全自动液相色谱-串联质谱法检测对日本成人血清25-羟基维生素D参考范围的意义
【摘要】目的:尽管人们对维生素D状况的关注与日俱增，但该营养素的参考范围尚未完全确定，部分原因是缺乏高通量的标准化测量系统。此外，维生素D的参考范围可能因人群而异，也可能随着生活方式的现代化而发生变化。本研究旨在计算目前日本城市地区健康人群25-羟维生素D [25(OH) D]的参考浓度。方法: 采用新开发的全自动液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)系统测量血清中25(OH)D的浓度，通过测量标准化样本评估了再现性。通过与市售免疫测定法进行比较,验证了准确度。然后，针对2019年4月至2020年3月期间在东京接受体检的参与者进行了大规模筛查,并计算出了参考范围。结果:25-羟基维生素D2[25(OH)D₂]的操作者间变异系数为4.1%-8.5%，日间再现性为3.7%-8.0%;25-羟基维生素D₃[25(OH)D₃]的操作者间变异系数为4.7%-7.0%，日间再现性为4.0%-6.9%。测得的总25(OH)D浓度与免疫测定测得的浓度密切相关。共计5,518名参与者接受了25(OH)D浓度测定，其中98%的参与者浓度不足(<30 ng/ml)。女性、男性和总人群的总25 (OH) D参考范围分别为7-30ng/ml、5-27ng/ml和6-29ng/ml。排除肾功能、肝功能异常者后，范围为6-30ng/ml。结论:在表观健康的人群中，维生素D不足的高患病率，这可能与日本城市地区居民的生活方式有关，包括户外活动时间较少和传统食物摄入量较低。针对不同人群的纵向随访和大规模筛查将有助于阐明官方指南与所观察到的浓度之间存在差异的原因，对此，经过充分验证的测量系统至关重要。
【关键词】维生素D;参考范围；LC-MS/MS;大规模筛查；检验医学
维生素D是一种多效营养素，在多个器官系统中发挥作用。众所周知，充足的维生素D是预防儿童佝偻病、成人骨软化症和老年人骨质疏松症的必要条件。最近的研究还发现，维生素D缺乏与呼吸系统疾病、自身免疫性疾病、各种癌症、糖尿病、慢性肾病、痴呆症、抑郁症、不良妊娠结局和体能下降有关。尽管这种物质起着关键作用，但维生素D不足、缺乏症的评估标准方法尚未明确建立。在临床检验医学领域，定义营养状况的临界值（cut-off）是有用的，但描述健康人群中的参考范围也很重要。然而，维生素D和其他营养素的参考浓度在人口统计学背景下往往有所不同。即使在具有相似人口统计学背景的人群中，浓度也可能随着生活方式的变化而变化，例如户外活动时间和饮食习惯的改变。这种变异性可能会导致测量的维生素D浓度与健康结果脱节。例如，25-羟基维生素D[25(0H)D]浓度与健康状况之间的不一致现象（即所谓的“维生素D悖论”）已经得到公认。具体来说，具体而言，一些骨密度较高的人群血清25(0H)D浓度较低。此外，也有报道称，通常比普通人更健康的运动员中，维生素D缺乏症的发病率相对较高。一些报告还指出，25(OH)D浓度的差异不能完全用不同皮肤色素沉着引起的阳光暴露差异性功能来解释，并且不同地理来源的人群中可能存在其他25(0H)D浓度的遗传决定因素，因此，从理论上讲，应在多个健康人群中开展维生素D浓度的大规模筛查，以提高血清25(0H)D在个人健康状况评估中的应用。
实施大规模筛查的一个重要挑战是缺乏测量维生素D浓度的标准化方法。在已鉴定的>50维生素D代谢物中，25(0H)D因其生物稳定性和在体内的半衰期长而
成为最常用的维生素D状态指标。美国维生素D标准化计划(VDSP)与英国和欧洲维生素D外部质量评估计划以及美国国家标准与技术研究院(NIST)合作，开发了一套参考测量系统，以建立25(0H)D测量的国际标准化。即使有了这种标准化，最近的一项实验室间比较研究表明，只有50%的免疫测定符合VDSP平均偏倚≤5%的标准。VDSP特别警示，使用非标准化检测数据可能导致维生素D不足患病率的虚高或低估，进而影响膳食维生素D摄入指南的制定。因此，必须实现维生素D测量的标准化，以便就维生素D状态达成国际共识。
液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)定量分析方法是一种新开发的实验室检测系统，与化学发光酶免疫分析法(CLEIA)和电化学发光免疫分析法(ECLIA)等免疫学方法相比，其偏倚较小；因此，基于LC-MS/MS的方法被推荐为测量25(0H)D的黄金标准。尽管如此，LC-MS/MS也面临着一些可能成为标准化障碍的挑战。这些挑战包括样本前处理(预处理)、使用一致的色谱柱、洗脱条件以及可标准化的离子源，相对较长的运行时间也阻碍了这些方法用于大规模筛查。为了应对这些挑战，Shimadzu公司最近开发了一种集成的LC-MS/MS系统，该系统的预处理程序完全自动化，显著缩短了运行时间，并能够使用LC-MS/MS进行大规模筛查。该全自动LC-MS/MS系统已在类固醇、抗生素、修饰核苷、5-FU、有机酸和毒理学分析中得到验证。本研究采用全自动LC-MS/MS系统进行25(0H)D的大规模筛查。这项分析针对的是日本城市地区表观健康的人群，这些结果强调了使用经过验证的方法测量维生素D状态的重要性。还强调了重新评估不同地区和不同人群中高危患者维生素D营养状况差异的必要性。
一、材料与方法
1. 通过全自动LC-MS/MS系统进行测量：(1)化学品和试剂：校准品和质控品由Golden WestDiagnostics，LLC提供。内标²H₆-ercalcidiol和²Hcalcidiol购自Alsachim。超纯水、甲酸、乙腈、甲醇和异丙醇购自Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation。(2)测量程序：对于25(0H)D的测量，采用全自动LC-MS前处理装置，临床实验室自动化模块（CLAM-2030; Shimadzu Corporation)的LC系统与超快三重四极杆质谱仪（LCMS-8050）联用。CLAM-2030可自动将血清样本与处理试剂混合，脱蛋白后，通过自动进样器将样本上样到LCMS-8050，这一组合产生了CLAM/LC-MS/MS方法。
使用CLAM-2030进行样本制备时，将人血清(30μl)添加到用20μL 75%异丙醇进行预处理的聚四氟乙烯过滤瓶（孔径为0.45μm）中。再加入含有50ppb同位素标记内标的乙腈样本（90μl）。将混合物在149×g下搅拌60s，然后在真空压力（-55至-60kPa）下过滤60s，将提取物样本（3μL）注入LC-MS/MS系统。
色谱系统包括两个Shimadzu LC-30 AD泵（NexeraX2）、—个CT0-20AC烘箱和—个SIL-30AC自动进样器（Shimadzu）。色谱分离使用Shim-pack Velox PFPP色谱柱（2.7μm3.0×5mm；Shimadzu）作为保护柱，Shim-pack Velox PFPP色谱柱（2.7μm 3.0×100mm;Shimadzu）作为分析柱。使用缓冲液A（含有0.1%甲酸的水溶液）和缓冲液B（甲醇）的梯度作为流动相，流速为700μl/min。梯度时间为：0.00-2.40min，80%一86%流动相B；2.41-3.40min，100%流动相B；3.41-4.60min，80%流动相B。烘箱温度设定为30℃。LC-MS/MS分析采用LCMS-8050三重四极杆质谱仪，采用正化学电离模式。界面参数及常用设置如下，雾化气体流量：3.0L/min；界面温度：375℃；脱溶剂气管线温度：225℃，热块温度：250℃。通过计划的多重反应监测在40-ms停留时间测量所有化合物。采用多反应监测方法检测血清中的分析物和内标物，其中25-羟维生素D₂[25(0H)D₂]、25-羟维生素D₃[25(OH)D₃]、²H—25(OH)D₂和²H—25(OH)D₃的前体-产物离子转换参数分别为m/z 395.3→269.3、m/z383.4→257.2、m/z 401.3→209.2及m/z 389.5→371.4。
通过确定3-epi-25(0H)D₂与3-epi-25(0H)D₃的色谱峰分离度，评价25(0H)D₂及25(0H)D₃检测的特异性。这两种分析物是由稳定同位素标记的25(0H)D₂和25(OH)D₃产生的。为了评估测量方法的准确度，使用了一组已知浓度的符合NIST标准的25(0H)D₂和25(0H)D₃血清(Golden West Diagnostics)作为校准品[25(OH)D₂: 4.5–122.1ng/mL, 25(0H)D₃: 4.9–125.9ng/mL]。每个样本测量一次，然后计算准确度(%)。为了测量操作者间再现性，连续测量了4个不同浓度的专用对照样本(Golden West Diagnostics)中25(0H)D的总浓度，共10次重复，并计算了平均值、标准偏差(SD)和变异系数(CV，%)。对于日间再现性，在10天内每天测量一次同一对照组中25(0H)D的浓度，并计算平均值、SD和CV%。
2. 自动免疫分析与CLAM/LC-MS/MS方法的测量结果比较：将25(0H)D₂和25(OH)D₃浓度之和作为25(OH)D浓度，并将该值与由日本药品医疗器械机构正式批准的两种不同免疫学测定法测量的等效值进行比较。一种用于比较的方法是使用测量设备Lumipulse 25(OH)D(Fujirebio)的CLEA。另—种方法是使用EclusisReagent Vitamin D Total II和设备Cobas 8000 e801进行的ECLIA。随机选择50个样本，将CLAM/LS-MS/MS方法的结果与CLEIA和ECLIA的结果进行比较。
3.25(OH)D的大规模筛查:大规模筛查的—个重要挑战是缺乏测量维生素D浓度的标准化方法。在已鉴定的>50维生素D代谢物中，25(0H)D因其生物稳定性和在体内的半衰期长而成为最常用的维生素D状态指标。
(1)研究人群:连续招募了2019年4月至2020年3月期间(不包括2019年12月)在东京慈惠会医科大学医学院预防医学中心和慈惠会医科大学医院Toriton诊所接受体检的所有人员。在体检前，已获得所有参与者关于使用剩余血清进行临床研究的知情同意，同意剩余血清用于研究。
(2)收集剩余血清:参与者在体检时采集全血，采血后立即离心获取血清。剩余血清被分装到封闭的塑料管中，并在-80℃的冰箱中避光储存。冷冻血清样本在进行维生素D测定前立即在室温下解冻。
(3)信息收集:体检时检测的常规生化指标从体检结果中获得。研究项目包括身高、体重、BMI(kg/m²)、血细胞计数、血清肌酐滴度、肾小球滤过率(GFR)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、白蛋白(ALB)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FPG)、血红蛋白A1c(HbA1c)。
(4)25(0H)D浓度的分类: 根据日本骨代谢学会、日本内分泌学会和日本骨质疏松学会的定义：血清25(0H)D<30ng/mL为维生素D不足，血清25(0H)D<20ng/mL为维生素D缺乏症。
(5)参考范围的计算:通过将浓度分布对数转换为正态分布，确定样本中25(0H)D的参考范围[95%置信区间(CI)]。由于维生素D的浓度会受到肝功能、血脂和糖尿病的影响，因此从体检结果中收集数据，并在GFR、ALT、γ-GT、ALB、LDL-C、TG、FPG、HbA1c、血红蛋白和血小板计数值均在日本临床实验室标准委员会（JCCLS）规定的通用参考范围内的病例中计算参考范围。
4. 统计学分析方法：采用Bland-Altman图进行CLAM/LC-MS/MS方法与CLEIA或ECLIA之间的—致性检验。通过Passing-Bablok方法计算描述这种相关性的方程。使用Bonferroni校正计算25(0H)D浓度与其他因素之间的相关性。采用t检验比较不同性别、季节和年龄组25(0H)D的平均值。为计算25(0H)D的参考范围，将数值的分布经过对数转换归一化，然后在3SD的范围内截断两次，以排除潜在病理条件导致的极端值。95%CI以参数方式计算，该区间的下限和上限进行反向转换。由于维生素D在阳光照射下由皮肤产生，因此血清浓度可能会随季节变化，为了确定这一潜在关系，我们分析了SD比值（SDR）。采用三水平嵌套方差分析(Nested ANOVA）比较不同地区、性别、年龄间检验结果的差异（SD）。SDR的计算方法是特定因素的SD与剩余SD（代表个体间的净变异）之比。SDR为>0.3被认为是显著的，当SDR值为>0.5时，根据典型建议进行分层。此外，参考先前关于自动化LC-MS/MS方法技术水平的研究，±4ng/mL的偏倚被设置为显著。使用StstFlex.ver7（Artec）和Stata/SE16.0（StataCorpLLC）进行统计分析。P值为<0.05被认为具有统计学意义。
二、结果
1. 验证CLAM/LC-MS/MS测量设备的性能：除了测定25(0H)D₂和25(0H)D₃的浓度外，还测定了25(0H)D₃和3-epi-25(0H)D₃的分离情况。25(0H)D₂和25（OH）D₃的峰被鉴定为稳定同位素标记的25(0H)D₂-d3和25(0H)D₃-d6的独立峰，洗脱时间约为2.0min。这些分子的分离证明了CLAM/LC-MS/MS测量的功能特异性。在对该技术准确度的分析中，在研究的整个浓度范围内，25(OH)D₂和25(OH)D₃的测量浓度介于已知浓度的96.5%和108%之间（表1）。25(0H)D₂和25(0H)D₃的操作者间和日间再现性的CV值分别为4.1%-8.5%和3.7%-8.0%，25(0H)D₂和25(0H)D₃的CV值分别为4.7%-7.0%和4.0%–6.9%（表2）。
通过与全自动免疫分析仪测定的总25(0H)D值进行比较，进一步验证CLAM/LC-MS/MS方法的结果。BIand-AItman图一致性检验结果如图1所示。对于CLEIA，平均差异为0.50ng/ml，95%—致性界限为-3.93~4.93mg/ml，2个样本（4%）超出了—致性界限（图1A）。对于ECLIA，平均差异为1.07ng/dI，95%—致性界限为-4.05~6.19ng/ml，4个样本（8%）超出了界限（图1B）。发现与CLEIA的相关性为r值为0.965（P<0.01），描述这种相关性的方程为y=1.088x-0.755（图1C）。发现与ECLIA的相关性为r值为0.949（P<0.01），描述这种相关性的方程为y=1.000x+0.850（图1D），未确定明显的系统误差。
2. 使用CLAM/LC-MS/MS方法对25(OH) D进行大规模筛查：方法验证后，使用CLAM/LC-MS/MS系统测定血清中25(0H)D₂和25(OH)D₃的浓度。
(1)参与者的基线特征：所有参加体检的参与者均知情同意，共检测了5,518名参与者（男性3,400名，女性2,118名）的25(0H)D水平。参与者的基线特征见表3。参与者的平均年龄和中位年龄分别为：男性50.6±13.2岁和51岁，女性45.6±14.7岁和47岁。男性糖尿病患病率（HbA1c>6.5%）和超重患病率（BMI>25）分别为7.24%和23.6%，女性分别为5.26%和22.0%，均低于全国平均水平（男性分别为19.7%和33%，女性分别为10.8%和22.3%）。
(2）25(0H)D的浓度：5,518份样本中有5,516份25(0H)D浓度低于检测限（5ng/mL）。仅2份样本检出25(0H)D₂，且均<10ng/ml，25(0H)D₃在所有血清样本中均可检测到。令人惊讶的是，5,396名参与者（98%）被归类为维生素D不足（1,092人，19.8%）或维生素D缺乏症（4,334人，78.5%）。25（0H）D浓度的均值和SD分别为15.5±5.96ng/ml。总25(0H)D浓度的分布呈对数正态分布（偏度：0.99；峰度：2.93）(见图2)。参考方法中描述的分类，79%的参与者被归类为维生素D不足，98%的参与者被归类为维生素D缺乏症。
(3）按年龄和性别划分的25(0H)D浓度分布：图3显示了各年龄组25(0H)D的95百分位数和中位数。25(0H)D浓度与年龄呈正相关（r=0.22，P<0.01）。每个年龄组中，男性的中位值都高于女性。
(4)参考范围的计算:通过对数转换将浓度分布(见图2)转换为正态分布(偏度：0.04；峰度：0.29)，确定样本中25(0H)D的参考范围(95%Cl)。女性、男性和整组的参考范围分别为7-30ng/ml、5-27ng/ml和6–29ng/ml(见图4)。女性的25(0H)D值明显低于男性(P<0.01)。由于维生素D的浓度会受到肝功能、血脂状况和糖尿病的影响，参考范围也根据1630个病例(29.5%)评估的，其中GFR、ALT、γ-GT、ALB、LDL-C、TG、FPG、HbA1c、Hb和PLT值均在JCCLS制定的常用参考范围内，该亚群参与者的参考范围为6-30ng/mL(数据未显示)。
(5)季节性波动：血清25(0H)D浓度的季节性波动如图5所示。9月份25(0H)D浓度最高(均值：17.8;95%Cl:8,30ng/ml)，1月份最低(平均13.1ng/ml; 95%Cl:5,26ng/ml)。9月与1月间25(0H)D浓度差异有统计学意义(P<50.001)。有趣的是，血清25(0H)D浓度的每月变化似乎与日照小时数无关，日照小时数在2月和5月最高，但它们与平均温度密切相关，平均温度在8月和9月最高，尽管无法进行统计分析。
(6）SDR的计算：通过计算SDR，确定了性别、年龄、采集月份和采集季节等因素对参考范围变异性的影响程度。性别、年龄、采集月份和采集季节的SDR指数分别为0.303、0.247、0.270和0.258。尽管认为性别之间的参考范围不同，但该SDR<0.5，性别范围的95%CI偏倚在±4以内，下限为±2，中位数为±3，上限为±3。因此，我们确定血清25(0H)D浓度的参考范围不需要根据这些因素进行分层，总体参考范围可用于所有参与者。
三、讨论
虽然对维生素D的临界值进行了充分研究，但由于缺乏在健康人群中进行的大规模筛查，这一营养素的参考范围尚未明确。本研究首次在日本城市地区的表观健康人群中计算了血清25(0H)D的参考浓度。该方法采用一种新型全自动LC-MS/MS方法CLAM/LC-MS/MS，实现了高通量和良好的准确度。具体而言，该方法的准确度误差<7.6%，达到了FDA提出的验证指南标准，即<15%。我们的研究发现，参考范围表明人群中许多个体的浓度低于全球推荐浓度（<20ng/ml）。
1. 东京居民的25(OH)D参考范围较低：目前很少有研究报道健康人血清中25(0H)D的参考浓度范围。然而，有几份报告确定了可用于比较的平均血清浓度。例如，在地中海人群中，25(0H)D的平均浓度和SD在男性中为19.48±9.51ng/mL，在女性中为18.01±9.01ng/ml。此外，一项关于美国的研究发现，25(0H)D的参考范围是9.4-49.6ng/ml，而另一项研究确定的值是6.0-43.5ng/ml。重要的是，25(0H)D的血清值因参与者的地理来源而异。在日本，先前一项针对20-69岁健康人群的研究报告称，平均血清25(0H)D₃浓度为20.5ng/ml。在另一项针对居住在日本西部城市地区的649名参与者的研究中，25(0H)D的中位数和四分位数间距分别为19.1ng/ml和14.7-24.5ng/ml，维生素D缺乏症的患病率为54.1%，尽管这些报告中没有提供参考范围。在针对患者的研究中，日本一项针对410例糖尿病和慢性肾脏病患者的研究中，25(0H)D的中位数和四分位数间距分别为23ng/dL和16-29ng/dl，但52例（13%）在服用活性维生素D。另一项针对63例神经性厌食症患者的研究报告，86%的血清25(0H)D浓度<30ng/dL。在本研究中，我们发现的血清25(0H)D浓度平均值和参考范围远低于所有这些研究报道的水平，而维生素D不足和缺乏的患病率高于所有这些研究报道的水平。
本研究中维生素D浓度较低的原因不太可能是地理条件。东京位于北纬36度，日照时间（2019小时/年）高于日本平均水平（1969小时/年）。东京的日照量和日照强度足以诱导形成足够的维生素D。具体而言，在东京，要在中午12:00从相当于脸部和双手手背（600cm²）的皮肤区域产生5.5μg，25(0H)D所需的日照时间，据估计7月为3.5min，12月为22.4min。因此，由于东京的日照量不太可能解释相对的维生素D缺乏症，观察到的低浓度的25(0H)D可能是由于典型的东京居民生活方式。首先，由于大多数体检的参与者都是办公室职员（数据未显示），他们接触的阳光可能比典型的日本公民要少。此外，我们的研究还表明，9月份的25(0H)D浓度与温度有很强的关系。这种相关性可能表明，服装在测试人群中观察到的25(0H)D浓度中是一个影响因素。具体来说，当参与者在天气温暖时穿着较轻的衣服时，阳光会更有效地增加25(0H)D浓度。因此，参与者中25(0H)D浓度低可能是由现代生活方式的各个方面来解释的，包括使用防晒霜和遮阳伞以及在室内度过的更多时间。值得注意的是，我们的研究表明，老年人的血清25(0H)D浓度相对较高，这可能是因为日本的退休人员倾向于在户外锻炼。
在欧洲国家和美国，人们通过补充剂积极摄入维生素D，常在食物中添加25(0H)D2；相应地，这些地区人群的25(0H)D₂浓度高于本研究的观察值。然而，在我们的研究中，大多数参与者的25(0H)D₂浓度不可测，这表明维生素D补充剂在日本并不流行。过去，日本人经常食用每100g含有12.7μg维生素D的香菇干。虽然香菇仍然很受欢迎，但最近食品运输的改进增加了生香菇的供应，而生香菇含有较少的维生素D。因此，日本城市地区营养习惯的改变和其他生活方式的改变可能是导致血清25(0H)D浓度低的原因。
2.需要计算不同时间和不同人群的参考范围：先前针对日本年轻人群的研究显示，2016年至2020年期间，平均25(0H)D浓度下降了约8.5ng/mL，这可能是由于COVID-19大流行期间生活方式的改变。这一结果强烈表明25(0H)D的参考范围会受到生活方式的影响。因此，即使在相同的人群中，血清25(0H)D浓度的大规模筛查也可能需要以标准化方式重复进行。然而，即使考虑到这些生活方式的改变，人们也惊讶地发现，目前人口中98%的人没有达到推荐的维生素D浓度，世界其他地区也偶尔会报道健康人群中维生素D缺乏症的高患病率，包括沙特阿拉伯（98.5%）、韩国（男性64%和女性77%）和伊拉克（56%）。甚至在新兵中也观察到如此高的患病率（47.7%的人维生素D缺乏症，31.6%的人维生素D不足），甚至有研究人员指出，世界上健康人群中维生素D缺乏症和不足的高患病率是由不合理的高血清25(0H)D cut-off值人为造成的。因此，评估25(0H)浓度≥30ng/mL是否与任何病理状态相关是很重要的。特别是，据报道，血清25(0H)D会随着内脏脂肪的增加而降低，在现代社会，越来越多的人体脂不足，参考范围可能会变得更低。因此，有必要对多种人群的维生素D参考浓度进行进一步研究，并通过标准化方法对维生素D浓度进行大规模筛查。除了25(0H)D浓度本身的差异外，维生素D其他代谢物的比例在不同人群中也可能不同。分析这些代谢物与人口统计学和临床特征的相关性可能有助于了解25(0H)D浓度的差异。例如，血清中24,25(0H)₂D与25(0H)D的比值变化可能是维生素D状态的更具体衡量指标，并且可能对人口统计学差异不太敏感，因为该比值能更准确地反映未与维生素D结合蛋白结合的游离25(0H)D的浓度。还需要进一步研究，以开发出高效、准确的同时测量这些代谢物的方法。
3. 应用全自动LC-MS/MS分析维生素D状态：它与传统方法（包括基于抗体的方法）相比，LC-MS/MS(尤其是自动化LC-MS/MS)，在阐明不同地区人群维生素D谱的差异方面具有以下优势：首先，从预处理到结果的整个过程都是自动化的，这大大缩短了测量时间；使用我们的方法，可以在5.5h内完成60次测试。这种高通量对于大规模筛查至关重要，而大规模筛查对于确定人群中的参考浓度至关重要。其次，LC-MS/MS方法在准确度和特异性方面表现出优势。以前的报告表明，免疫测定法不能用于定量高于20ng/mL的25(0H)D₂浓度，而更高浓度的化学物质可以通过LC-MS/MS准确测量。此外，LC-MS/MS方法可以完全分离和测定3-epi-25(0H)D₂和3-epi-25（0H）D₃。据报道，这两种结构相似的代谢物浓度的差异反映了炎症和婴儿维生素D状态等临床状况。之前的研究也显示了LC-MS/MS用于单独检测其他相关代谢物的潜力，如1-α25(0H)2D和24,25(0H)D2。鉴于对最近发现的维生素D代谢物测定的标准化程序的需求日益增加，这一能力尤其有益。此外，由于维生素D的代谢受到其他酶和激素状态的影响，因此测定其他小分子（包括醛固酮、雄烯二酮和其他类固醇）也很重要。因此，我们认为CLAM/LC-MS/MS系统有可能广泛应用于需要实时监测的多种临床问题。
4. 可能影响维生素D状况的其他因素：在我们的研究中，性别、年龄和一年中的时间被定为确定25(0H)D参考范围时要考虑的因素。特别是，我们发现性别方面的SDR超过了0.3，尽管这个SDR表明性别是一个潜在的影响因素，但数字明显<0.5，因此，我们得出结论，没有必要根据性别对参考范围进行分层，需要进一步分析以确定25(0H)D的差异是否由其他混杂因素引起（如体脂成分）。
5. 局限性：由于本研究的回顾性质，我们的研究存在一些局限性。最重要的是选择偏差，特别是，参加体检的人被认为更有健康意识。例如，在参与者中，男性和女性的超重率分别为22.6%和19.5%，低于日本平均人群（男性31.8%和女性21.6%）。由于较高BMI与较低维生素D浓度相关，这种选择偏差可能会影响本研究的结果。即便如此，结果显示25(0H)D的浓度远低于预期，这可能具有重大意义。此外，虽然这项研究的对象主要是健康人群，但体检的参与者可能包括一些患有癌症等严重疾病的人。我们通过排除某些项目的异常值进行了敏感性分析，但可能无法完全排除此类潜在的异常值。
结论：采用全自动LC-MS/MS系统对日本健康人群进行维生素D状况的大规模筛查，该系统可准确、快速地测定血清25(0H)D浓度。计算的平均浓度为15.5ng/mL，远低于既往报道的20.5ng/mL。人群在维生素D方面的营养状况似乎较差，这提示需要进一步的流行病学研究来阐明25(0H)D浓度较低的原因。利用大规模筛查来比较郊区居民或生活在不同纬度的人群之间的差异，将有助于这些研究。对其他维生素D相关代谢物的高通量测量对此类研究也很重要。对于这两项研究，自动化CLAM/LC-MS/MS系统将提供必要的速度和特异性。
编译节选自： 《The Journal of Nutrition>.Volume 153, Issue 4, April 2023, Pages 1253–1264
