化学发光法定量检测抗双链DNA抗体在系统性红斑狼疮临床诊疗与疾病监测中的价值
抗双链DNA(dsDNA)抗体是系统性红斑狼疮(SLE)的关键生物标志物。在临床诊疗中,dsDNA的定量检测在SLE的临床诊断、病情监测、治疗效果及预后评估中起到重要作用。
抗dsDNA抗体的检测方法经历了从传统的间接免疫荧光法(IIF)、放射免疫分析法(RIA)到酶联免疫吸附法(ELISA)、线性免疫分析法(LIA)以及化学发光免疫分析法(CLIA)的发展。这些方法各有优势,随着临床对于抗dsDNA抗体定量检测的需求日益增加,自动化取代手工、定量检测取代定性检测已成为抗dsDNA抗体临床检测趋势和未来发展的必然。化学发光法因其高灵敏度、高特异性及全定量的优势逐渐成为临床研究和临床诊疗应用的焦点[1]。
一、抗dsDNA抗体定量检测的意义
系统性红斑狼疮(SLE)是一种系统性自身免疫病,以全身多系统多脏器受累、反复的复发与缓解、体内存在大量自身抗体为主要临床特点,如不及时治疗,会造成受累脏器的不可逆损害,最终导致患者死亡。
抗dsDNA抗体是一组以细胞的双链DNA为靶抗原的自身抗体,主要出现于系统性红斑狼疮(SLE)患者的血清中,是SLE诊断、疾病分类和病情控制的重要实验室参数,其特异性高达95%[2]。由于抗dsDNA抗体的高度特异性,其在SLE临床诊断、病情评估中的价值被临床所重视,自1982年以来,抗dsDNA抗体已成为SLE的一些经典诊断和病原学标准。2012年,血清中高滴度抗dsDNA抗体伴有活检证实的狼疮性肾炎(LN)被接受作为系统性红斑狼疮国际合作诊所对SLE的独立分类标准被纳入SLE分类诊断中,且成为该疾病活动性临床监测的重要指标[3]。
1. 定量检测有助于疾病诊断:抗dsDNA抗体在2019年欧洲抗风湿联盟/美国风湿病学(EULAR/ACR)制定的SLE的分类标准权重达6分(得分≥10分即可分类为SLE)[4]。在2018年《抗核抗体检测的床应用专家共识》中明确指出,对SIE的疾病活动性进行监测时,应定期使用同种定量检测方法进行抗dsDNA抗体的检测[5]。
2. 定量检测有助于评估SLE疾病活动度及复发风险:2018年《抗核抗体检测的临床应用专家共识》[5] 以及2020年《自身抗体检测方法的推荐意见》[6]里均明确指出抗dsDNA抗体,其抗体滴度在多数SLE患者中与病情活动程度相关,可作为治疗监测和预后评价的指标,应定期监测。Lazarus等国外研究者发现,抗dsDNA抗体水平的升高通常先于系统性红斑狼疮的复发,因此定期定量检测抗dsDNA抗体对评估SLE患者的临床病情至关重要[7]。2021年的另一项国外研究进一步证实了抗dsDNA抗体水平与SLE疾病活动指数(SLEDAI)的关联,表明中重度SLE患者的抗dsDNA抗体滴度高于轻度患者,且药物治疗后抗体水平有所下降[8]。此外,药物治疗后,抗dsDNA抗体水平的显著下降也反映了药物的疗效[9]。这些研究结果表明,抗dsDNA抗体浓度的变化是评估SLE病情和治疗效果的重要指标,而这种变化的监测需要定量检测,定性检测无法提供足够的信息。
3. 定量检测可提示SLE受累器官损伤风险:抗dsDNA抗体与SLE患者的多个器官损伤相关,包括肾脏、大脑、皮肤和肝脏。研究发现,抗dsDNA抗体阳性患者中,高抗体水平者更易发展为狼疮肾炎,抗dsDNA抗体是狼疮肾炎活动的可靠指标,且多数肾损害患者抗体阳性,尤其是滴度较高者[10]。在中枢神经系统受累的SLE患者中,抗dsDNA抗体通过与NMDAR的NR2A和NR2B亚基交叉反应,增加神经元钙内流,导致兴奋毒性和细胞死亡。血脑屏障破坏可能使抗dsDNA抗体/抗NMDAR抗体进入中枢神经系统,引发神经元死亡和认知功能障碍。此外,抗dsDNA抗体阳性患者较阴性患者更易发生皮肤受累与肝损伤[11, 12]。
二、化学发光法定量检测是一种便捷、准确、自动化的方法
抗dsDNA抗体的检测方法经历了从传统的间接免疫荧光法(IIF)、放射免疫分析法(RIA)、线性免疫分析法(LIA)到酶联免疫吸附法(ELISA)以及化学发光免疫分析法(CLIA)的发展。放射免疫分析法由于放射问题已很少实验室在使用;间接免疫荧光法存在主观性强、需要专业培训人员、不能量化指标、周期长、抗原基片来源不一等不足,不利于标准化和质量控制;酶联免疫吸附法假阴性与假阳性较多、易受低亲和力抗体的干扰。化学发光法是在RIA和ELISA两种方法基础上改进的一种新方法,无放射性,兼具以上方法的优点,除了能定量检测外还具有更高的灵敏度及准确性,是抗dsDNA抗体理想检测方法。
1. 化学发光法结果更稳定:化学发光法包括直接化学发光、酶促化学发光、电化学发光免疫分析。该方法以纳米级磁珠包被抗原(抗体),患者血清与抗原形成复合物,并加各类型标记二抗,配以智能的软件系统实现全流程的自动化运行,通过记录、分析光子能从而计算抗体定量结果。全自动化操作减少人为操作误差,提高检测的重复性和可靠性,确保了从样本处理到结果输出的每一步都遵循严格的标准操作程序。
2. 化学发光法检测抗dsDNA抗体的技术创新:虽然化学发光法检测自身免疫性疾病指标发展起步较晚,但已在国内外研究及权威文件中也得到了广泛的认可与推荐。在BentowC等人的一项研究中将化学发光法与IIF进行比较,化学发光法显示出对自身免疫疾病很高的特异性,当以相同的特异性(95.1%)对两种测定法进行比较时,CLIA显示出更高的灵敏度(76.4%对68.5%)[13]。国内张立娟、罗宇维等人关于CLIA与IIF、ELISA对比分析研究结果显示,CLIA在ANA筛选、特异性抗体定量识别等方面与传统方法相当,甚至优于传统方法[14, 15]。
使用化学发光法检测抗dsDNA抗体的技术壁垒主要体现在如何在保持dsDNA分子结构完整性的前提下,实现其与磁微粒载体的有效标记和偶联。由于dsDNA(双链脱氧核糖核酸)是由两条互补的DNA单链构成的双螺旋结构,且其碱基对通过氢键连接,它并不像蛋白质那样具有可以直接修饰或标记的官能团。因此,要在不破坏dsDNA结构的情况下进行特异性和灵敏度均高的标记,需要创新的处理工艺和技术手段。技术创新的重点在于开发出可以稳定地将dsDNA固定在磁微粒上的方法,同时确保该过程不会影响dsDNA的天然构象及其与相应抗体的结合能力。这样的优化对于提高检测试剂盒的整体性能至关重要。突破这一技术壁垒后,化学发光法能够提供一种高度敏感和特异的方法来检测血清中的抗dsDNA抗体。这种改进不仅提升了检测的准确性,还可能减少假阳性和假阴性结果的发生率,从而为系统性红斑狼疮提供了更为可靠的诊断工具。在2020年《自身免疫病抗体检测方法的推荐意见》中推荐化学发光法作为抗dsDNA抗体的检测方法。
3. 化学发光法已逐渐成为抗dsDNA抗体检测趋势:据2019年国内1034家实验室参加卫生健康委员会临床检验中心抗ENA抗体能力验证项目室间质评数据以及同期全球507家实验室参加美国病理学家协会实验室抗ENA抗体能力验证项目室间质评数据显示,国内以定性为主(91.25%),国际以定量为主(92.2%)。包括抗dsDNA抗体在内的自身抗体以定性检测方法为主已不能满足临床的需求,定量的自身抗体检测结果已成为临床所需和发展趋势。近几年的抗dsDNA抗体室间质评数据显示,化学发光法的应用正在逐步增加,显示出逐步替换传统方法的趋势。截止到2024年第2次抗核抗体检测室间质量评价结果报告显示从2018年13家已经上升到501家实验室使用化学发光法上报,方法学占比由5.8%上升到24.2%。
三、化学发光法定量检测在其他自身抗体检测中的应用
化学发光技术正在推动抗dsDNA抗体检测从定性向定量、从人工或半自动操作向全自动化、以及从低标准向高标准的转变,这些转变极大地提高了检验结果的质量,为临床提供了更精确的诊断和治疗方案。除了抗dsDNA抗体检测,化学发光法也开始被应用于其他自身抗体的检测中。例如,2021年发布的《自身免疫性肝病相关自身抗体检测的临床应用专家共识》中,已经将CLIA纳入自身免疫性肝病抗体的检测,以补充IIF在某些抗体检测中缺乏特征性荧光模式的不足[16]。
我国自免疾病患者基数大但确诊率低,潜在市场空间大。受制于检测能力和诊断水平的限制,目前我国自身免疫疾病确诊率较低。据美国自免协会统计,美国自免患者占总人口比例达5%-8%,而目前我国自免疾病确诊人数仅约2000万人,确诊率仅约1.4%,潜在检测需求巨大。尽管自身抗体定量检测还面临一些挑战,但随着更多定量检测项目的推出、医改的深化以及国际临床免疫检测标准化工作的推进,自身抗体定量检测有望实现量值溯源和标准化,并得到广泛应用,进而推动风湿免疫学科的快速进步。
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供稿丨四川携光生物技术有限公司市场中心学术部