第一个人类癌基因的发现——Ras

1 Ras 基因与肿瘤
       对膀胱尿路上皮癌细胞株T-24的DNA分析导致了第一个人类癌基因Ras的发现。研究发现，恶性肿瘤的形成、进展和转移与癌基因、抑癌基因不可逆的积累突变和失调有关。其中，Ras基因突变、过量表达与肿瘤发生发展的关系密切，而Ras家族中的H-Ras突变在膀胱尿路上皮癌中发挥重要作用。

1.1 与肿瘤相关的Ras基因
       与人类肿瘤相关的Ras 原癌基因家族主要分为3 类： H -Ras 、K-Ras和N-Ras[1]，分别编码一种鸟苷酸结合蛋白，相对分子量为21KD，通常命名为P21。当Ras基因被异常活化后P21ras蛋白持续地保持活化状态，激活下游信号分子，造成细胞生长失控而无
限制地增殖，进而引起肿瘤。RAS通过跨膜受体与调节生长分化的限速信号之间联系[2]。在RAS介导的生长转变和肿瘤形成的过程中包含以下效应物：RAF/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、PI3K/AKT、PLC/PKC和GTP酶级联效应，当Ras活化后可与效应因子结合促进后者的活化和信号扩增[3]。

1.2 肿瘤中的Ras基因突变
Ras基因被异常激活的方式主要有以下几种：
（1）基因点突变；
（2）基因扩增；
（3）染色体异位与基因重排；
（4）基因甲基化改变；
（5）基因过量表达。
       其中最常见的方式是编码区内的点突变。据估计，约有15%-20%的人类肿瘤中至少有三种Ras基因点突变中的一种，其中K-Ras基因突变最为常见。有文献报道约有60%-100%的胰腺癌、32%-47%的结肠癌、17%-33%的肺癌、20%-60%的甲状腺肿瘤和5%-28%的髓系白血病中有K-Ras基因突变[4]。相比之下，肿瘤中H-Ras及N-Ras基因的突变率则少得多。H-Ras基因虽然最先分离，但仅少数肿瘤中存在H-Ras基因突变，其中在膀胱癌中突变率最高。N-Ras基因的突变率在上皮细胞癌中较低，但在急性非淋巴细胞性白血病中约为20%-30%。近来有研究发现，在部分肿瘤中尽管没有检测到Ras突变，但存在着Ras活性增高现象，被命名为野生型Ras活性增高[5，6]。这一现象提示存在着目前尚未阐明的Ras活性调控机制，促使人们对Ras基因或其编码的P21ras蛋白的活性调控机制进行更深入的研究。

2 RasGTP酶活化蛋白（RasGAPs）

2.1RasGAPs对Ras活性的调控
       P21ras 在正常情况下有活化和非活化两种形式，与GTP结合时为有活性状态，而与GDP结合时为无活性状态。两种活性状态之间的转换，主要由RasGTP酶活化蛋白（GTPase-activating proteins，简称RasGAPs）和Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor,简称RasGEFs）两类分子调控。RasGAPs具有GTP酶活性，能水解GTP成GDP进而使Ras蛋白失活；而RasGEFs的作用可使Ras蛋白处于活性状态。小GTP酶中Ras样家族除包括H-Ras、N-Ras和K-Ras4A、4B等Ras蛋白外，还包括Rap蛋白Rap1A、1B、2A和2B[7，8，9]。Ras超家族成员都具有内源性GTP酶活性，能水解GTP生成GDP[10]。相关研究表明RasGAPs的功能缺失会使得Ras活性异常增高，继而促进肿瘤发生发展的可能性提高[11，12]。

2.2 RasGAPs家族成员
       根据文献报道目前已经发现多种基因编码的蛋白属于RasGAPs [5 ,13]， 包括neurofibromin 、P120GAP、SynGAP家族（DAB2IP、nGAP和SynGAP）和GAP1家族。其中，GAP1家族包括GAP1m（也称RASA2）、GAP1IP4BP（也称RASA3）、CAPRI（也称RASA4）和RASAL1（RasGAPase-activating-like protein1, 也称RASAL、GAP1 like protein等）。Rap1GAPs包括RapGAPsI和II，SPA-1家族（SPA-1、SPAR、SPAL、E6TP1），tuberin和DOCK4。GAP1家族除了GAP1m外其它成员如GAP1IP4BP、CAPRI和RASAL均具有RasGAPs的作用。各蛋白所表达的独特的GAP活性是由不同的第二信使途径所调控，GAP1IP4BP的GAP活性受磷酸肌醇的调控，CAPRI和RASAL的活性由受体介导的[Ca2+]i 调节[14，15，16]。有研究已经证实有些RasGTP酶活化蛋白具有肿瘤抑制功能，例如抑癌基因Neurofibromin1（NF1）的先天功能障碍导致常染色体显性遗传疾病，即第一型神经纤维瘤病，其特点是：神经肿瘤、皮肤的改变和骨畸形；RASA1的功能缺失与血管重塑异常有关[15，17]。另外RASAL1和RASA4也被证实具有抑制癌基因的功能[6，18]。

3 RASAL1基因与肿瘤
       RASAL1 是近年发现的一种基因， 位于第12 号染色体（12q24.13），其编码蛋白激活RasGTP酶，继而使与Ras结合的GTP转变为GDP，使Ras失活，从而参与细胞的增殖、分化、凋亡。

3.1 肿瘤细胞中RASAL1的甲基化
       正常情况下RASAL1基因在内分泌组织高表达如肾上腺、唾液腺以及垂体；而在髓样细胞、肌肉、神经和基质组织中RASAL1低表达[3]。有研究表明，RASAL1基因及其编码蛋白具有肿瘤抑制功能。RASAL1在鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、食道癌、淋巴瘤等六种肿瘤细胞株以及鼻咽癌、口腔鳞癌肿瘤组织中的表达均有下调[5]。进一步的研究提示，肿瘤细胞株中RASAL1基因表达降低的机制与RASAL1基因启动子甲基化有关，最重要的是甲基化碱基是胞嘧啶，通常发生在CpG双核苷酸区域，研究认为，RASAL1基因甲基化后该基因的功能被静默，从而使RasGTP酶活性减弱，继而Ras活性上调。
       JIN等人[5]使用亚硫酸氢钠基因组测序证实了在RASAL1基因沉默细胞系中存在有RASAL1基因甲基化。在不同的癌组织中和鼻NK/T细胞淋巴瘤检测到RASAL1基因甲基化，但在正常组织，NK细胞或正常的PBNC样本中未发现。Ohta M等人[19]在结肠癌细胞株DLD1、RKO、NCIH630和OUMS23中检测到RASAL基因CpG甲基化，对不表达RASAL的结肠癌细胞用DNA甲基转移酶抑制剂5-aza处理后，可取消CpG甲基化从而恢复对基因转录的抑制作用。研究结果表明在细胞株中CpG甲基化直接导致RASAL1表达下调，去甲基化后能够明显诱导RASAL1表达。DNA甲基化与基因突变或基因缺失不同，后者是基因结构性变异，而DNA甲基化是一种表观遗传学修饰，并未改变DNA的序列是一种可逆的改变。逆转启动子区域甲基化可以使沉默的基因重新表达[20]。然而在结直肠癌细胞中，就RASAL1表达沉默的调控机制目前还未明确，需要进一步研究。目前认为，具有催化活性的RASAL1表达下调可使Ras失活而抑制肿瘤的生长，RASGAP的表观遗传沉默可视为由RAS异常活化而致癌的一个新机制。

3.2 RASAL1介导PITX1对Ras活性的调控
       PITX1是近年通过RNA干扰文库技术新发现的抑癌基因，研究发现转录因子PITX1作为肿瘤抑制基因，可抑制Ras活性和肿瘤的形成，直接调节RASAL1基因转录[6]。Kolfschoten IG等人用定量Q-PCR在mRNA水平检测RASAL1，证实RASAL1作为抑癌基因PITX1基因的转录靶点，介导PITX1基因对Ras活性的调控作用。已在多种肿瘤细胞或组织中发现PITX1基因在mRNA和蛋白水平表达下降，包括结肠癌细胞株、前列腺癌、膀胱癌、Barrett食道腺癌[5]。在表达野生型K-Ras的细胞中PITX1基因表达下调后可降低RASAL1的表达水平从而使Ras蛋白的活性增强，通过减弱了GAP介导的Ras失活这一机制效能而导致肿瘤的发生。“PITX1- RASAL1-野生型Ras”通路的失调对肿瘤发生发展起着不可或缺的作用。研究证明，在晚期结肠癌中PITX1可重新表达并可以改变肿瘤的发展倾向，此结果为今后恶性肿瘤的治疗及靶向干预指明了新的研究方向。

3.3 RASAL1偶联钙振荡对Ras活性的调控
       细胞内游离钙是重要的第二信使，介导细胞对外界刺激的反应，影响细胞的分化、成熟和凋亡参与调节细胞众多的生理和病理过程。细胞内Ca2+时间和空间的分布受离子通道、结合蛋白、钙泵和转运体等的调节。近年研究发现，在肿瘤细胞、细胞的迁移运动能力、端粒酶活性、细胞周期调控、血管内皮生长因子（VEGF）活性改变等多种病理过程与钙信号传导机制发生异常有关[21～23]。

       钙振荡为细胞内钙信号传导的机制之一，指细胞在受到外界刺激后，胞浆内钙离子浓度发生有规律的时空上的波浪式变化，从而传递信息。胞内钙释放是钙振荡必不可少的，而胞外钙內流也参与钙振荡的形成，它们各自发挥不同的作用。认为钙振荡是Ca2+在细胞膜两侧和细胞器膜两侧的运转共同形成的。钙振荡是普遍存在的一种细胞内信号传递模式，它能使胞浆钙离子浓度升高但同时又能避免细胞持续地暴露在高钙的环境中，进而调节细胞的多种生理功能。钙振荡具有多种动力学特征，包括振幅、频率以及波宽等。已有的研究表明，转录因子的活化、基因表达与钙振荡的频率密切相关[21～23]。研究发现钙振荡实际上是胞浆游离钙的一种普遍运动形式，除电兴奋性细胞外，也广泛存在于多种非电兴奋细胞如腮腺细胞、肝细胞、内皮细胞、巨噬细胞、卵母细胞等。肿瘤细胞是一种非兴奋性细胞，不存在自发钙振荡，但在受到激动剂刺激后会出现规律性的钙振荡。RASAL1基因编码的蛋白是一种受钙离子调节的RasGTP酶活化蛋白，正常情况下可粘附与质膜，并通过与质膜粘附性的振荡变化解码钙振荡频率所传递的信号，继而调节Ras蛋白的活性[15，16]。RASAL1基因表达变化对肿瘤细胞内钙信号传导机制会产生何种影响，值得进一步研究。

3.4 RASAL1表达下调与结直肠肿瘤进展的相关性
       普遍认为大多数结直肠癌由腺瘤发展而来。在小腺瘤和毗邻癌性病变的变性隐窝灶中可检测到Ras的活性突变，因此认为其是结肠癌进展的一个早期事件。相关研究表明在约一半的结肠腺瘤和腺癌中检测到Ras活性突变，表明异常激活的Ras对结肠肿瘤的形成至关重要。Ohta M等人[19]通过对人类结肠肿瘤标本做免疫组化分析，明确了RASAL1在结肠肿瘤中的表达模式，标本包括小腺瘤（直径<10mm），大腺瘤（直径>10mm），腺癌，在正常结肠组织的上皮细胞中可清楚地观测到RASAL1的表达，但在周围基质检测到的RASAL1表达比较弱。在某些肿瘤中RASAL1的表达弥散和正常的上皮组织表达水平无差别，其余的肿瘤中RASAL1的表达较周围正常的黏膜组织表达减弱。RASAL1表达降低的肿瘤进一步分为两组：RASAL1表达轻度降低（10%-50%的细胞有RASAL1表达）和重度降低（少于10%的细胞表达RASAL1）。在152例人类结直肠肿瘤中，在腺癌中检测到的RASAL1表达降低占46.9%（轻度降低25.0%，重度降低21.9%）；在大腺瘤中检测到的RASAL1表达降低占17.4%（轻度降低17.4%，无重度降低）；然而在小腺瘤中没有检测到RASAL1表达降低（见图）。

      此图（引自参考文献19）RASAL1在结直肠肿瘤中的表达，使用免疫组化方法比较结直肠肿瘤中（小腺瘤直径<10mm，大腺瘤直径>10mm，腺癌）RASAL1表达。
       研究结果表明在结直肠癌细胞中RASAL1表达是降低的，尤其是在表达有野生型K-Ras基因的肿瘤内，伴随RASAL1表达降低其RAS活性减弱进而促进肿瘤的发展。RASAL1基因转染后高表达可致野生型K-Ras失活，高表达的RASAL1也可减弱磷酸MEK1/2和ERK1/2效应，此为蛋白激酶级联反应中RAS信号的下游组成元件，可由表达野生型K-Ras/BRAF基因的Hela细胞中的表皮生长因子激活。RASAL1可降低由生长因子和肿瘤生长所激活的RAS-MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）级联反应的活性[16]。在晚期病灶中检测到RASAL1表达降低的频率高于小腺瘤，提示RASAL1在良性结肠肿瘤发展中与在肿瘤形成起始中一样起作用。在结直肠肿瘤中RASAL1表达降低多位于远端结肠和直肠。然而当前对于表达有RASAL1基因的结直肠癌病人的长期预后还不清楚，今后还需要做更深入的研究，以阐明结直肠肿瘤形成的起因，促进新的治疗策略的发展。

4 展望
       癌基因不可逆的积累突变和失调是恶性肿瘤发生的重要分子机制，其中Ras基因突变、过量表达与肿瘤发生发展的关系密切。Ras癌基因是肿瘤诊断、治疗及预后等具有应用前景的临床问题。RASAL1作为RasGAPs具有GTP酶活性，可使Ras蛋白失活，进而抑制肿瘤的发生发展。因此深入研究RASAL1基因可以进一步阐明肿瘤的发生机制，对肿瘤早期诊断及分子靶向治疗奠定基础。

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                                                                                    摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第四期
                                                                                                              编辑：范伟伟