高敏心脏肌钙蛋白检测 用于管理慢性心血管疾病患者

众所周知，心脏肌钙蛋白用于诊断急性心肌梗死（AMI）、有症状患者的风险分层，对于确定梗死面积以及非急性冠脉综合征（肾衰、心衰、肺栓塞PE、败血症等）患者的风险分层也具有一定价值。本文讨论了无症状患者的风险评估和使用高敏肌钙蛋白的分析问题。

我们都很清楚ACS患者需要测量哪些标志物，问题是这些标志物是否适用于无症状疾病的患者，我们甚至不知道哪些标志物存在于健康个体中。现在可以说每个人体内都有肌钙蛋白，但是十年前讲者还不能这样确定，那个时候讲者们还没有可以检测肌钙蛋白的试验。

已知缺血性损伤发生后肌钙蛋白复合物（cTnT-I-C）以及游离细胞溶质肌钙蛋白T和I（cTnT/cTnI）会释放。不可逆心肌过程发生后最初会释放游离cTnT和cTnI。游离cTnI具有高粘性、疏水性。虽然讲者没有直接证据，但是讲者认为游离cTnI不会大量存在于循环血液中，而是与其他蛋白结合，或与cTnC具有完全相同亚基的骨骼肌肌钙蛋白（sTnC）结合形成cTnI-C复合物（血液中的主要形式）。有些cTnI来自于cTnT-I-C降解。因此，缺血性损伤、心肌损伤发生后游离cTnT、cTnI-C和cTnT-I-C释放到血液循环中，然后发生进一步降解。这是一个非常复杂的分析过程。

多年前讲者曾假设可逆损伤也许释放肌钙蛋白，或者肌钙蛋白在正常情况下也会释放，比如细胞更新、心脏重构。在过去几年里讲者和Peter E. Hickman、Julia M. Potter发表了另外一些概念来证明这一假设。

当前大多数人认为心脏肌钙蛋白只有在心肌细胞发生不可逆损伤时才会释放（图1）。不可逆损伤发生后最初释放游离肌钙蛋白复合物，其分子量低，甚至低于CK-MB、略高于肌红蛋白。初步释放取决于所有成分的大小。第二阶段释放降解产生的肌钙蛋白，所以才会出现肌钙蛋白长期升高，并不是因为肌钙蛋白在血液循环中保留那么长时间。很多年前，研究显示肌钙蛋白的半衰期只有90分钟。那么我们如何解释在急性心脏事件发生后7、8或9天后肌钙蛋白仍然显示阳性？那是因为结构性分解造成的。我们不相信这会发生在可逆损伤中，心肌细胞不可能漂浮在血液中。  

为什么说肌钙蛋白也许在可逆损伤中释放呢？这个概念是说在整个过程中细胞膜保持完整，也许有些裂缝。支持这一假设的其他数据是膜泡形成（图2）。在心肌缺血以及其他组织尤其是肝脏发生缺血性损伤时细胞膜突起产生膜泡。游离肌钙蛋白通过膜泡运输释放到血液循环中时细胞膜可能不会破裂。游离肌钙蛋白一旦到达血液中，很快分解。从而解释了为什么有些患者的肌钙蛋白快速升高后又下降，却没有出现第二次增加。如果这在可逆损伤中是真的，那么其他的肌钙蛋白复合物去哪里了呢？也许本来就没有那些肌钙蛋白复合物。

在低氧环境下培养兔心肌细胞25分钟后，细胞表面无明显变化。但是，在40分钟和90分钟后，细胞表面出现了很多膜泡（图3A）。在缺氧环境下，30分钟内人心肌细胞的突起变化如图3B所示。

图1：不可逆损伤释放肌钙蛋白的过程

图2：可逆损伤释放肌钙蛋白的过程

图3A：兔心肌细胞培养，心肌缺血的不同阶段

图3B：人心肌细胞培养

在没有急性心肌缺血的情况下肌钙蛋白的释放机制是什么？肌钙蛋白在健康个体与缺血患者中的释放机制可能不同，是因为细胞凋亡，膜泡形成，游离复合物，还是亚基？我们真的不知道。这属于生化研究的领域。

Duolink技术，能够在一项实验中通过组织化学方法检查多个表位，因此可以目视观察到健康组织、缺血组织和心肌组织是否存在游离肌钙蛋白，肌钙蛋白复合物，T和I表位。我们试图获得这方面的支持证据，试图更多地了解损伤部位或程度，也许下一次我们能够提供更多数据。

第一代肌钙蛋白检测在20年前出现，实际上没有比CK-MB好很多，性能几乎相同。第二代肌钙蛋白检测问世时就出现了一些问题。FDA提出的问题在于现在检测的心肌损伤不一定是由于心肌梗死导致的。由于肌钙蛋白检测对AMI的特异性变低，不足以与像CK-MB这样的同类检测比较，所以FDA提高了肌钙蛋白检测的认可标准。我们可能看到肌钙蛋白阳性，但是CK-MB阴性，反之亦然。现在都知道肌钙蛋白阴性，CK-MB阳性表示存在骨骼肌损伤问题。如果肌钙蛋白阳性，CK-MB阴性，该如何确定最终诊断？这就是为什么FDA如此强调判定（adjudication）的原因。需要分开判定这些情况。大家知道肌钙蛋白阳性可以区分缺血性事件与非特异性心脏损伤。有了高敏肌钙蛋白检测，能够筛选出更多病例，并不全是心肌梗死。在美国或欧洲等世界上的其他国家，高敏肌钙蛋白检测不仅可以鉴别坏死或显微坏死，如果我们相信心脏可以自发性损伤然后自愈，也许还可以鉴别心肌缺血（图4）。更重要的是，我们现在可以测量健康个体的肌钙蛋白水平。他们没有发生缺血性损伤，可能只是细胞凋亡、正常细胞更新。我们仍然不知道将测量什么形式的肌钙蛋白。在未来，也许要考虑健康组织释放什么。下一代肌钙蛋白检测可以特异性靶定健康状态下释放的表位，可能与病态下释放的表位迥然不同。讲者个人认为这个表位不会是cTnI-C结合复合物，可能是与其他蛋白结合的肌钙蛋白分子，也可能是某一个片断。经过努力，实验室有机会改善肌钙蛋白检测。

图4：在AMI进展过程中肌钙蛋白检测的灵敏度

我们以前看到的只是冰山一角。更灵敏的心脏肌钙蛋白检测能够发现低敏检测无法鉴别的更早期症状和更早病理生理过程，从而使其用途从诊断大面积心肌梗死（图5上部）扩展到筛查普通人群的无症状个体（图5底部）。20年前并没有高敏心脏肌钙蛋白检测这条潜水艇，不能看到冰山下面的这些疾病。现在有了，就能鉴别出更多疾病了。这到底是我们希望看到的，还是希望避免的？讲者认为需要看到这些疾病，需要理解这些疾病，只有这样才能知道该怎么做。

图5：高敏肌钙蛋白——检测到淹没的证据

到底什么是第一代、第二代高敏肌钙蛋白检测？现在有很多不同的术语，有些是商业用语，有些是行销用语。不幸的是，讲者内心也没有答案。我们没有分析意义上的定义，也就是标准化，是因为无法直接比较这些检测。所以，Fred建议用可以检测的健康人群第99百分位值来代替（表1、表2）。如果第99百分位值以下的可测量正常值小于50%，则被称之为当代检测，讲者戏称为恐怖检测，是在20世纪使用的。现在是21世纪了，我们要使用下一代也就是第一代检测，其第99百分位值以下的可测量正常值达到50-75%。欧洲领先于美国应用了高敏肌钙蛋白检测。但是，这受到人群偏移的限制，所以要标准化正常范围的测定过程。我们团队提出了从健康个体收集足够的血液，建立全世界健康血清库的想法。FDA也认为对同一患者群体进行正常范围研究是个不错的建议。

表1、肌钙蛋白检测的记分卡等级

另一项研究显示，在大约2992名患者中，使用传统灵敏度肌钙蛋白检测得出2941名患者（88%）的测量结果都低于检测限（LOD），所以它不是讲者们在初级护理中可以使用的检测。

一方面，目前每个人都需要采取第99百分位值作为临界值，如果没有采用，就是不符合规定。另一方面，希望将来能够摒弃这个限制，事实上应该使用个体的基线值作为正常范围，而不是拿自己与别人比较。理由是，个体之间的肌钙蛋白存在生物学变异。在个体内，即使在数周或数月内，肌钙蛋白变化不大。个体间的情况就不同了，差异可能达到5倍。

用超高敏肌钙蛋白检测得出12名个体的生物变异图（图6A），每段线表示不同个体在数月内的肌钙蛋白范围，中间的点代表均值。个体7的正常结果是1ng/L，而个体9的正常结果则是5ng/L，差异显著。如果使用基于人群的正常范围，那么第99百分位的临界值就是0-5.5ng/L。

但是，问题在于，以个体5为例（图6B），其基线肌钙蛋白为1ng/L，发生心脏缺血事件后肌钙蛋白为5ng/L（T=0），但仍然在第99百分位范围内。世界上的任何医生都可能会说在T=25分钟时再检查一次肌钙蛋白，或者根本不检查第二次就让病人回家了。与患者基线值相比，该数值已经增加到5倍了。这种情况需要注意，因为可能在一个半小时后肌钙蛋白就达到了10或12 ng/L，已经是心肌缺血了，但是没有人知道。所以，讲者希望在未来检测能够实现标准化，具有相同的分析灵敏度，使用自己的基线，这在初级护理也很重要。未来就应该这样使用正常范围，但是实验室知道现在还没有实现检测标准化，所以还只是个想法。

关于相对变化与绝对变化的标准是什么，只是在急性心脏损伤的基础上进行了研究，尚未进入到初级护理。例如，相对变化是指数值为原来的2倍或3倍，表明临床显著升高。

表2、个别肌钙蛋白检测的记分卡等级

 图6A：个体肌钙蛋白的生物学变异        

                           图6B：肌钙蛋白正常范围内的动态变化

2009年CAP的cTnI研究显示最低和最高灵敏度的肌钙蛋白检测之间的差异为20倍。而2013年CAP的cTnI研究显示两者之间的差异缩小了，但仍有10倍之大（图7）。所以，cTnI检测缺少标准化。部分原因是因为某些检测具有 2、3或4个抗体，分别识别肌钙蛋白分子的不同表位（比如41-49，24-40）。除非不同厂商使用统一的抗体配对，否则无法达到完全标准化。

图7：cTnI检测缺少标准化

表3

生化项目的溯源性是从患者结果到常规检测程序，再到参考方法，最后达到标准化。国际临床化学联合会对心脏肌钙蛋白的标准化过程做了很多努力。他们采用在生物标本范围之内可以互换的抗体配对，建立了一种非营利的二级参考方法。换句话说，血清具有基质效应。用标准物质检测样品通常得到不一致结果，称之为不可互换性。他们试图通过研究发现在不同类型真实样品之间可互换的抗体配对，从而建立一个标准参考试验，不是一级参考试验，而是二级参考试验。然后实验室可以比较该标准参考试验与市售试验，希望将厂商结果之间的10倍差异降低到1倍差异。

如果实现了这一目标，也许未来实验室可以将临床数据编码在芯片上，然后附在驾驶证上。现在可以对药物基因组学检测、胆固醇检测这样做，为什么不对心脏标志物这样做呢？

图8：溯源性

有趣的数据表明有可以用高敏肌钙蛋白检测睡眠呼吸暂停患者是否患有心肌缺血。另外，AHA 2012年会上O’Malley等人表示他们利用高敏肌钙蛋白随机对肌钙蛋白值低的人服用80mg阿托伐他汀与40mg普伐他汀，KM事件率无显著差异；但是在肌钙蛋白值高时，KM事件率差异较大。该数据表明如果患者存在心肌损伤，不可过量使用药物或应该采用不同的他汀类药物，但仍需前瞻性临床试验证明。目前，快速检测（POCT）存在很多问题，很多POCT的肌钙蛋白灵敏度不高。FDA批准的最先进POCT仍属于传统灵敏度检测。

图9：高剂量他汀类研究

有些技术可以提高检测的分析灵敏度，包括微流体、纳米技术、红外线技术、表面等离子体共振和磁阻传感器。微流体是至关重要的技术之一，涉及可以控制的被动横向流动，移动液体、废物和试剂必须的不同阶段。采用纳米技术可以使设备的表面积与体积比达到最大。目视检测不再足够，需要新型检测体系，像红外线检测技术。新型红外线技术的优势在于血液中存在的很多荧光光谱都位于紫外线区（UV），可能在可见区。药物、片剂都在UV区，不在近红外光谱（NIR）区。表面等离子体共振，不需要报道分子就可以测量抗原抗体结合。

比较美国与世界上其他国家的高敏肌钙蛋白检测，美国稍微落后。Giannitsis Katus认为，虽然美国仍努力引进高敏肌钙蛋白检测用于诊断心肌梗死，但是累计数据表明了高敏肌钙蛋白检测的用处在于预测CV风险和慢性心脏病死亡风险。

2014年4月25日，临床检验专家（Fred Apple, Alan Wu, Judd Hollander, Allan Jaffe）与FDA共同讨论了如下问题：样品量；高敏肌钙蛋白的临床适应证是以心肌损伤为基础的，不能辅助诊断AMI；建立全世界健康血清库；用ng/L作为报告单位等。

多标志物分析策略可能对初级护理有用。本文只讲到了肌钙蛋白，但是临床上还有胆固醇、脑钠肽、C反应蛋白、Lp(a)、GDF-15。数年前急性心脏病就有这些标志物了，也许现在初级护理应用的标志物更多了。

图10：多标志物分析策略

20年来，肌钙蛋白检测得到了显著改善。所有国际指南都使用肌钙蛋白作为生物标志物来诊断ACS并对其进行风险分层。肌钙蛋白检测最好使用健康人群的第99百分位值作为临界值。但是，生物学变异研究显示个体内设定值更恰当，但是这需要检测标准化。高敏肌钙蛋白对初级护理可能有用。

来源：2014AACC年会

编译：王小茜