乙型肝炎病毒分子诊断的临床应用： 问题及思考

李金明，研究员，医学博士，博士生导师，卫生部临床检验中心副主任。

因为历史的原因，乙型肝炎在我国现阶段以及今后相当长的一段时间内，仍然是国内最为常见的传染病，2006年全国乙型肝炎流行病学调查表明，我国1－59岁一般人群乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）携带率为7.18%，但5岁以下儿童的HBsAg仅为0.96%[1]。临床检测项目通常包括乙肝“两对半”和抗-HBc IgM等免疫检验项目，以及HBV DNA定量、HBV基因分型和耐药突变等分子检验项目。免疫检验项目主要是用于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染的诊断，HBsAg和乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen, HBeAg）定量还可用于抗病毒药物治疗的预后及疗效监测，乙型肝炎表面抗体（hepatitis B surface antibody, HBsAb）定量主要用于疫苗免疫效果的判断。分子检验项目则主要是用于抗病毒药物治疗的决策、疗效和耐药监测，存在的问题主要有HBV DNA定量测定的国际单位（IU）/ml和拷贝（copies）/ml之间换算和不同试剂方法结果一致性、HBV基因分型和耐药检测中实验室自配试剂的性能确认和标准化程序以及检验结果和解释等。

乙型肝炎患者在采用干扰素或核苷类似药进行抗病毒治疗时，患者外周循环中HBV　DNA的含量是抗病毒治疗疗效唯一直接的指示标志物，患者进行抗病毒药物治疗期间，每１～３个月需要检测一次。此外，HBV DNA是独立于HBeAg和ALT以外能够独立预测肝硬化发生的危险因素，HBV DNA> 2,000 IU/mL（相当于104拷贝/mL）是肝硬化和HCC发生的显著危险因素[1]。HBV DNA的准确和具有可重复性的定量，是保证其能很好地用于上述患者治疗的前提条件。

1. 拷贝与国际单位的换算

关于HBV DNA的IU/ml与拷贝/ml之间的换算问题，是国内同道经常提出的一个问题。2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》中也提到HBV DNA的检测值可以国际单位(IU)/mL或拷贝/mL表示，根据检测方法的不同，1 IU相当于5~6拷贝。根据这一点，国内临床医生通常对于采用国产HBV DNA实时荧光定量PCR试剂检测结果也按这个来换算，以为是一个通用的计算公式，这是错误的。因为1 IU相当于5-6拷贝，不具有普遍性，不适用于所有商品试剂盒。如果说1 IＵ/ml相当于罗氏（Roche）的Cobas、Bayer bDNA等检测系统的5-6拷贝/ml，则是较为准确的［2］。这是因为在HBV DNA检测的商品检测系统最早应用的是Cobas amplicor，其结果报告单位是拷贝/ml，其后其它一些商品试剂如支链DNA（branched DNA, bDNA）、Digene杂交捕获试验等也是用的拷贝/ml，但不同方法间的拷贝/ml没有可比性。世界卫生组织（WHO）的HBV DNA标准物质（97/746, 10６IU/ml)在2000年发布后，罗氏公司即用其Cobas amplicor检测系统（PCR-ELISA）检测了该标准物质，发现1 IU/ml约等于其检测系统的5.26拷贝/ml，后来，罗氏又研发了基于实时荧光PCR的Cobas-Taqman检测系统，检测后，1 IU/ml约等于5.82拷贝/ml。Bayer采用the VERSANT HBV DNA 3.0 assay bDNA检测系统，1 IU/ml约等于5.6拷贝/ml［2］。其它一些商品试剂如Digene杂交捕获试验（the Digene Hbride-Capture assay）等也应有其拷贝/ml与IU/ml的换算系数。

HBV DNA检测用国际标准物质（reference material）是指由WHO多中心研究后由专门委员会认可的，经过稳定性和组成完整性检验的，在国际范围内用作有关量的其他标准定值的基础的物质，目前由英国国家生物学标准物质和质控物研究所（National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC）研制并提供。NIBSC于2000年建立了第一代HBV DNA（97/746，10６IU/ml国际标准［3］，2008年推出了第二代［4］。国际标准通常采用多中心合作研究定值，参加实验室数目应取决于研究的目的，原则上，实验室的数目要多于所选择的实验方法的数目，保证每种方法有多个实验室使用。第一代HBV DNA国际标准的多中心合作研究由分布于9个国家的22个实验室参加，要求每个参加实验室每隔一定时间（通常1星期或更长时间）进行一次独立实验，共进行四次独立实验。如果采用定量实验，每次实验中的样本及稀释系列（10倍稀释，包括原倍、1：10和1：100）都要进行双孔检测。然后对定量检测的数据进行统计学处理。如果实验室采用的为定性实验，则第一次独立实验时，参加实验室可以对样本进行10倍系列稀释，粗略确定终点浓度（end-point concentration）。自第二次实验始，要选择上次实验确定的终点浓度的上下共5个0.5log稀释系列进行实验。然后统计每个稀释浓度的检出率。假定每个稀释浓度测定的阳性结果符合piosson分布，选择检出率接近63%的浓度作为终点浓度，终点浓度乘以稀释倍数即得到标准物质的量值，单位为“可检出单位”（detectable unit），此即国际单位（IU）的来源。因此，IU本身是与拷贝没有直接关系的，当要说1 IU/ml等于多少拷贝/ml时，一定是特指某个在国际标准物质出现前采用拷贝/ml为单位的特定厂家试剂方法或检测系统而言。同样，国内厂家以前也是采用拷贝/ml来报告结果的，HBV DNA国际标准物质出来后，为保证不同厂家试剂盒之间的结果可比性，要求都采用IU/ml，所以也出现了换算，但国内厂家基本上均采用1:1的方式，这缺乏严谨性，如果当初的厂家的拷贝/ml溯源的源头（厂家参考物质）一直保持不变的话，两者的换算不可能是1:1的。

2. HBV DNA定量检测试剂的检测灵敏度

HBV DNA定量检测在国内均采用实时荧光PCR技术，国外也主要采用这种方法，检测敏感性可达10 IU/ml左右。抗病毒治疗的首要目标是持久抑制HBV复制，尽可能使血清中的HBV DNA降至最低水平[5]。因此，要求在乙型肝炎的抗病毒药物治疗过程，一是要采用HBV DNA定量检测确定抗病毒治疗前患者的基线HBV DNA水平，监测对抗病毒治疗的应答和监视抗病毒药物的耐药情况。二是要求所使用的测定方法要有足够的检测灵敏度。国内的HBV DNA实时荧光PCR方法的检测灵敏度通常都在500-1,000 IU/ml，并且批内批间结果变异也较大，表面看起来，似乎是国内的实时荧光PCR方法不行，但实际上并非如此，单从实时荧光PCR这个环节，国内试剂盒与国外试剂盒是没有什么区别的，造成结果差异的关键原因是核酸提取环节以及后续扩增检测时样本的加入量和反应体积，国内试剂盒为了简化操作，以前通常并不进行完全的核酸提取，只是简单的裂解及煮沸，离心后，取上清2-5µl用于扩增[6]。这样用于扩增的样本内可能会含有血红蛋白、IgG等PCR抑制剂，使得只能取少量样本（2-5µl）进行扩增，进而由于极微量加样的重复性显然较量大时差，检测的重复性亦差，同时，因为标本量及扩增加样量均较小，检测的敏感性自然也不行。反之，进口试剂均有对标本的核酸纯化提取，标本的用量大（500µl或850µl），核酸纯化后用于扩增的样本量亦大（50µl），于是测定的敏感性和重复性均远好于国内试剂［7］。如果采用磁珠进行核酸纯化，并加大样本量，其后无需改变扩增试剂组成，只需按样本量成比例即可，试剂盒的检测灵敏度及重复性等均与国外同类试剂盒相近［8,9］。  

HBV已发现有A~I 9个基因型，在我国以C型和B型为主。HBV基因型和疾病进展和干扰素α治疗效果有关。HBeAg阳性B基因型感染患者对干扰素α治疗的应答率高于C基因［1］。拉米夫定、阿德福韦酯和替比夫定等核苷酸类似药是乙型肝炎抗病毒治疗的常用药物，但随治疗时间延长，拉米夫定病毒耐药突变的发生率增高 (第1、2、3、4年分别为14%、38%、49%和66%)。阿德福韦酯治疗5年时患者的累积耐药基因突变发生率为29%、病毒学耐药发生率为20%、临床耐药发生率为11%。有研究表明，恩替卡韦3年累积耐药率为1.7%～3.3%。替比夫定组HBV DNA下降至PCR法检测水平以下者为60.0%、ALT复常率为77.2%、耐药发生率为5.0%［1］。

有关HBV基因型和耐药检测的商品试剂盒，国内也有应用小沟结合（ＭGB）探针YMDD耐药基因突变检测实时荧光PCR和PCR-反向斑点杂交试剂盒，实时荧光PCR方法很难避免假阳性结果的出现，临床较少应用，PCR-反向斑点杂交试剂盒对于点突变检测相对可靠，但这种方法由于涉及开放式的产物分析过程，对实验室分区和实验操作防“污染”要求高，也容易因为“污染”出现假阳性结果。一些实验室采用基于自配试剂Sanger测序方法，这种方法是基因突变检测的金标准，属于实验室自建方法和自配试剂（laboratory developed tests, LDT）。所存在的问题是，国内实验室在LDT过程中，基本于遵循的是一种研究生的科研思路，即购买各种基本试剂如酶、含dNTP的扩增缓冲液、设计引物和探针让厂家合成，然后合在一起即用于临床检测，有的实验室甚至测序过程由测序公司完成，这是一种完全的科研思路，绝不可以用于临床检测。国外对于LDT是有严格要求的，要求实验室在将购买来的各种试剂组成成份组成试剂盒后，临床应用前必须进行检测性能确认，包括检测的精密度、准确度、可测定范围、分析敏感性、分析特异性（包括抗干扰能力）等［10］，并且所有的试剂制备及性能确认过程均必须有文件化的程序及记录。只有这样，才能保证LDT用于临床检测的可靠性和有效性。

乙型肝炎患者在抗病毒药物治疗过程中，会定期进行HBV DNA和乙肝“两对半”检测，临床医生有时会对一些结果产生困惑或质疑，笔者有一次去一个医科大学附属医院检验科进行学术交流，检验科同行拿出两张检验报告单，一张是HBV DNA定量检测报告单，一张是乙肝“两对半”检测报告单，HBV DNA检测结果报告<103 IU/ml，乙肝“两对半”检测结果报告是“大三阳”。检验科同行说，他们医院的三个临床医生给患者的解释均不一样，最后在患者的质疑下，临床医生让患者找检验科解释。换句话说，临床医生看不懂这个检验报告单。如何让临床医生看得懂结果报告，是临床实验室的责任，实验室应该在检验报告单上进行必要的文字描述，要明确出现某种结果的可能原因有哪些？给出检测方法的关键检测性能指标（如测定下限、检测范围、精密度等）、检测的局限性以及进一步检测的建议等。检验科的检测人员是不能向患者解释结果的，只能就特定的检验项目向医生解释结果，因为检验人员是“只见树木（特定检验项目）不见森林（患者症状、病史、体征、影像及实验室其它检验项目的结果等）”的，“又见树木又见森林”的是临床医生，向患者解释结果的只能是临床医生。

上面提到的乙肝“两对半”、“大三阳”而HBV DNA结果<103 IU/ml这样的结果，其实是很好解释的，也应该是临床现在进行抗病毒药物治疗中比较常见的一种现象，作为一个医科大学附属医院的临床医生，不了解其是为什么，如果是专科医生，那是绝对不应该的，如果是非专科医生，只能说医生知识面过于狭窄。因为核苷酸类似药物的抗病毒治疗，其可以迅速地抑制HBV DNA复制，使血液中HBV DNA浓度出现相应下降，HBsAg和HBeAg循环可能会受影响，但却不会出现同步迅速下降，甚至影响不大，除非HBV DNA完全受到抑制，继而完全消失，但这通常不是抗病毒药物能做到的。当然，如果在HBV DNA检验报告单上进行必要的结果解释，就可以避免此类问题，如“HBV DNA定量检测适用于《慢性乙型肝炎防治指南》（2010年版）所规定的适用症乙型肝炎患者抗病毒药物治疗效果监测，治疗后，如出现HBV DNA含量持续下降，超过数量级以上，说明有效，反之无效。但HBV DNA的下降通常并不一定伴随有HBsAg和HBeAg的持续下降等……”。笔者经过仔细询问，了解到这个患者就是在进行核苷酸类似药抗病毒药物治疗的，并且HBV DNA的实时荧光PCR检测结果的曲线是有抬头的，也就是含量在几百个IU/ml，也就是仍是一个阳性结果，只不过含量较低，实验室在报告结果时，应该报告“HBV DNA<103 IU/ml（-300 IU/ml）”，说明这是一个不同于完全没有检出的阴性结果，此时，可采用更灵敏的方法（如<30 IU/ml）进行治疗监测，直至采用更灵敏的方法未检出。

参考文献

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