临床微生物诊断对长期门诊肠外抗微生物治疗患者临床护理质量的影响
【摘要】过临床准确的微生物学诊断有助于传染病(ID)专科医生对需要长期门诊肠外或口服抗微生物药物治疗的患者进行最佳护理。ID专科医生与临床微生物学实验室密切合作，进行常规或专门的分子检测，可以提高诊断的准确性，简化抗微生物药物治疗方案，改善患者预后。
【关键词】临床微生物学；基因测序；MALDI-TOF MS；门诊病人肠外抗生素治疗
临床准确的微生物学诊断与抗微生物药物管理一样，精准医学的目的也是在正确的时间为正确的患者提供正确的治疗，精准医学通常是指根据患者自身的基因特征进行治疗，但在感染性疾病（ID）中，微生物的分子特征可能对患者的临床结局产生重大影响，并常常决定抗微生物治疗。深部感染或慢性感染患者通常有多种并发症，需要复杂的手术和药物治疗。由于治疗失败，这些患者面临着长期住院和再次入院的风险。由ID专家（药剂师和医生）监督的长期门诊肠外抗微生物治疗（OPAT）或复杂门诊抗微生物治疗［包括口服或肠外治疗（COpAT）］是此类患者的常见治疗方式，然而，无论是口服还是肠外疗法，要优化选择最具针对性的治疗方案，都需要及时准确的微生物学诊断。例如，感染性心内膜炎（IE）是一种常见的OPAT诊断，但在工业化地区，约有10%的病例被归类为“血培养阴性”，原因可能是细菌的生长受到了先前抗生素的抑制，也可能是常规培养技术无法分离出微生物。因此，通过聚合酶链反应（PCR）测定或其他分子技术鉴定贝纳柯克斯体、巴尔通体属或惠普尔养障体，被作为一项新的主要标准加入2023年杜克-国际心血管感染性疾病学会IE标准中。
因此，这与临床微生物实验室密切合作，促进常规或专业检测，可最大限度地提高患者获得最佳治疗效果的可能性。然而，这种合作应该包括关于所提议的测试的可用性和成本的讨论。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）最为经济，其次是靶标特异性PCR检测。宽范围PCR和基因组测序仍然昂贵得多，因此尚未普及，但随着时间的推移，可能会像以前的技术（如，MALDI）一样变得更具成本效益。获得准确诊断以优化患者护理所带来的益处可能会证明专业检测的成本是合理的，而ID专科和微生物学的同事通常会通力合作，以实现最佳的患者治疗效果。在此，我们根据本机构的经验，采用虚拟的临床场景，提供ID专家和临床微生物实验室之间最佳合作的例子，以协助管理需要延长抗微生物治疗方案的诊断困难患者。总结了分子检测方案（见表1）以及对合作工作流程的建议（见图1）。
图1. 简化传染病-微生物学协作的建议工作流程
病例1：甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌菌血症和椎体骨髓炎，典型的OPAT病例
患者为一名68岁女性，2型糖尿病得到控制，体重指数35kg/m2，5年前因腰椎管狭窄症行L4-S1脊柱融合术，因严重腰痛、发热和心动过速到急诊科就诊，她否认最近有脊椎外伤或侵入性手术。检查发现她的下背部手术部位已经愈合，没有开放性伤口，但触摸手术部位周围的脊柱旁肌肉有压痛。采集两组血培养，开始经验性静脉注射万古霉素和哌拉西林/他唑巴坦。36h内，血培养产生成簇的革兰阳性球菌，这与葡萄球菌最一致，并通知了治疗团队。MRI显示椎间盘炎/骨髓炎和硬脊膜外脓肿，维持广谱抗生素治疗。在培养标记为阳性4h后，通过MALDI-TOF对阳性血培养肉汤进行微生物鉴定，鉴定出金黄色葡萄球菌。抗微生物药物敏感性试验结果为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）。告知了治疗团队，并咨询了ID，患者在住院第3天被转为静脉注射萘夫西林和口服利福平。患者立即接受了脊柱内固定物感染的冲洗和清创，硬膜外脓肿被清除，脊柱内固定物被保留以保持稳定。留置PICC导管，长期静脉注射头孢唑林和口服利福平，患者住院第10天出院。她对治疗方案的耐受性良好，静脉注射治疗结束后，她的临床症状和炎症指标均有所改善。
无论医疗环境如何，MSSA菌血症和椎体骨髓炎都是ID专科医生经常遇到的情况。在MSSA菌血症等严重感染中，ID咨询的参与可以挽救患者的生命，并确保患者得到适当的诊断和治疗管理，这一点已得到广泛认可。当前最佳实践建议表明，实验室应采用快速诊断方法从阳性血培养肉汤中鉴定微生物。使用MALDI-TOF MS可以实现快速鉴定，使用直接血培养瓶检测策略［如MALDI-TOF Sepsityper®试剂盒（如本文）］或者在高菌量接种物传代培养的快速短期孵育后鉴定，这些方法可以加快菌血症的适当管理，并有助于检测稀有和不常见的微生物。目前的最佳实践建议还推荐实验室使用快速诊断方法从阳性血培养肉汤中检测抗菌素耐药性。有几种方法可直接从阳性血培养瓶中快速评估金黄色葡萄球菌是否耐甲氧西林，以便根据情况及时升级或降级抗微生物治疗。快速鉴定血液中检测到的微生物及其相关的抗维生素药敏感性有助于进行适当的抗生素治疗，特别是当与报告中有关适当治疗和/或ID咨询的电子病历警报或评论“助推”相结合以优化管理时。其中可能包括生物膜活性剂，例如本病例中用于硬件相关感染的利福平。尽管利福平在葡萄球菌硬件感染中的作用仍未确定，但最近的一次专家综述仍支持使用利福平。
病例2：免疫功能低下和妊娠宿主的分枝杆菌感染
患者为一名30岁的女性，妊娠13周，有不确定结肠炎病史，接受英夫利昔单抗治疗2年，在英夫利昔单抗开始治疗之前，利福平治疗了4个月的潜伏性结核，表现为左侧第一近端指间关节4个月进行性疼痛和溃疡肿块。她出生在孟加拉国，13年前移民到纽约，目前与配偶和三个孩子居住在纽约。她是一名家庭主妇，有时做饭时需要清洗从当地市场购买的鱼并去除鱼鳞。体检发现左手食指的近端指间关节背侧有3cm×2cm的外生性病灶，周围有水疱，左前臂有压痛性皮下结节。穿刺活检的皮肤病理学报告显示，患者表皮有假上皮瘤样增生，肉芽组织明显发炎，提示有感染。过碘酸—希夫—淀粉酶染色、六胺银染色及细菌、真菌培养均为阴性，Fite染色和最初的分枝杆菌培养均为阴性。鉴于患者的临床表现、受损的免疫状态和接触史，ID团队要求对活检样本进行专门的外送检测。根据这一要求，临床微生物实验室协调了参考实验室对巴尔通体、利什曼原虫和非结核分枝杆菌的高级分子检测。一周后，通过直接PCR和hsp65和rpoB基因测序鉴定出了海洋分枝杆菌。患者开始接受阿奇霉素和乙胺丁醇双重治疗，并定期接受实验室和临床监测，以确保获得最佳治疗效果（COpAT）。在对她进行为期6周随访时，皮下淋巴结肿大基本消退，手指病灶也明显好转，手指病灶治愈后又接受了两个月的治疗，尽管长期接受英夫利昔单抗治疗，但未再发生感染复发。
细菌（包括分枝杆菌）和真菌的常规微生物学检测结果为阴性，这提示如果没有详细的暴露史，也没有与临床微生物实验室直接沟通，以协调针对特殊病原体的专门送检，则可能漏诊。确诊后，选择最佳抗微生物方案（考虑到患者的妊娠状况）并由ID专科医生进行密切的临床监测使患者的感染得到治愈。
病例3：患有多发性肺结节的器官移植候选者
患者一名60岁女性，患有2型糖尿病、终末期肾脏病，既往有30包年吸烟史，在接受肾脏移植手术之前，她接受了胸部计算机断层扫描(CT)以筛查肺癌。发现数不清的双侧肺结节，怀疑为转移性疾病。行右肺中下叶楔形切除术。病理结果显示恶性肿瘤阴性，但发现多发性坏死性肉芽肿伴有酵母形态，粘蛋白胭脂红和Fontana-Masson染色呈弱阳性，形态学提示隐球菌属。需氧和厌氧组织培养结果均为阴性，血清隐球菌抗原也是阴性。鉴于推定诊断为隐球菌肺炎，患者开始接受2周针对肾脏的氟康唑诱导治疗，随后接受巩固治疗，计划根据IDSA指南完成6-12个月。氟康唑开始用药后4个月和7个月时的胸部CT显示仅略有改善。鉴于放射影像学反应不理想、组织培养无生长、隐球菌血清抗原阴性，患者接受了其他检测。血清曲霉半乳甘露聚糖、血清（1-3）-β-D葡聚糖、球孢子菌血清学、尿组织胞浆菌抗原、重复血清隐球菌抗原均阴性。靶向18SrRNA基因、内部转录间隔区（ITS）1和ITS2的宽范围真菌PCR，然后进行隐球菌特异性基因扩增和测序，证实了新型隐球菌变种grubii的存在。所有其他真菌PCR检测结果均为阴性。
患者仍在接受氟康唑治疗，计划完成12个月的治疗，并定期接受实验室和临床监测，以确保最佳治疗效果（COPAT）。患者肺部持续结节被认为是瘢痕肉芽肿和先前感染的后遗症，而不是正在活动的真菌病。尽管粘蛋白胭脂红染色呈弱阳性，但常规真菌培养无生长，隐球菌抗原阴性，这促使ID专家采用先进的分子检测来确定诊断。确认性PCR检测有助于避免抗真菌药物不必要地扩大到更昂贵或毒性更强的药物，例如泊沙康唑或两性霉素。诊断确认也将治疗持续时间限制为12个月，而不是更长或可能无限期的抗真菌治疗疗程。
病例4：“培养阴性”假体周围感染（PJI）
患者一名70岁的男性因反复出现PJI而到急诊科就诊，他有糖尿病和高血压病史，曾在一家外院接受过左侧全膝关节置换术，术后并发了耐甲氧西林路邓葡萄球菌（MRSL）引起的PJI，对假体进行了剥离，放置了万古霉素/托布霉素垫片，以及在外院接受6周的万古霉素静脉注射。患者伤口愈合延迟，有持续感染的可能，因此被转到我们的医疗中心进行反复冲洗和清创，并更换了万古霉素/妥布霉素垫片，组织培养显示大肠埃希菌（仅对氨苄青霉素和氨苄西林/舒巴坦耐药）。咨询ID团队推荐了为期6周的大剂量静脉注射头孢曲松。治疗结束后，患者的临床症状有所改善，炎症指标也适当下降。在停用抗生素后进行的滑液培养结果为阴性。随后，他再次接受了全膝关节置换术，所有组织培养结果均为阴性。不幸的是，4个月后，患者的左膝再次出现疼痛和肿胀，炎症指标升高。膝关节X光片显示假体松动。他被带到手术室进行化脓性积液清创、取出松动的股骨假体、更换聚乙烯内衬和放置抗生素浸渍珠。尽管病理显示大量中性粒细胞提示感染，但组织培养均为阴性。患者最初接受了万古霉素和哌拉西林/他唑巴坦静脉注射治疗，但出现了急性肾损伤，住院时间延长了1周。由于无法通过常规技术进行微生物诊断，滑膜组织被送往华盛顿大学分子微生物学参考实验室进行细菌、真菌或抗酸杆菌（AFB）的宽范围PCR和下一代测序（NGS）。结果显示，咽峡炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和白色念珠菌的含量较低。在患者每日大剂量头孢曲松的治疗方案中添加了每日口服大剂量氟康唑。患者完成了为期8周的静脉注射头孢曲松/口服氟康唑治疗后，转为长期口服抗生素抑制治疗；6个月后，患者恢复良好。
本病例强调了密切监测以评估治疗反应和确定检测到的微生物的临床意义的重要性。此外，向住院ID顾问和微生物学实验室反馈患者的临床进展是提高我们对专业检测最佳作用的集体理解的关键（见图1）。这与IE一样，PJI是一种常见的OPAT诊断，由于之前的抗微生物治疗、诊断方法使用不足或存在苛养微生物，5-35%的病例表现为培养阴性。经过改进的培养方法（如，通过超声处理提高植入物表面生物膜的培养率以及在血液培养瓶中进行组织培养）提高了微生物的培养率，但仍有一些病例的微生物培养结果为阴性。多重PCR检测采用预定义靶标，因此并非所有病原体都能检测到。NGS越来越多地用于PJI诊断，但其作为前期诊断的临床用途尚未明确。鸟枪法宏基因组下一代测序（mNGS）可以鉴定出培养无法检出的病原体，但复杂且成本高昂。基于16SrRNA基因的靶向宏基因组下一代测序（tNGS）在培养阴性的PJI微生物检测方面与超声液体的mNGS 性能相似，但具有周转时间短、成本低和数据分析简便等优点。
在此例中，先进的分子检测显示多种微生物（包括白色念珠菌），因此需要加用抗真菌药，还检测到多种意义不明的细菌（如拟杆菌门的细菌）。测序技术高度敏感，低浓度的微生物DNA很容易检测到。微生物DNA可以来自样本中的病原体，也可以来自样本采集过程中引入的病原体（来自患者的正常微生物群、采集样本的医护人员的正常微生物群、用于样本采集的设备和容器、实验室或实验室中进行检测的人员的正常微生物群、试剂等）。在某些情况下，将污染物与真正的病原体区分开来可能会带来挑战。在本病例中，很难覆盖所有检测到的微生物，而且由于同时使用多种抗微生物药物，可能会导致患者反复出现急性肾损伤。由于检测到的微生物可能是污染物，也可能是真正的病原体，因此需要对微生物检测结果（无论是培养还是分子检测）进行仔细解读。通过评估检测到的微生物量以及是否在多个样本中检测到微生物，可以确定检测到的微生物的临床意义。临床团队和检测实验室之间的直接沟通可能会有所帮助。
结论：ID专家与临床微生物实验室之间的紧密合作可以有效改善对OPAT患者的护理，具体措施包括：加快患者接受适当抗微生物药物治疗的时间，促进早期降级为最有效、最有针对性的长期口服或静脉注射治疗方案，在某些情况下，还可以升级治疗方案以涵盖以前未知的病原体。当常规检测无法得出微生物学诊断或患者被标记为“培养阴性”感染时，这种合作关系有助于寻求先进的检测方法，包括基于测序的检测，这通常导致采用更广泛的治疗方案。然而，没有什么测试是完美的，如果相关结果的临床意义不明确或检测产生了意外结果，理想情况下应与进行高级检测的微生物学家一起进行检测解读。确证性检测可包括进行微生物特异性PCR检测或血清学检测。鼓励ID专家与进行检测的微生物学家联系，反之亦然。
在本文中，我们提供了几个ID专家和临床微生物实验室合作的例子，这些例子是为了加强需要长期抗微生物治疗的复杂感染的诊断和抗微生物药物管理，从而优化患者结局，ID与临床微生物学的有效合作可以为OPAT患者群体带来“精准医疗”。
编译节选自：Ther Adv Infect Dis. 2023 Oct 12;10:20499361231205092.
