成像流式细胞技术的研究与临床应用前景及未来挑战
【摘要】成像流式细胞术（ImFC）代表了细胞分析领域的重大技术进步，它有效地将流式分析的高通量能力与显微镜的精细成像特征相结合。本文通过历史的视角描绘ImFC其发展，强调其起源和目前的技术水平，并预测未来的潜在发展。ImFC的诞生源于将流式细胞仪的液压系统与先进的摄像技术相结合，这种协同作用促进了高通量规模的细胞群形态学分析，这有效地改变了细胞术的格局，然而，ImFC的应用遇到了阻碍，特别是在开发能够管理其复杂的数据采集和分析需求的软件方面，ImFC产生数据的规模和复杂性，需要创造新的分析工具来有效地管理和解释这些数据，从而能够发挥ImFC的全部潜力。值得注意的是，人工智能（AI）算法已经开始应用于ImFC，这有望增强其分析能力，AI的适应性和学习能力可能对从ImFC生成的高维数据中知识挖掘至关重要，从而有可能实现更准确的分析。展望未来，预计ImFC可能不仅在实验室研究，而且在临床上也将成为不可或缺的工具。鉴于ImFC提供的高通量细胞分析和精细成像的独特组合，我们预见该技术在下一代科学研究和诊断中将发挥关键作用，因此，我们鼓励现在和未来的科学家考虑将ImFC集成作为其研究工具和临床诊断常规的补充。
【关键词】流式细胞术；成像流式细胞术；人工智能；表型分析
流式细胞术（FC）是一种强大的方法，可用于表征细胞群体中的复杂表型，以及定量增殖、细胞死亡和细胞分化等细胞过程。FC的基本原理是基于对均质液体混合物中细胞光谱特性的分析，进行FC分析的标准流式细胞仪可分为三个不同的系统：液压系统、光学系统和电子系统。液压系统执行流体动力学聚焦，使单细胞依次通过检测点；在检测点，作为光学系统的一部分，激光源用于激发特异性荧光团（在分析前步骤中添加），而从每个细胞发射的荧光通过检测滤光片；电子系统以数字格式存储荧光信号。这些特点使得FC在血液学、免疫学和肿瘤学等多个科学领域具有重要的价值。成像流式细胞术（ImFC）是传统FC的一个创新和先进技术的分支，其特点是对现有技术进行新的修改和改进。使用相机，ImFC能够提供有关所检测细胞的精细且高质量的视觉信息，更具体地说，它提供有关细胞形态或结构特征的广泛信息，包括对细胞大小、形状、内部结构以及细胞内特定成分或标志物分布的详细分析。因此，成像技术与FC的结合代表了细胞分析的重大进步。这样，用户就有了补充的信息来源来验证荧光数据，并提供全面而准确的细胞群特征，ImFC的原理和重要应用见图1。
图1. 成像流式细胞术（ImFC）的工作流程，ImFC是一种结合流式细胞术（FC）和显微镜技术实现细胞高通量分析的技术。收集细胞并匀浆，以确保含有单个细胞的样本一致，这对准确的FC至关重要。然后将细胞悬液加到成像流式细胞仪中（图中描绘的是Imagestream MK II供参考），将单细胞分离并排列以便成像。当细胞通过时，会被高速成像，捕捉每个细胞详细的荧光和明场图像，对采集的图像进行分析，提取多个数据点。该技术有多种应用，包括：基于细胞核DNA含量和形态的细胞周期阶段评估；检测和表征可能与细胞一起存在的小颗粒，如，外泌体或微泡；细胞的形态和表型特征，包括大小、形状和内部复杂性；基于分析物理分离和收集细胞的分选能力（在所描述的细胞仪中不可用）；以及对细胞内病原体的定量分析，这对研究感染和免疫反应至关重要。ImFC工作流程能够实现快速而详细的细胞分析，促进细胞生物学、免疫学和相关领域的前沿研究。
在不断发展的细胞分析技术中，ImFC以其广泛的应用（特别是在非贴壁细胞的研究中）以及在检测罕见细胞群方面突出的能力脱颖而出，成为一个重要的进步。因此，ImFC同时具有FC和显微镜检查的优点，首先，它与传统FC相比，它的优势在于除了提供细胞的光谱特性之外，还能提供结构信息，ImFC能够捕获流动细胞的高分辨率图像，从而能够可视化细胞形态、细胞内成分的组织以及不同细胞标志物之间的空间关系。这与传统FC相比，这是一个显著的进步，传统FC在很大程度上局限于测量荧光强度，而不能提供产生这些信号的细胞结构的任何背景图像。通过整合结构和光谱数据，ImFC有助于更细致地理解细胞行为、表型变异和复杂的生物学过程。其次，它提供了高通量，这是荧光显微镜所不具备的功能，它与传统显微镜不同，IFC超越了传统的限制，能够同时高通量地分析大量标志物。ImFC在技术上的细微差别使其成为细胞术中的革命性工具，其中包括强大的数据采集、均匀的视野照明和图像的自动分割，它与显微镜相比，ImFC较少依赖监督分析。这些技术进步不仅提高了细胞分析的精度和效率，而且为细胞生物学的突破性研究铺平了道路，这有助于科学界对细胞动力学的理解和探索。
本文论述按时间顺序介绍了ImFC的发展历程，从历史根源到当代应用，并展望了其未来发展中可能面临的挑战，还重点介绍了将该技术从实验室研究转变为实际临床应用所需的关键步骤。
一、成像流式细胞术的历史
多年来，流式细胞术（FC）的发展基于与荧光显微镜相同的原理，主要区别在于荧光被数字化为信号而不是图像，根据细胞仪可以使用成像功能的设想，早在1978年，罗切斯特大学的一个研究团队就开发了成像流式细胞术（ImFC）的初步实施方案，他们设想细胞仪可以使用成像功能，从而推动了ImFC的初步发展。研究者开发了一种执行狭缝成像的狭缝扫描流式系统，这是一个初步的技术里程碑，然而，它超前于时代，还需要20多年的必要的技术演变。检测器和成像系统中关键技术的实现促成了第一台商用成像流式细胞仪的诞生，尽管与荧光显微镜相比缺乏分辨率，但能分析蛋白质颗粒。该领域在近20年的时间里一直受到阻碍，主要是因为需要新技术来支持ImFC的要求。在接下来的20年里，科技界致力于改进和提高这种创新技术，在此期间，主要的障碍来自于当时检测器和成像系统的技术限制，实时捕获和解释FC所需的详细细胞图像的过程需要比当时更复杂、更强大的硬件和软件。在整个20世纪80年代和90年代，人们付出了巨大的努力来开发必要的技术组件，并在确保可靠性的同时提高其分辨率和速度。到21世纪初，该领域的研究和开发开始取得成果，最终促成了第一台商用成像流式细胞仪的推出以及FC领域其他几项的发展。ImFC工具显著增强了成像流式细胞仪功能，包括，引入具有60倍物镜的高分辨率分析、用于定制通量选项的可变物镜、在FC和ImFC模式之间切换的能力以及增强的激光线多功能性以实现更好的试剂兼容性。这些改进使ImFC在生物医学研究中处于独特地位，尤其是在悬浮细胞成像方面，与为贴壁细胞设计的高通量显微镜等系统相比具有优势。ImFC工具标志着ImFC在细胞分析中的开始，与多参数流式细胞术并行。
二、目前的成像细胞分析仪及其应用
随着首次成功引入商业ImFC系统，尤其是最初由Amnis公司开发的Imagestream和FlowSight，ImFC取得了显著进展。这些强大的系统以其优越的性能和先进的功能彻底改变了该领域，这些知识产权于2011年被EMD Millipore收购，截至目前，这些系统在Luminex公司的支持下进行了营销和商业化，这一整合代表了ImFC系统商业轨迹中的一个重要里程碑，凸显了它们在科学和医疗行业日益突出的地位，表1总结了ImFC的一些关键应用。
Headland等人表明，ImageStream Mk II成像流式细胞仪在分析20nm-1µm的微粒和校准珠方面表现出卓越的能力，在最小的样本制备和体积要求方面具有优势，能够准确定量各种样本，包括全血和血浆。值得注意的是，它的性能优于传统的细胞仪，可以检测到小至20nm的纳米颗粒，显示出优越的灵敏度。凭借其先进的多波长成像技术，包括明场成像和流体控制，在定量微粒方面实现了高度相关性，通过详细的表型分析和实时生成动力学，为微粒研究提供了突破性的进展。与此一致，Erdbrugger等人证实，ImFC（使用Imagestream成像FC）是表征微粒(MPs)的一种比传统FC更灵敏的方法。尽管在检测小于0.200µm的MPs方面存在挑战，并且需要更好的标准化校准器，但这种方法提供形态学分析，区分真正的单个颗粒、聚集体或碎片，克服了传统FC的一些局限性。鉴于传统FC在定量和定性分析细胞来源的纳米级囊泡（高达100nm）方面的性能和高分辨率，ImFC有望应用于纳米生物学研究和基于囊泡的生物标志物分析等临床应用。一个有趣的应用是无标记的细胞周期分布分析，利用高通量ImFC，研究人员证明了在整个免疫应答过程中B细胞内抗原的极化分布，这一特征在子代中持续。当B细胞触发体液免疫反应时，它们会收集抗原并递呈给相应的T细胞，在小鼠B细胞积累抗原后，其极化排列在体内持续很长时间，高通量ImFC揭示了这种极化在B细胞有丝分裂过程中保持不变，导致抗原在子代中的分布不均匀。总之，高通量ImFC成功揭示了细胞的细胞周期分布，以及免疫反应过程中B细胞中极化抗原分布的一致模式，这种模式在几代中持续存在。因此，这项技术的进步在增强我们对免疫应答激活机制及其对B细胞分裂和后续子代抗原分离的理解方面发挥了关键作用。
这一创新方法提出了一种无鞘管微流体成像流式细胞仪，该流式细胞仪结合了频闪照明，可在超高分析通量下进行无模糊荧光检测，从而能够检测P小体和应激颗粒的内部定位。该系统能够以显微镜图像质量进行多参数荧光定量和低至500nm的亚细胞定位，荧光和明场检测的分析通量分别超过60,000和400,000个细胞/秒。ImFC已应用于细胞内病原体的分析，Haridas等报道了基于图像流的细胞系中弓形虫和结核分枝杆菌感染的分析，Phanse等人描述了一种分析沙门菌内化的ImFC方法。此外，研究已经显示了疟疾发展的分析，这种分析方法为研究宿主-病原体动态相互作用提供了可能。值得注意的是，ImFC的优势支持其诊断潜力，并有望转化为临床应用。近年来，ImFC的发展显著提高了其检测性能，灵敏度、波长范围、通量和检测限，尤其是荧光性能。Luo等人的研究展示了一种支持深度学习（DL）的ImFC系统，用于高通量检测饮用水中的隐孢子虫和贾第鞭毛虫，该系统的分类准确率超过99.6%，灵敏度为97.37%，特异性为99.95%，显示了346帧/秒的高速分析能力。分析微生物种群以及研究宿主-病原体相互作用的能力，再加上ImFC的潜在诊断能力，凸显了ImFC融入临床应用的巨大潜力，这可能会彻底改变患者护理和传染病管理。
ImFC提供细胞分选功能，这是专用FC分选仪中的一项功能，几种实验条件下，ImFC提供了单细胞分辨率和高度准确的无标记分选，超过90%。无标记细胞之后更容易操作并且不需要经历可能导致活力降低的标记制备步骤。ImFC分离单个靶细胞的准确性提高主要是基于形态学数据分析的能力，机器学习（ML）算法的实现被认为可以进一步帮助开发高度准确、无标记的细胞分选。其无标记分选能力(通过形态学数据分析增强，并通过ML算法进一步增强)最大限度地减少了可能降低细胞活力的制备步骤，从而简化了细胞操作，并确保了较高程度的细胞完整性。值得一提的是，该领域最近取得了重大进展，FACSDiscover S8细胞分选仪是第一款商业成像分选仪，结合了基于光谱和形态图像的分选功能，同样，Visionsort（Thinkcyte）利用鬼影细胞术和人工智能（AI）算法提供强大而准确的分选功能。总的来说，该领域的进展凸显了ImFC在推进细胞和临床研究方面的巨大潜力，从而为医疗和科学行业作出了重大贡献。
三、机器学习与人工智能
人工智能（AI）和机器学习（ML）代表了革命性的技术，正在改变社会的各个领域。人工智能（AI）指通过机器，尤其是计算机系统来模拟人类的智能过程，而人工智能的一个子集—机器学习（ML）则涉及开发算法，使计算机能够从数据中学习并做出决策，从而在没有明确编程的情况下，随着时间的推移提高它们的性能。ML算法已广泛应用于ImFC，在Eulenberg等人的一项多重分析中，深度学习（DL）提供了重建细胞周期分布等生物过程以及疾病进展的前景，重要的是，基于DL的预测除了灵敏度高之外，还足够快，可以支持ImFC生成数据的高通量，DL已成功用于评估ImFC数据，并被认为改变了高通量细胞分析的格局。一些成功的应用支持了这一观点，例如，Subramanian R等人使用3D成像流式细胞术（3D-ImFC）在单细胞分辨率下揭示肝星状细胞（HSC）和肝内皮细胞（LEC）的形态，在研究中，提出了将肝细胞的透射和侧向散射单细胞图像与AI相结合，以提供非酒精性脂肪性肝炎（NASH）进展的分期系统。断层扫描成像流式细胞术（tIFC）已从2D成像发展到3D成像，可对颗粒的表面和内部结构进行成像。AI和ML在ImFC中的成功整合，证明了这些技术在推进我们对细胞生物学和疾病机制的理解方面令人兴奋的前景。重要的是，ImFC通过微流体和芯片实验室技术，旨在简化这些分析并降低成本，高分辨率单细胞成像可最大限度地提取数据并能够使用更小的样本量，将ML和DL集成到ImFC中的预期收益是巨大的，预计将推动该领域的未来创新。
ImFC被证明是蛋白质治疗领域的一个有价值的工具，特别是成功利用在蛋白质-硅油（SO）复合物的研究中，当蛋白质颗粒吸附到硅油滴上时产生复合物，这一过程有可能引发免疫反应，因此了解和监测这一过程至关重要。在Probst等人的研究中，ImFC提供了一种独特的能力来测量这些不溶性颗粒的数量和形状的关键参数。为了进一步提高技术的实用性，研究人员引入了ML技术。通过ImFC产生的大量粒子图像数据，开发了一种可以有效分类和计数蛋白质-SO化合物的ML模型，这种ImFC和ML的结合不仅增强了对蛋白质-SO复合物的分析，而且拓宽了未来在蛋白质治疗和其他相关领域的应用范围。ImFC和AI对非白细胞（non-WBC）细胞的分类做出了同样重要的贡献，如，外周血有核细胞（PBNCs）中的循环稀有细胞。Hirotsu等将无标记ImFC与AI软件相结合，设法在癌症患者和健康志愿者的PBNCs中区分出非WBC组分的循环稀有细胞，这种方法为癌症患者监测和治疗优化提供了令人兴奋的前景。
在最近发表的一篇文章中，Doan等人详细描述了通过DL技术分析ImFC图像的过程：首先用具有特定表型的样本图像训练模型，然后模型使用图像像素作为输入，预测新图像的结果。这种直接分析方法也同样应用于最近的一项使用传统显微镜的研究中，其中荧光分化标志物作为训练分类器的事实基础，然后这种分类器能够基于明场图像主动预测细胞分化。深度细胞术是DL的最新应用，其中不需要图像重建，可以进行实时、无监督的细胞分选。深度细胞术的未来意义正在显现，首先，通过使用DL算法，可以在最少的人工干预下实时进行细胞分析和分选，这可以显著提高流程的速度和效率，从而能够处理更大的样本，并有可能产生更可靠的结果。其次，基于微妙的相关性和特征，AI可用于识别细胞中人类可能无法立即发现的复杂模式或特征。第三，AI有望根据历史数据预测未来趋势或行为，这可能有助于研究疾病进展或细胞水平治疗的效果，通过使用AI分析过去的细胞检测数据，可以创建预测模型来预测特定条件下的细胞反应。
AI、ML，尤其是DL技术对ImFC产生了变革性影响，使多细胞数据分析达到了前所未有的准确性和效率，并增加了我们对疾病进展和免疫等复杂生物现象的理解。AI和ML有助于高度准确、实时、无监督的细胞分析，也可能为复杂的细胞形态提供有价值的见解，开辟基于细胞的研究新领域，并提供了临床应用的未来前景。
四、成像流式细胞术和血液学：思维转变的基础？
在本文的前几节中，我们重新讨论了ImFC的概念，它结合了流式分析的高通量功能和基于图像的显微镜功能，代表了细胞术领域的一项重大技术进步，这种创新方法有可能为血液病的研究开辟新的途径，它与传统细胞术相比具有明显优势，并与其他新型分子方法［如，下一代测序（NGS）］互补和/或竞争。NGS彻底改变了血液学，为各种血液疾病的遗传和分子基础提供了见解，NGS使血液系统恶性肿瘤（如白血病和淋巴瘤）的全面基因组分析成为可能，揭示了驱动这些疾病的复杂突变环境。这不仅提高了我们对疾病发病机制的理解，而且促进了靶向治疗的开发，导致更个性化和更有效的治疗策略，并有助于可测量残留病灶（MRD）的检测，而MRD是患者预后和治疗成功的关键因素。尽管在数据解读和临床应用整合方面存在挑战，但NGS在血液学领域的影响是变革性的，其在诊断、预后和治疗方面进一步发展的潜力仍然是巨大。NGS和传统FC虽然方法不同，但在血液学领域都发挥着至关重要的作用，它们相互补充，FC提供了快速、实时的细胞特征和蛋白质表达分析，而NGS提供了深入研究细胞遗传和分子信息的机会，但在某些领域存在竞争。例如，虽然FC一直是免疫表型分型、细胞活性状态和MRD检测的金标准，但NGS越来越多地用于此类应用，因为NGS在检测疾病相关基因和低频突变方面也提供了很高的灵敏度和特异性。
除了经典的细胞术，ImFC的主要优势之一是其高通量能力，与限于处理大量细胞的荧光显微镜和需要大量时间进行测序和数据分析的NGS不同，ImFC每秒可以快速处理和分析多达5000个细胞/目标。这种高通量能力可以更全面地分析细胞群，这在血液病情况下尤其有用，因为可以通过细胞群的变化来监测疾病进展。除了高通量能力外，ImFC还提供有关其分析的细胞的详细形态信息，包括细胞大小、形状、内部复杂性以及细胞中特定标记的分布，NGS通常不具备这种详细程度，因为NGS更注重遗传和分子信息。在血液系统疾病中，细胞形态学可以提供重要的诊断和预后信息，使ImFC在这些情况下成为有价值的工具。ImFC还利用DL进行数据分析，基于DL的预测不仅灵敏，而且速度足够快，可以支持ImFC生成的高吞吐量数据，与NGS相比，ImFC和人工智能的结合可以提供更高效、更简化的分析，而NGS通常需要更复杂、更耗时的数据分析。虚拟冷冻成像流式细胞术等新进展表明，利用人工智能算法实现信息丰富的细胞数据可以进一步提高ImFC的输出和吞吐量。Kalfa等描述了通过将FC的定量分析能力与显微镜的形态学评估能力相结合，利用ImFC增强了对红系成熟的研究（这一过程通常通过显微镜观察）。ImFC是一种强大的工具，可用于计数原代组织中红细胞生成的各个阶段，以及培养祖细胞来研究稀有的去核细胞，缩小了显微镜和FC之间的差距，为红细胞生成提供了全面的分析。
Fuller等人验证了先进的免疫流式FISH（荧光原位杂交）方法的有效性，该方法在自动ImFC框架内将免疫表型分型和FISH相结合，从而准确检测CLL的染色体异常，其灵敏度超过了目前的临床标准。高通量ImFC与特定荧光探针和免疫表型标志物的结合可以精确识别CLL细胞及其染色体缺陷，大大提高了微小残留病灶监测的检测限。从技术上讲，该过程包括使用特异性荧光标记抗体进行细胞染色、DNA变性和FISH探针杂交，然后进行自动化、高分辨率的图像采集和分析，而无需预先进行细胞分离，即可在单次检测中同时评估多种染色体异常。Tsukamoto等人也提出了免疫表型-悬浮液-多重（ISM）-FISH，这是一种新的诊断方法，用于同时检测多发性骨髓瘤中的关键染色体易位［t(4;14)、t(14;16)和 t(11;14)］，该方法使用抗CD138抗体进行免疫表型分析，并通过ImFC分析多重FISH，该方法在灵敏度和效率方面超越了传统的FISH，能够分析超过25,000个有核细胞，检测灵敏度高达0.1%，与标准FISH高度一致，为指导多发性骨髓瘤的个体化治疗策略提供了一种快速、灵敏、可靠的诊断工具。
综上所述，NGS为在分子水平上理解血液病作出了重大贡献，而ImFC在高通量能力、详细形态信息、深度学习集成和无标记分类方面具有独特优势，因此，ImFC是研究血液病的有力工具，并为该领域的诊断和研究的未来带来了巨大的前景。
五、未来展望
ImFC是流式细胞领域的一项相对较新的技术，目前正在开发的新ImFC系统提高了速度和分析能力。ImFC发展的一个令人振奋的例子是鬼影细胞术。Ota等人将其描述为一种无图像快速荧光“成像”细胞术，实现了从细胞相对于静态光学结构的运动中获得的空间信息的单像素检测器，这些数据通过计算重建细胞形态，并允许快速、准确和廉价地进行分析以及细胞分选的潜力。最近研究支持了鬼影细胞术的新进展，为该方法的实用性及其在急性白血病细胞检测中的应用提供了证据，但需要由不同研究小组开展更多、更大规模的研究来验证这些有前景的结果。Suzuki等人引入了无标记化学ImFC，将FC的快速分析能力与荧光成像和数字分析的特异性相结合，并通过新型脉冲对分辨、波长可切换的斯托克斯激光器进行增强。这一进步使得以最快的速度对流动中的细胞进行多色受激拉曼散射（SRS）显微检查成为可能，在3D声聚焦微流体芯片上实现了前所未有的高达140个细胞/秒的吞吐量。为了展示其多功能性，该方法被用于研究微藻的代谢异质性和无标记的情况下检测血液中的癌症，利用DL来提高准确性。
六、结论
ImFC是近年来发展起来的一种技术，基于其在研究和临床中的潜力，它有望彻底改变我们研究、定量、描述和最终理解细胞机制的能力，在基础和转化研究领域，ImFC除了提供FC的高通量能力外，还提供了关于细胞形态的信息，这有助于理解细胞结构及其各自的功能。通过对单个细胞进行高通量分析，提供了细胞动力学的详细客观的视图，使研究人员能够实时观察细胞分裂、抗原分布和细胞内病原体行为等过程。额外的形态学数据极大地有助于研究复杂的生物现象，并可以显著提高准确性。在临床环境中，尽管目前的数据有限，但ImFC的高精度和其执行无标记分类的能力，以及其与ML算法的兼容性，这表明ImFC在诊断应用方面的良好前景。从细胞水平的疾病进展研究到潜在的针对患者的治疗，如果ImFC成功应用，可能会改善患者护理。ImFC实时分析大量细胞群的能力也有望在高通量临床工作流程中应用，从而可能加快诊断和治疗。总之，ImFC在研究和临床环境中的影响预示着基于细胞的研究和医疗实践的光明未来。
本文编译节选自：《Methods Protoc》. 2024 Apr; 7(2): 28.
