的miRNA可以在不同的肿瘤中发挥抑癌基因和原癌基因的作用。即使在同一肿瘤中，相同的miRNA也可以参与具有反馈回路的调控循环，并可能影响抑癌基因和原癌基因。由于50%的miRNA基因位于与癌症相关的区域，发现它们的表达在肿瘤中失调。miRNA被发现是信号通路的成员，通常还涉及长链非编码RNA（lncRNAs）和环状RNA（cRNAs），miRNA作为原癌基因和抑癌基因，主要影响细胞的增殖和凋亡过程。miRNA可以影响癌症的所有过程：细胞周期、增殖控制机制、细胞迁移、转移和侵袭、自噬、细胞凋亡、衰老和分化，还影响对化疗药物的耐药性、代谢和免疫监视。miRNA调控的特异性变化可以在所有类型的肿瘤中发现，但检测那些可以用作诊断标志物的miRNA具有挑战性，因为它们具有细胞或肿瘤特异性。目前，除了检测一种特定的miRNA外，通常还发现一组失调的miRNA与某类肿瘤相关。
1. 白血病和淋巴瘤中的miRNA：第一个被发现直接参与肿瘤发展的miRNA是在白血病患者中检测到的，在造血细胞及其恶性肿瘤中，参与增殖和凋亡及其在B细胞分化信号通路中的作用可能最为人所了解。Calin发现慢性淋巴细胞白血病（CLL）中13q14的缺失与miRNA15a和miRNA16-1（miR15/16）的缺失同时发生，并且在近70%的CLL患者中发现这些miRNA要么缺失要么表观遗传下调，它们的缺失影响了抗凋亡蛋白BCL2和MCL1的表达，导致细胞存活和对化疗药物的耐药性，以及细胞周期蛋白D1的表达和细胞增殖。由于miR15/16的靶点也是p53，因此缺失导致了一种特定CLL亚型的发生，miR15/16基因簇下调也被发现与其他类型的白血病有关。其表达与造血疾病发展相关的另一个miRNA基因簇是miR17-miR92簇，含有由多顺反子转录物产生的6个miRNAs，在B细胞淋巴瘤，T细胞白血病和一些实体瘤中发现了它的扩增，其基因座受c-Myc调控，主要作用靶点为BIM、PTEN、p21、p57，其失调会降低细胞凋亡并提高增殖、细胞存活、对化疗耐药性和BCR信号传导。
进一步发现许多miRNAs参与B淋巴细胞和T淋巴细胞的正常发育和白血病发生，其中之一是miR34a，它作为肿瘤抑制因子，受p53调控，主要靶点是FOXP1、ZAP-70、凋亡相关基因（如BCL2）和调节细胞周期进程和增殖的基因（如BCL6、B-MYB、CDK6和AXL）。FOXP1在pro/pre-B细胞中受miR34a调控，而在成熟B细胞中受miR150调控，在pro-B细胞中miR150调节Myb，其缺失增加了涉及PIK3AP1和AKT2的BCR信号传导和存活途径，并影响端粒酶表达。通过靶向CXCR4，它调节单核细胞的动员和迁移，其表达在一种CLL亚型和不同类型的淋巴瘤中下调。miR155可以在B细胞发育的不同阶段同时作为原癌基因和抑癌基因，这是miRNA信号调节中存在的不同类型的负反馈回路的另一个例子，它受BCR激活调节，其下游靶点是参与免疫球蛋白体细胞超突变的转录因子Pu.1和AID，并调节Akt信号、增殖、运动和TGFβ通路的调节。miR181b除了靶向Bcl2、MCL1和TCL1外，还靶向AID和Akt激酶共激活因子，从而影响细胞凋亡、细胞存活和分化，这种miRNA在CLL中表达下调，其水平与同一患者的疾病进展相关。
2. 脑肿瘤中的miRNA：多个研究组分析了胶质母细胞瘤和其他脑肿瘤中的miRNA，检测出5-10个上调和下调的miRNA特征集，作为与患者生存相关的特异性标志。这些miRNA影响MAPK，PI3K/Akt，mTOR和Wnt信号通路，解除对细胞凋亡和增殖的控制，miRNA中，在这些肿瘤类型中分析最多的miRNA是miR7，它参与神经细胞分化并发挥肿瘤抑制作用，它主要影响Akt和MAP激酶通路中的靶点，其下调可促进增殖、存活并抑制凋亡。其他经常参与胶质母细胞瘤发生的miRNA包括miR21、miR221和miR181，miR21过表达可抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，其他提到的miRNA参与PI3K/Akt调节、Notch和p53信号传导以及DNA修复。
3. 肺癌中的miRNA：miR21、miR148和miR205是在肺癌中研究最多的miRNA，除了观察不同类型肺癌中差异表达的miRNAs，还在肺腺癌中鉴定出几组表达改变的miRNAs。发现肺癌细胞中的EGFR突变导致17种miRNA（包括miR17-92簇）表达的变化，这些miRNA影响癌细胞的增殖、存活、化疗抵抗和凋亡、迁移和干性。肿瘤中失调的miRNA的主要靶标是Ras和Myc通路，导致细胞增殖的PTEN和PI3K/Akt信号传导，p53通路以及其他影响化疗药物耐药性和细胞凋亡的通路，miRNA与HIF和TGFβ通路元件的相互作用影响细胞迁移，增殖和对化疗药物的抗性，肺部miRNA调控的其他过程是代谢和糖酵解，以及上皮-间质转化（EMT）。
4. 乳腺癌中的miRNA：在乳腺癌中检测到大量miRNA和失调miRNA的特征，其中研究最多的是miR125b、miR145、miR21、miR155和miR205。失调的miRNA主要靶标是参与MAP/AKT/STAT3信号通路的分子以及通过靶向VEGFA调节细胞增殖、上皮-间质转化、血管生成、细胞干性和化疗耐药性的分子。
5. 膀胱癌和肾癌中的miRNA：在膀胱癌中，失调的miRNA通常包括miR34a，miR21和miR222，并且几种miRNA与迁移和侵袭有关，其作用靶标是β连环蛋白、CDK2、E钙粘蛋白以及整合素α5，影响对化疗的耐药性。在肾癌组织中，失调的miRNA的主要靶标包括参与增殖的蛋白，例如Akt和Wnt信号传导、迁移、侵袭和EMT中的蛋白。
6. 结肠癌和肝细胞癌及胃癌中的miRNA：在结肠癌中，miR200c、miR145、miR181、miR101和miR21等失调的miRNA主要影响细胞的增殖和迁移、凋亡、Wnt/β-catenin和MAPK通路，在这个研究中，发现了一系列具有预后和诊断潜力的特异性miRNA。参与肝细胞癌信号通路的最重要的miRNA是调节PI3K/Akt通路，细胞增殖，凋亡，侵袭，EMT和葡萄糖代谢的miRNA，主要起肿瘤抑制剂的作用。在胃癌中，miRNA还通过靶向PTEN和EGFR以及MAPK通路以及参与染色质重塑的EZH2来调节细胞增殖和迁移。该疾病中的许多miRNA通过调节Bcl2或其家族的其他成员、血管生成和对化疗的抗性参与细胞凋亡的抵抗。在胰腺癌中，miRNA通过TGFβ信号传导、侵袭过程和细胞凋亡抑制来调节EMT。
7. 宫颈癌和睾丸肿瘤及前列腺癌中的miRNA：在宫颈癌中，miRNA促进肿瘤增殖、迁移、侵袭并影响细胞凋亡和化疗耐药，例如，miR21影响Akt/mTOR通路、增殖、生长和EMT；miR375靶向E-钙粘蛋白；miR138靶向EZH2，影响染色质重塑。据观察，病毒蛋白E6和E7会增加miR18a的表达，从而影响人乳头瘤病毒（HPV）相关宫颈癌中的Hippo信号传导。在前列腺癌中，miRNA影响增殖、细胞凋亡、迁移和侵袭，主要靶标是Akt和MAPK通路以及HIF和VEGF通路。在不同类型的睾丸生殖细胞肿瘤中，多种miRNA的表达存在差异，从畸胎瘤的低表达、精原细胞瘤的中表达到胚胎癌的高表达。主要失调的miRNA有，miR199-214通过表观遗传调节因子影响肿瘤代谢；miR371-373影响p53通路、细胞周期调控、Wnt/β-catenin信号传导和衰老；miR223通过FBXW7影响细胞凋亡和细胞生长。其他miRNA靶标包括细胞周期调节因子、参与细胞凋亡调节、DNA损伤敏感性、细胞分化和乳酸代谢的p53通路成员。
8. 皮肤肿瘤中的miRNA：对转移性黑色素瘤的分析显示，44个miRNA起肿瘤抑制作用，23个起原癌基因作用，其中一些miRNA控制MITF的表达，MITF是参与黑素细胞分化、增殖、存活、细胞运动和侵袭的转录因子。许多miRNA直接调控MITF，还有一些通过靶向调控MITF表达的信号通路来调控MITF，如Wnt和MAP信号通路。此外，一些miRNA调控细胞存活并参与染色质重塑。当高度增殖状态转变为以其迁移能力为特征的侵袭状态时，侵袭性黑色素瘤的发展与黑色素瘤表型转换有关，在这种状态下，MITF水平降低，表型变化与EMT相似，许多参与迁移的miRNA失调。MITF的高表达也与化疗耐药相关，近20种肿瘤抑制基因和原癌基因与这一过程相关，其中大多数靶向MAP激酶、PI3K以及EMT通路，黑色素瘤中的miRNA也调节免疫监视的逃逸。在皮肤鳞状细胞癌中，miRNA影响细胞的增殖、侵袭和迁移并通过靶向PTEN、MAP激酶成员和cMyc通路抑制细胞凋亡和分化。
9. 其他肿瘤中的miRNA：在罕见的甲状腺髓样癌中，检测到特定失调的miRNA。在骨肉瘤中大多数失调的miRNA与细胞增殖和迁移有关，靶向β-连环蛋白和MAP激酶通路。根据不同骨肉瘤的细胞内环境，有一些miRNA可以作为原癌基因和肿瘤抑制基因。
二、病毒性疾病中的miRNA
除了在细胞水平上调节许多生物功能（例如细胞增殖和分化）外，miRNAs还通过调节超过60%的人类基因的表达来调节宿主免疫和病毒感染。除了真核细胞miRNAs之外，病毒miRNAs（v-miRNAs）及其在免疫反应中的功能在过去十年中也得到了广泛研究，与细胞miRNA类似，v-miRNAs与靶mRNA的3'非翻译区相互作用，使得v-miRNAs能够充当宿主的基因调节剂和病毒基因调节剂，帮助病毒躲避宿主的免疫系统。
（一）DNA病毒
1. 疱疹病毒：2004年发现了第一个由DNA Epstein-Barr病毒（EBV）编码的v-miRNA，已知EBV编码40多种v-miRNA，此后已鉴定出250多种v-miRNA，其中大多数由所有三个疱疹病毒家族编码。有三种类型的α-疱疹病毒：单纯疱疹病毒1（HSV-1），单纯疱疹病毒2（HSV-2）和水痘带状疱疹病毒（VZV）。许多研究试图在VZV感染期间检测VZV v-miRNA以及细胞miRNA，但这些v-miRNA尚未被鉴定。HSV-1和HSV-2在口腔和生殖器粘膜上皮中引起增殖感染并在感觉神经元中导致潜伏感染，对这些病毒进行的研究主要集中在检测病毒感染潜伏期表达的miRNAs，发现在潜伏期不仅表达v-miRNAs，而且还表达特定的宿主细胞miRNAs。MiR101和miR138是两种主要的细胞miRNA，它们抑制感染的活跃期并促进HSV-1病毒潜伏期。为了保持潜伏，HSV-1必须避开宿主的免疫系统，为此，它利用细胞miRNA，如miR23，HSV-1感染单核细胞可上调miR132，对干扰素刺激基因的表达产生负向影响，转录共激活因子p300是miR132的作用靶点，对启动抗病毒免疫至关重要。最著名的β-疱疹病毒是巨细胞病毒（HCMV），帮助HCMV潜伏期感染的最重要的细胞miRNA是miR200家族，MiR200家族成员与ULI122mRNA的3’UTR结合并阻止其翻译，miR132是另一种重要的细胞miRNA，其过表达导致先天免疫逃逸，它在HCMV感染期间与HSV-1感染期间具有相同的作用。EBV和卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHVs）是β-疱疹病毒家族中研究最多的两种病毒。EBV感染会引起细胞miRNA的许多变化，例如miR17-92簇，对于被病毒感染的免疫细胞（B细胞，T细胞，NK细胞和巨噬细胞）的分化至关重要。KSHV又称人类疱疹病毒8型（human herpesvirus 8，HHV8），可编码病毒IL-6（viral IL-6，vIL-6），模拟人IL-6（human IL-6，hIL-6）的所有活性。通过其开放阅读框（ORF）中的结合位点参与调控vIL-6和hIL-6的细胞miRNA有miR608和miR1293，此外，miR31在KSHV感染的淋巴内皮细胞（LECs）中上调。
此外，自发现第一个v-miRNA以来，已有500多种v-miRNA可以作为宿主和病毒基因的基因调节因子，以调节潜伏期并帮助病毒逃避宿主的免疫应答。2006年，发现了第一个HSV v-miRNA，目前，有超过27种已知的v-miRNA由HSV-1和HSV-2编码。近年来的研究主要集中在检测与潜伏相关转录本（latent-associated transcript，LAT）相关的miRNA，LAT的表达对于维持HSV-1潜伏期很重要。感染细胞多肽4（ICP4）是病毒转录的调节因子，是HSV-1有效感染所必需的。ICP0是一种病毒即早蛋白，其表达决定裂解性病毒复制，该蛋白在hsv-1感染细胞中的表达受v-miRH2调控。2005年鉴定出第一个由HCMV编码的v-miRNA，到目前为止，已有26种已知的HCMV v-miRNAs，研究最多的HCMV v-miRNAs之一是miRUL112，可以靶向宿主和病毒转录本。主要组织相容性复合体I类相关链B（MICB）是一种由CD8+T淋巴细胞和NK细胞表达的NKG2D受体识别的配体，以v-miRUL112为靶点。toll样受体（Toll-like receptors，TLR）识别胞外病原体并将其呈递给免疫细胞，在固有免疫激活中发挥关键作用。V-miRUL112-3p靶向TLR2导致其沉默。TLR2的功能是与HCMV糖蛋白B和H结合，导致促炎细胞因子的产生。EBV基因组包含超过44种miRNAs的信息，这些miRNAs在免疫逃逸、抑制宿主适应性免疫或抑制宿主固有免疫中发挥关键作用，其中大部分转录自BamH I-A右转录本（BART）和BamH I-H右可读框1（BHRF1）区域。V-miRBART2-5p抑制宿主的固有免疫，KSHV编码的miRK12-7具有与EBV编码的miRBART2-5p相同的功能。KSHV感染的内皮细胞过表达v-miRK10a，其靶向TNF样弱凋亡诱导因子受体（TWEAKR），TWEAKR是促炎细胞因子TNF样弱凋亡诱导因子（TWEAK）的受体。KSHV表达一种对其病毒阶段至关重要的病毒蛋白RTA，称为裂解调控开关，RTA可以直接或间接监管。
2. 多瘤病毒：研究最多的多瘤病毒包括引起多瘤病毒相关性肾病和出血性膀胱炎的人多瘤病毒BK（BKV）、引起进行性多灶性白质脑病的人多瘤病毒JC（JCV）和猿猴病毒40（SV40）。在BKV感染过程中，研究最多的两个细胞miRNA是miR10和miR30，这两种miRNA的机制尚未完全发现。SV40感染的支气管上皮细胞过表达细胞miR27a。BKV的生命周期主要受两种BKV编码的miRNA，BKV-miRB1-5p和BKV-miRB1-3p的调节，这两种miRNA在BKV感染期间都过表达。在感染晚期过表达的JCV编码的miRNA是v-miRJ1-5p和v-miRJ1-3p,SV40编码的v-miRS1的功能尚未确定。许多研究表明其主要功能是抑制ING-4的表达，ING-4是一种肿瘤抑制因子，可调节p53、NF-κB和HIF-1α活性。
3. 乳头瘤病毒：人乳头瘤病毒（HPVs）根据其癌前病变及其恶性潜能分为两类：低风险（LR-HPVs）和高风险（HR-HPVs）。在HR-HPVs中，最重要的类型是HPV16和HPV18。HPV16/HPV18感染的细胞具有let-7 miRNA的低表达，另一种在HPV感染中起重要作用的细胞miRNA是miR125s，许多HPV编码的miRNA是HPV16编码的，它们的功能尚未得到充分研究和了解。到目前为止，已经描述的三种主要HPV miRNA有，v-miR1，v-miR2和v-miR3，它们调节参与细胞迁移和细胞粘附的基因的表达，例如GATA6，ZEB2，THBS1和STAT5B。
4. 腺病毒：病毒不仅主要引起急性呼吸道感染，还与胃肠炎，角结膜炎，心肌炎，脑膜脑炎，膀胱炎和肝炎有关。在腺病毒感染的前6小时内，受感染的细胞过度表达细胞miR22（一种细胞生长抑制剂）和一些肿瘤抑制miRNA，例如miR181-b、miR320或let-7，感染开始12小时后出现第二波细胞miRNA表达，主要由与免疫反应有关的miRNA组成，例如miR29。腺病毒本身编码两种miRNA：VA RNA1和VA RNA2。VA RNAI产生最常见的mivaRNAs，mivaRNAI-137和mivaRNAI-138，而VA RNAII产生单个mivaRNA和mivaRNAII-138。
5. 嗜肝DNA病毒科：乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒（分别为HBV和HCV）是研究最多的肝炎病毒，已知与肝脏感染有关。HBV通过与细胞miRNAs miR181和miR155相互作用调节宿主的免疫系统，为了复制和控制宿主基因的表达，HBV主要编码两种v-miRNA:v-miRNA-2和v-miRNA-3。
（二） RNA病毒
RNA病毒编码的miRNA称为rv-miRNA，这些rv-miRNA在病毒生命周期和宿主细胞中的功能作用仍不清楚。一些rv-miRNA的表达水平极低，使其检测方法具有挑战性。此外，大多数RNA病毒在细胞质中复制，因此它们的病毒miRNA不与核miRNA机制相互作用。
1. 黄病毒科：黄病毒科丙型肝炎病毒是一种RNA病毒，与乙型肝炎病毒一起是研究最多的肝炎病毒，研究最多的细胞miRNA是miR122和miR155，其表达在HCV感染期间失调，目前认为HCV不编码rv-miRNA。
2. 逆转录病毒：目前研究最多的逆转录病毒是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1），它感染T细胞，尤其是CD4+T细胞以及分化后期的单核细胞。Rv-miRN367是第一个被发现的HIV-1编码的miRNA，另一个重要的HIV-1编码的miRNA是rv-miRH1。
3. 流感病毒：甲型流感病毒（IAV）是该家族中最知名的病毒，与其他RNA病毒不同，IAV在宿主的细胞核内复制，并利用宿主的系统表达自己的rv-miRNA，H5N1是IAV的一个亚型，在感染细胞中引起不同miRNA的差异表达，H5N1病毒编码的第一个v-miRNA是miRHA-3p，它调控PCBP2基因的表达，该基因编码维甲酸诱导基因-1和线粒体抗病毒信号蛋白（RIG-1/MAVS）的调节因子。
4. 冠状病毒：冠状病毒是引起严重急性呼吸综合征的RNA病毒，病死率高。自2020年以来，由于COVID-19引起的大流行，细胞miRNA和v-miRNA之间的相互作用被细致地研究，迄今已发现40个SARS-Cov-2编码的miRNA，如miR618、miR6501-5p和miR144-3p。所有miRNA在COVID-19阳性患者中均上调，它们在感染过程中的免疫学意义尚不完全清楚，但一些研究表明，这些miRNA通过NFκB、JAK/STAT或TGFβ信号通路发挥作用。
三、miRNA的检测方法
正如癌症和病毒性疾病的例子所示，miRNA在疾病发展的细胞和生理方面都发挥着重要作用，因此是新兴的潜在生物标志物。由于分子短且相对不稳定，检测取决于组织样本的类型以及用于评估它们的方法的灵敏度和精密度。目前最常用的miRNA分析方法有微阵列、实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、原位杂交（ISH）、Northern blotting（NB）和二代测序（NGS）。虽然这些方法各有优缺点，但仍在不同的研究中应用，qRT-PCR和NGS是目前研究miRNA最常用的两种方法，在常规诊断应用中具有较高的潜力。
1. 微阵列：微阵列通常用于大量已知miRNA的平行分析，该方法是基于靶miRNA与其互补探针之间的杂交，miRNA芯片在寡核苷酸探针的设计、探针固定、样本标记和微阵列芯片信号检测方法等方面存在差异，由于miRNA在总分离RNA中的丰度较低，在检测表达量之前需要对样本进行miRNA的富集。有多种技术可用于标记靶miRNA，通常通过直接酶标记（如T4 RNA连接酶），但即使不直接标记也可以检测到靶miRNA。这种技术成本相对较低，可以在一次实验中处理大量的样本，可用于两组间miRNA含量的相对比较，其缺点是不能用于检测新的miRNA。
2. 实时定量聚合酶链式反应：qRT-PCR是特异性miRNA检测和特定miRNA绝对定量的常用方法，首先需要使用通用引物将miRNA逆转录（RT）成互补DNA（cDNA），通用引物需要miRNA含有poly A/poly U尾或特异性引物，例如茎环RT引物、线性RT引物、DNA钳形探针和双尾RT引物。与标准RT引物相比，由于miRNA的长度与标准RT引物的长度相同，且成熟的miRNA含有与其前体（pre-miRNA和pri-mRNA）序列相同，为了区分成熟的miRNA及其前体，与用于检测和定量miRNA的插入染料相比，水解探针更常用于qPCR，该方法的主要优点是高灵敏度和特异性，另一方面，只能检测到具有已知序列的miRNA，反应条件高度依赖于引物和探针的含量。
3.原位杂交（ISH）：这与微阵列类似，ISH也基于靶miRNAs与其互补探针之间的杂交，微阵列需要提取的miRNAs，但ISH用于直接检测目标细胞/组织中特定miRNAs的存在，从而能够定位细胞内的靶miRNAs，通过使用标记有不同荧光分子的特定探针，可以在一个实验中检测到多种miRNAs。
4. Northern印迹法（NB）：NB也是基于靶miRNAs和互补探针之间的杂交,首先RNA通过变性凝胶电泳进行不同大小的分离,进行两次单独电泳分离miRNA和pre-miRNA，随后将miRNA转移到固相膜上，然后用互补的寡核苷酸探针与膜杂交过夜。NB具有高度特异性，可以确定目标miRNA的序列和长度，这是该方法的最大优势，放射性和非放射性探针均可用于检测miRNA，对RNA降解的敏感性是这种方法的最大缺点，这就是为什么它不太常用的原因。
5. 下一代测序（NGS）：NGS是目前检测靶向miRNA和新型miRNA最常用的方法，它能够在短时间内处理数百万个序列读取，同时保持高度的敏感性和特异性。分离RNA后，连接子连接到RNA的3'和5'端，然后对其进行逆转录、PCR扩增和测序。针对NGS数据的分析，已经开发了各种软件程序，通常专门用于特定的分析部分（isomiR的检测和处理、外源序列和不同非编码RNA的检测以及miRNA从头鉴定）。这些程序可以保留相对于miRNA长度（15-40nt）的读数，因此，与mRNA相关的其余数据不会掩盖所需数据。与其他用于miRNA检测的方法不同，NGS不局限于已知的miRNA，这使其成为目前大多数研究的首选方法，虽然相对昂贵并且需要大量的计算支持来进行数据分析，但它是具有最高灵敏度和重复性的方法。
四、miRNA在当前分子诊断中的应用
miRNA常从不同器官（脑、心脏、内皮细胞、卵巢、子宫和乳腺）和肿瘤组织释放到血液中，基于这一认识，miRNA诊断panels（面板）被设计用于确定癌症起源、疾病进展和预测化疗耐药性。尽管已有许多研究表明miRNA在个性化医学中是一个很有前景的生物标志物，但目前用于临床的miRNA panels却很少。主要障碍之一是，在创建miRNA诊断panels时，必须计算分析前的样本变量，以避免检测不一致的潜在来源，固体和液体活检样本的分析前变量包括样本的质量或数量、样本采集和制备方法、固定物类型和储存条件。液体活检与组织活检相比有一个主要优势，因为它们更容易获得，尤其是对于尿液和血液样本。循环miRNAs可从静脉血浆或血清中获得，两者表达谱无明显差异,尿液与血液相比具有无创且易于处理等优势，但这两种样本均适合基于miRNAs的大规模癌症筛查。
由于开发准确、简单和商业化的诊断方法（涉及标准化的分析前和分析后操作）面临挑战，目前只有少数miRNAs panels提供给临床医生，对于临床应用而言，循环miRNAs作为诊断和预后生物标志物最重要的评价标准是高灵敏度和特异性，这是避免假阳性或假阴性诊断所必需的。据了解，目前为止只有两家公司开发了一种高度复杂的、商业化的miRNA诊断检测甲状腺结节内的遗传异常，Interspace Diagnostics的ThyraMIR®和Rosetta Genomics Ltd的ThyGeNEXT®、RosettaGX Reveal™检测一起使用，有助于提供关于不确定的甲状腺结节发展为癌症风险最准确的信息。RosettaGX Reveal™检测在ThinPrep制备的玻片上与甲状腺针穿刺活检直接涂片具有相同的高水平性能。分子panels与细胞学上的互补使用能够区分随着时间的推移观察到的良性甲状腺结节和需要手术的恶性结节。来自Rosetta Genomics的第二代miRview®mets检测可用于识别42种来源不明或不确定的肿瘤的原发来源，包括肉瘤、淋巴瘤和其他非上皮性恶性肿瘤。
TAmiRNA的osteomiR®能够并行检测人血清样本中与骨质量和骨质疏松症相关的19个microRNA生物标志物，来自同一家公司的ThrombomiRs®可以检测体内血小板功能而不依赖于激活途径，作为心血管疾病诊断程序的一部分。据Hummingbird Diagnostics网站介绍，公司在最初的两个临床应用中开发了一种基于血液的miRNA panels，可以检测非小细胞肺癌的早期阶段并预测疾病IV期的免疫治疗反应。
尽管各种生物体液都适合miRNA的分离和检测，但使用血液样本作为无创的检测材料，开发基于miRNA的临床检测试剂盒是一种趋势，为了更快地检测人体不同的病理变化，在临床中应用miRNA panels之前还需要复杂的验证和标准化程序，以避免潜在的技术偏差。此外，miRNA检测在液体活检中的应用与用于监测疾病的cfDNA或循环肿瘤细胞（CT）检测的相同目的并无太大差异。所有可以在体液中检测到的潜在生物标志物都有很大的潜力，但也有一些局限性，近年来，人们将其作为组合进行了研究，在同一检测中检测突变、甲基化和转录调控。
五、未来展望
在癌症和感染性疾病的例子中，miRNA在疾病的发生和发展中起着非常重要的作用，它们控制细胞内过程并精确调节各种细胞成分的表达水平，因此，miRNA失调促进发病机制。miRNA是调节许多基因表达的小分子，具有一个非常重要的特异性：miRNA家族的成员的基因分散在整个基因组中，但它们都有相同的短种子序列（2-7nt），靶向mRNA的主要识别序列，一个miRNA家族可以调节数百个蛋白质编码基因。此外，一种miRNA调节许多不同的基因和过程，并且大多数miRNA通常与其他miRNA协同工作，形成可以被识别为某些疾病特征的panels，因此，miRNA正被开发作为诊断和/或个性化治疗的靶点，首先，miRNA已被证明具有宝贵的诊断潜力，相对容易发现并可作为诊断标准的一部分，有可能用于早期癌症检测，可以从组织和体液中获取进行非侵入性的早期诊断。此外，miRNA还可作为基因治疗的特定靶点，过表达或下调与已知疾病的特定（亚）类型相关，因此可以采用双重治疗策略：使用模拟物替代miRN的功能或者使用其中一种沉默miRNA的方法（如拮抗剂antagomirs甚至分子海绵）来降低其功能。当用作海绵的靶基因时，沉默整个miRNA家族，并一次停止蛋白质基因表达的多种变化。到目前为止，这两种策略都在开发中，尽管尚未批准基于miRNA的疗法，但目前有近100种正在进行临床试验。最后，基于miRNAs的基因治疗方法可以作为调节药物代谢水平的调节工具。然而，尽管miRNA在疾病发展中的作用是不可否认，但它们的作用机制非常复杂，作为广泛应用的生物标志物的用途仍在研究中。
总之，miRNA是经过充分探索和研究的分子，由于其可用性和特异性，它们是新兴的标记物，不仅在诊断方面而且在预后和治疗过程中都具有很高的潜力。
编译节选自：《Bioengineering(basel)》. 2022 Sep; 9(9): 459.
