宏基因组检测临床案例两则
一、肺部细菌真菌混合感染案例
病史摘要：男性患者，49岁，因“四肢皮肤肿硬7月余”入院。患者自诉于7月前四肢皮肤开始变肿变硬，伴有双手遇冷变白变紫，多关节疼痛，主要以颈部、双肩、肘腕关节、掌指关节、踝关节疼痛，活动可，有胸闷，活动后加重，伴有进食困难，无明显口干、眼干，无病理性脱发，到当地医院就诊，考虑风湿免疫性疾病，治疗不详，病情未见明显缓解，于外院就诊，考虑系统性硬化症，给予激素醋酸泼尼松龙4片bid，吗替麦考酚酯0.5g bid，雷公藤多苷2片tid，硫酸羟氯喹片2片bid等治疗，症状稍有缓解，两周后激素逐渐减量，目前口服激素3.5片qd，同时按原剂量MMF+TW+HCQ等治疗。患者此次就诊自诉2月前感胸闷、气促、乏力加重，2天前无明显诱因开始发热、腹泻，最高体温38℃，无寒战，水样大便，5次/日，间有咳嗽、咳痰，四肢皮肤肿硬、关节疼痛如前，门诊拟诊“系统性硬化症”，此次发病以来，患者精神、胃纳欠佳，小便无特殊，水样大便，近期体重未见明显增减。患者平素健康状况一般，于2018年行扁桃体摘除术。
体格检查：双肺呼吸音粗，未闻及明显湿性啰音，心率149次/分，律齐，未闻及病理性杂音。双下肢足背中度凹陷性水肿，四肢皮肤肿硬，双手指端皮温低，双侧近端指间关节背侧溃疡，肌力、肌张力下降。
生化检验：B型钠尿肽前体＜20pg/ml。血常规示：白细胞数19.26*10˄9/L，中性粒细胞百分数82.3%，血沉49mm/h；C反应蛋白（CRP）405.00mg/L；PCT 0.15µg/L。
免疫检验：免疫球蛋白A 0.89g/L，免疫球蛋白G 6.31g/L，K-轻链4.35g/l。
CT示：1. 两肺感染；2. 右肺中叶类结节影，炎性病变可能；3. 两肺间质性改变；4. 心包积液；5. 纵膈淋巴结增大，左肺门影增大；6. 双侧胸膜增厚；7. 脂肪肝。
结合患者病史，体格检查及实验室检查结果，拟诊“1. 系统性硬化症；2. 间质性肺病；3. 重症肺炎；4. 低蛋白血症；5. I型呼吸衰竭”。予甲强龙20mg治疗原发病，加强补液支持治疗。
宏基因组检测结果：为明确感染病原体，取患者肺泡灌洗液进行PDC-SeqTM病原微生物宏基因组检测（DNA+RNA），结果如下：
耶氏肺孢子菌：在自然界广泛存在的真菌，也可存在于人的肺组织内；机体吸入空气中的肺孢子菌包囊感染，转为滋养体，寄生在肺泡上皮细胞和肺泡间隔内。大多隐形感染，机体免疫力下降时转为显性感染，引起耶氏肺孢子菌肺炎。肺孢子菌肺炎是由肺孢子菌引起的间质性浆细胞性肺炎，为条件性肺部感染性疾病。近些年随着免疫抑制剂的应用，肿瘤化疗的普及，以及HIV感染率的上升，该病的发病率也随之上升。该病的潜伏期为4～8周。流行性婴儿型（经典型）流行于育婴机构。起病缓慢，先有厌食、腹泻、低热，以后逐渐出现咳嗽，呼吸困难，症状呈进行性加重，未经治疗病死率为20%～50%。儿童-成人型（现代型）起病较急，开始时干咳，迅速出现高热、气促、发绀，肺部体征甚少，可有肝脾肿大。该患者因拟诊“系统性硬化症”而长期应用激素治疗，使患者的免疫功能受到影响，对耶氏肺孢子菌易感。
奶牛乳房炎性诺卡氏菌：革兰氏阳性菌，广泛存在于环境中，可导致人和奶牛的诺卡氏菌病，引起肺部、皮肤、脑部化脓性感染及心内膜炎、败血症等。诺卡氏菌感染并不常见，多发生在免疫功能障碍或合并其他进行性疾病的患者，如长期应用糖皮质类激素、免疫抑制剂、广谱抗生素和2型糖尿病等免疫功能低下的患者，肺部是诺卡氏菌感染最常见的部位。诺卡氏菌病为诺卡氏菌引起的一种人兽共患的传染病，多数为亚急性或慢性化脓性，少数为肉芽肿性疾病，可侵袭皮肤和内脏，发生局部和全身感染，引起多种临床表现：1）肺部感染，即肺诺卡氏菌病，呈急性或亚急性起病。表现为小叶性或大叶性肺炎，以后趋向于慢性病程，可类似肺结核病表现。咳嗽，开始为干咳，无痰，继而产生黏脓性痰，也可在痰中带血；若有空洞形成，可有大量咯血。常伴有发热、盗汗、胸痛、消瘦、全身不适，体温在38℃～40℃之间；2）脑部感染，即脑诺卡氏菌病，1/3病例有中枢神经系统受侵袭，多由肺部病灶迁徙而来，少数亦可为原发性。侵袭脑膜引起脑膜炎，侵袭脑实质形成多发性脓肿，亦可以相互融合成大的脓肿，出现脑膜刺激症状或脑占位性病变；3）播散性感染，播散性诺卡氏菌病常由肺部病变开始血行播散到全身。肾脏是继脑以后较常见受累的部位，同时可发生心内膜炎、心肌炎和心包炎。肝、脾、肾上腺、胃肠、淋巴结以及肋骨、股骨、椎骨、骨盆和关节亦可受累；4）皮肤感染，皮肤诺卡菌病常由植物损伤皮肤后引起病原菌侵入而发病，亦可由肺部病变扩展而来，可呈链状排列的皮下结节群出现于臂部，表现为孢子丝菌病样诺卡氏菌病，也可表现为脓肿及慢性瘘管或疣状损害，类似皮肤结核，部分患者可发生广泛的水疱性皮疹，部分患者可发生坏疽性皮肤诺卡氏菌病，其表现开始为疼痛的皮下结节，表面皮肤潮红，以后迅速扩展并溃破，溃疡边缘不规则，并向内陷入，溃疡表面有黏滞的黄白色脓液。该患者出现四肢皮肤变肿变硬，遇冷变白变紫，双侧近端指间关节背侧溃疡，与诺卡氏菌病的皮肤感染症状相符合。治疗主要分为局部治疗和药物治疗，局部治疗主要针对皮肤脓肿、脑脓肿、脓胸等，可辅以切开排脓及切除坏死组织。药物治疗首选磺胺类药物。常用磺胺嘧啶，至少用到全部症状和体征消失6周以后。有迁徙性脓肿或免疫功能低下的患者，应连续治疗1年，以防止潜在病变复发。联合甲氧苄啶（TMP）可提高疗效。其他磺胺类药物如磺胺噻唑（ST），亦有良好疗效。也可将磺胺类药物与氨苄青霉素联合使用。若对磺胺类过敏或出现难治性感染，可用丁胺卡那霉素、四环素、亚胺培南、头孢曲松、头孢噻肟。急性期可加用链霉素。脑部感染者可加用环丝氨酸。
二、立克次体感染案例
病史摘要：女性患者，26岁，因“发热10天”就诊于当地诊所，体温38°C左右，予输液治疗后体温可恢复至正常，具体诊疗不详。2天后再次出现发热伴呕吐，当地诊所查血常规示：白细胞数4.41*10˄9/L，中性粒细胞百分数74.0%，淋巴细胞百分数19.3%；血小板数72*10˄9/L；超敏C反应蛋白（CRP）34mg/L；肺炎支原体抗体IgM阴性。先后予舒普深及美罗培南抗感染治疗；2天后复查血常规示：白细胞数5.05*10˄9/L，中性粒细胞百分数84.3%，淋巴细胞百分数9.8%，血红蛋白110g/L，血小板数50*10˄9/L；超敏C反应蛋白（CRP）56.6mg/L；抗核抗体谱阴性；胸平片无异常，腹部CT示：1. 子宫后壁低密度灶，子宫内膜移位？2. 脾脏增大，盆腔积液。住院期间体温最高达39.9℃，次日出现胸闷气急症状，予以吸氧治疗后好转。患者仍有反复发热伴咳嗽不适，为求进一步治疗而转院。急诊查血常规示：白细胞数10.6*10˄9/L，血红蛋白110g/L，血小板数60*10˄9/L，中性粒细胞百分数83.4%；谷丙转氨酶106U/L，谷草转氨酶142U/L，碱性磷酸酶111U/L，谷氨酰转肽酶74U/L，白蛋白29.2g/L；超敏C反应蛋白（CRP）46.3mg/L；PCT0.50µg/L。胸部CT示：两侧胸水，少量心包积液，两肺间质为主水肿，左肺为主多发斑片渗出或伴炎症；右肺数个结节。拟诊“肺炎”收入院，予补液、莫西沙星0.4g/d静脉滴注抗感染、护肝治疗。既往有腰椎间盘突出，术后5年。
检测结果：为明确感染病原体，取患者肺泡灌洗液进行PDC-SeqTM病原微生物宏基因组检测（DNA+RNA），结果如下：
经追问，患者自诉曾于2周前去厦门旅行，行走于森林中。结合患者的经历及临床症状、血常规及影像学检查结果，我们认为恙虫病立克次体为导致患者此次反复发热的致病病原体。立克次氏体（Rickettsia）为革兰阴性菌，是一类专性寄生于真核细胞内的原核生物，是介于细菌与病毒之间，而接近于细菌的一类原核生物。一般呈球状或杆状,是专性细胞内寄生物，主要寄生于节肢动物，有的会通过蚤、虱、蜱、螨传入人体、如斑疹伤寒、战壕热。恙虫病立克次体：是恙虫病（丛林斑疹伤寒）的病原体。本病首先在日本发现，目前，我国东南沿海地区和台湾省也有病例报告。在日本，病人的死亡率约有60%。这种病原体由恙螨叮咬侵入人体，随血液扩散至血管内皮细胞中生长，发病。临床特征为发热、虫咬溃疡或焦痂、皮疹及淋巴结肿大血清变形杆菌OX凝集试验阳性。该病多发生于亚洲太平洋地区,其中以东南亚为主要流行区，在中国常见于浙江、福建、台湾、广东、广西、云南、贵州、四川等省、自治区，以沿海岛屿多发。该病为一种自然疫源性疾病，病原体存在于啮齿类及食虫类动物体内，其中鼠类是主要传染源。恙螨为传染媒介。在自然界，鼠与恙螨之间有恙虫病立克次体的感染循环，立克次体在恙螨体内可经卵传代，人被恙螨叮咬而发病。人对此病普遍易感，野外工作者及青壮年发病率高。该病有明显季节性，在中国南方各省夏秋季发病率最高，6～9月为高峰。
恙虫病的初发症状与流行性感冒、肺部感染相似，难以确诊。故仔细查看患者体表有无“焦痂”或虫咬溃疡，以及详细询问患者近期是否有野外活动史，对于明确诊断亦十分重要。疑似恙虫病的临床表现：1）持续高热，β-内酰胺类抗生素治疗无效；2）持续高热，出现不规则形状的皮疹；3）有白细胞减少倾向；4）C反应蛋白呈强阳性反应。
临床诊断的依据：1）持续高热，有“焦痂”或虫咬溃疡；2）有皮疹，淋巴结肿大，肝脾肿大；3）发病前约10天有野外活动史；4）四环素类药物治疗有效。对于恙虫病的最终确诊，DNA检测是目前最快速、特异、敏感的方法，发病第2天即可从患者血液中检出立克次体DNA，在用药后直至立克次体完全消除之前均可检出立克次体DNA。因此，检测立克次体DNA不仅可早期诊断，而且是追踪患者体内立克次体消除情况的好方法，有利于患者的早期治疗和防止复发。
参考文献：
White P L, Backx M, Barnes R A. Diagnosis and management of Pneumocystis jirovecii infection.[J]. Expert review of anti-infective therapy, 2017, 15(5):1.
何礼贤. 肺孢子菌肺炎[C] 第二届全国深部真菌感染学术会议论文集. 2007.
Kibe S, Meigh R, Moon T, et al. Nocardia cyriacigeorgica in an immunocompetent patient [J]. Therapeutic Advances in Respiratory Disease, 2015, 9(1): 28-30.
Raszka D, Popelka S, HerT J, et al. Rare case of osteomyelitis of tibial shaft caused by Nocardia cyriacigeorgica [J]. Folia Microbiologica, 2018.
邱波. 外伤后诺卡氏菌引起的皮肤慢性感染1例 [J]. 临床医药文献电子杂志, 2017 (13): 193.
Hofer U. Bacterial pathogenesis: Rickettsia releases the tension[J]. Nature Reviews Microbiology, 2016, 14(12).
Salje J. Orientia tsutsugamushi: A neglected but fascinating obligate intracellular bacterial pathogen [J]. PLoS Pathogens, 2017, 13 (12): e1006657.
黄志认. 恙虫病35例的临床分析 [J]. 广西医学, 2007, 29 (3): 453-453.
