磁微粒化学发光法检测HBsAg临界值的确定及触发确证HBsAg检测范围
【摘要】对所有初始S/CO值为0.90-100.00的样本经高速离心后进行重复HBsAg检测。将初始S/CO值在该范围内的样本保持在同一范围内,然后进行确证性HBsAg检测。结果表明,在132份经高速离心后S/CO值在0.90-100.00之间的样本进行了HBsAg复检,HBsAg确证样本的S/CO值为0.98(灵敏度100%,特异度3.3%)-9.32(灵敏度47.1%,特异度100%)。结论:触发确证HBsAg检测的HBsAg S/CO值(通过磁微粒化学发光[CMIA]法确定)为0.98-9.32。
【关键词】CMIA;乙型肝炎;S/CO值;假阳性
近年来,乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是全世界最流行的疾病之一。世界卫生组织(WHO)2017年的一份报告指出,全球约有2.57亿人感染了HBV。2015年HBV感染的国际流行率约为3.5%,其中太平洋地区、非洲和东南亚的流行率最高。印度尼西亚基础卫生研究2017年获得的数据显示,印度尼西亚人口中的HBV感染率为7.1%,2.7%的孕妇有反应性乙型肝炎表面抗原(HBsAg)检测结果。大约90%的围产期感染会进展为慢性HBV,这是肝硬化和肝细胞癌的最常见原因。
HBsAg是广泛应用于HBV感染筛查和诊断的血清学标志物。WHO指南建议在HBV感染率高(≥2%)的国家常规使用HBsAg标志物进行产前筛查。HBsAg检测分析灵敏度的增高提高了检出率,这有助于早期诊断。然而,弱反应性(弱阳性)和假阳性结果的风险也增加了,使用确证HBsAg检测有助于临床医师鉴别弱反应性结果和假阳性结果。在欧洲和北美的富裕国家,所有反应性HBsAg结果,特别是临界(cut-off)反应性HBsAg结果,必须进行重复HBsAg检测和HBsAg确证检测,以确保实验室结果的准确性,并防止不必要的治疗。然而,如果对所有HBsAg检测进行确证检测,患者治疗可能会延迟,实验室检测的成本可能会增加。印度尼西亚雅加达国立中央总医院Dr Cipto Mangunkusumo(RSUPNCM)中心实验室的HBsAg检测目前使用的是磁微粒化学发光(CMIA)方法,该方法的灵敏度为98%,特异性为97%。关于CMIA方法确定的S/CO值应触发后续确证检测,目前尚无官方指南,因此,不同实验室的范围值可能会有所不同。
在我们的研究中,对所有反应性样本进行确证检测的成本太高,因为几乎所有样本都来自印度尼西亚国民健康保险仅覆盖有限范围的患者。既往不同HBsAg定性检测方法的研究结果表明,弱反应性样本(临界值较低的样本)应采用确证检测方法进行结果验证。因此,确定应触发HBsAg确证检测的反应性S/CO值至关重要,以提高检测结果的准确性,更快速、更准确地给予治疗,并应用质量控制和成本控制的原则。本研究的目的是确定用CMIA法检测的HBsAg S/CO值是否应触发HBsAg的确证试验,以便更有选择性、更高效地进行确证试验。
一、研究对象与方法
1. 血液样本:从2019年10月到2020年6月,我院中心实验室共对来自急诊科、住院病房和门诊的19,645份样本进行了HBsAg检测。所有样本均用普通管采集,在HBsAg检测和HBsAg确证检测之前和检测期间,样本室温保存。2,500g离心5min分离血清样本,并立即检测HBsAg。所有初始S/CO值为0.90-100.00的样本均在16,000 g高速离心15min后进行HBsAg重复检测。进行了高速离心,以减少脂血症、纤维蛋白干扰或其他颗粒物干扰的可能性。样本S/CO值保持在0.90-100.00之间,这些值触发了HBsAg确证检测,所有样本的HBsAg确证检测均在样本送达实验室后6h内完成。
2. HBsAg和HBsAg确证检测:在ARCHITECT i2000分析仪上使用HBsAg Qualitative II(REF 2G22)试剂进行血清HBsAg检测。每份样本在高速离心前后各检测1次HBsAg。然后将S/CO保持在0.90-100.00范围内的样本在ARCHITECT i1000分析仪上使用HBsAg Qualitative II /confirm/iatory(REF 2G23)试剂进行确证检测。HBsAg检测采用阳性和阴性质控物进行不精密度试验(CV分别为1.81%和6.96%);阳性质控物用于HBsAg确证试验(CV为1.41%)。ARCHITECT i2000和i1000分析仪使用了CMIA方法。在Architect HBsAg Qualitative II试验中,血清样本、抗-HBs包被的顺磁微粒和吖啶标记抗-HBs偶联物发生了反应,样本中的HBsAg会与抗HBs包被微粒和吖啶标记抗HBs偶联物结合。测量产生的化学发光反应并与临界信号进行比较,如果样本中的信号大于或等于临界信号(S/CO≥1.00),则认为样本对HBsAg具有反应性。
ARCHITECT HBsAg Qualitative II确证试验是基于人抗- HBs的中和反应。该方法有2种不同的前处理试剂,预处理试剂1含有人抗-HBs,而预处理试剂2不含。每种预处理试剂在分析仪的不同反应容器中与样本一起孵育。样本中中和的HBsAg被阻止与抗-HBs包被的微粒结合。如果未中和样本(与预处理试剂2孵育)的信号大于或等于临界值(S/CO≥0.70),并且中和样本(与预处理试剂1孵育)的信号与非中和样本相比至少降低50%,则认为该样本检测阳性。每份样本的确认结果由分析仪自动判读,结果显示在分析仪屏幕上。
3. 统计学分析方法:使用SPSS 20版(IBM)和Excel 2016版(Microsoft)分析数据。根据S/CO值和HBsAg确证结果进行分组。采用Mann-Whitney检验比较高速离心后反应性HBsAg确证结果组与无反应性(阴性)HBsAg确证结果组间S/CO值的差异。对高速离心后的S/CO值进行ROC分析。
二、研究结果
初始S/CO值为0.90-100.00的样本有161份,对这些样本进行高速离心和重复HBsAg检测。经高速离心后S/CO值为0.90-100.00的132份样本中,102份经HBsAg确证试验证实为反应性样本。S/CO值为0.90-100.00的132份样本中,22.7%(30/132)的样本HBsAg与确证结果不一致。真阴性样本18,290份,本研究HBsAg定性检测的假阳性率为0.16%。血液样本纳入本研究的受试者特征见表1。
我们观察到,在S/CO值较高的组中,确证反应性HBsAg结果的百分比较大。高速离心后S/CO值为0.90-5.00的样本中,59.1%确证为反应性结果,而S/CO值为>10.00的样本中,100%确证为反应性结果(表2)。
经高速离心后,确证反应组S/CO值的中位数为8.25,而非反应组为1.68(P<.001)。对高速离心结束后的S/CO值进行ROC分析。分析触发强制确证HBsAg检测的S/CO值范围。下限是灵敏度为100%、特异性最高的S/CO值,上限是特异性为100%、灵敏度最高的S/CO值(见图1)。根据ROC分析结果,S/CO值在0.98(灵敏度100%,特异性3.3%)到9.32(灵敏度47.1%,特异性100%)之间时应触发HBsAg确诊检测。AUC为83.3%,P值<.001(见图2)。
图1. 乙型肝炎表面抗原确证检测必须遵循的S/CO值范围:不同S/CO临界值的灵敏度/特异性
图2. 高速离心后S/CO值的受试者工作特征曲线(曲线下面积,83.3% [P<.001])
对于HBsAg结果不一致的受试者(初始HBsAg结果有反应性,但确证HBsAg结果无反应性),其临床特征以病历中的诊断为依据。最常见的诊断是高血压、糖尿病、慢性肾病和社区获得性肺炎,大多数受试者都有一项以上的诊断。
三、讨论与分析
实验室检测在HBV感染的诊断和监测中发挥着重要作用,其中HBsAg是最常用的血清学标志物。反应性HBsAg检测结果提示HBV感染,然而,患者血清中HBsAg消失和抗-HBs出现之间的窗口期有时使HBV感染的诊断更加复杂。使用高灵敏度的HBsAg检测可以部分解决这一问题,但也会增加假阳性结果的风险。大多数假阳性结果来源于弱反应性样本。在本研究中,需要进行HBsAg确证检测的HBsAg样本比例低于1%,这一数值与Shao等报道的数值非常相似。纳入的大部分样本来自男性,平均年龄为48.9岁,结果与印度尼西亚的HBsAg阳性流行率一致,后者在男性和45-49岁年龄组中最高。
本研究中的大多数样本(77%)都有反应性确证结果,这与之前使用不同HBsAg 检测方法进行的研究结果一致。我们的研究结果表明,大多数弱反应性HBsAg 样本都能通过HBsAg确证检测被确认为具有反应性,反应性确证组的S/CO中位数明显高于无反应性确证组。Shao等人和Sholikhah等人之前使用电化学发光免疫分析法(ECLIA)进行的研究结果也显示,弱反应性HBsAg样本中分别有约 60%和88%的HBsAg确证结果为反应性。这项研究的结果也与Purnamawaty等人的研究结果一致,他们使用酶联荧光法(ELFA)检测结果显示,63.8%的HBsAg样本确证结果为反应性。
本研究确定的触发HBsAg确证检测的S/CO值范围是基于最低S/CO和最高S/CO临界值。最低的临界值为灵敏度为100%,特异度最高的S/CO值,因此需要确认的所有反应性HBsAg样本都将被纳入。最高的临界值为特异性100%,灵敏度最高的S/CO值,因此所有不需要HBsAg确证检测的样本将被排除。因此,应触发HBsAg确证检测的HBsAg S/CO值范围为0.98-9.32。在这项研究中,30份无反应性确证检测结果样本的S/CO值都<10.00,而所有S/CO值>10.00的样本都被确证为反应性样本。在S/CO值较高的样本组中,确证为反应性样本的比例更高。大多数无反应性确证检测结果样本的S/CO值都<5.00。这些结果可作为确定HBsAg S/CO值的依据,以使用CMIA方法进行 HBsAg确证检测。Chang等提到在接受血液透析的慢性肾脏病患者中可以发现不一致的HBsAg结果。Arleevskaya等报道,细菌感染(如肺炎克雷伯菌或肺炎衣原体感染)可触发类风湿因子形成。Xu等发现类风湿因子干扰可增加或降低HBsAg ELISA法检测的S/CO值。然而,由于有关肺炎病因的信息有限,并且没有对样本中的类风湿因子水平进行进一步检测,因此我们的研究中导致HBsAg结果不一致的原因无法确定。
结论:根据本研究结果,CMIA法检测的需进行HBsAg确证试验的HBsAg S/CO值为0.98~9.32。因此,这与过去相比,确证性HBsAg检测可以更有选择性、更有效地进行。CMIA法检测HBsAg结果不一致的可能原因仍需进一步研究。
编译节选自:Laboratory Medicine, Volume 53, Issue 5, September 2022, Pages 475-478.