小曲线大学问 | 新冠核酸异常扩增曲线知多少？
实时荧光PCR技术是新冠病毒核酸检测的主要方法。每一个标本的检测结果都会以一张扩增曲线图呈现，需要我们的“专业慧眼”去辨析，判断出“阴性”还是“阳性”。在实际工作中，核酸扩增曲线并非次次“完美”，易受到多种因素影响。因此如何判读扩增曲线，对准确报告新冠核酸检测结果至关重要。
正常扩增曲线
正常扩增曲线呈S型，分为基线期、指数起始期、指数扩增期和平台期，且要求拐点清楚，整体平行性好，基线平而无上扬现象。
异常扩增曲线解析
异常扩增曲线是核酸检测人员最为头疼的问题。辨别扩增曲线形态、分析产生异常扩增曲线的原因是检测人员的必备技能。每一条扩增曲线的判读需要慧眼识别和经验处理。我们总结了检测过程中遇到过的异常扩增曲线，与大家进行分享。
01 内标扩增曲线异常
正常的内标扩增曲线是实验有效性的基础，可反映样本质量、抽提和扩增效率。
曲线特点：
【类型一】某标本内标无S型扩增曲线。
【类型二】外源性内标呈离散型曲线。
原因分析：
标本采样欠佳，没有刮取到足够的鼻咽部细胞。 标本保存不当，核酸降解。 标本加错位置或漏加。 提取失败：裂解液未混匀（外源性内标）、提取仪故障等。 扩增失败：漏加反应液、模板加错孔位、混入抑制扩增反应的干扰物等。
解决方案：
重新采集样本。 送检标本及时检测，室温放置不超过4h。 按照规范化流程进行相关操作。 定期对在岗人员进行操作考核。
【注】内标扩增曲线异常，则该批或相应标本结果无效，需重新采样或重新检测。
02 基线设定不当的异常扩增曲线
曲线特点：软件默认基线设定的扩增曲线呈波浪型，导致Ct值偏大，可能会被误判为阴性。
原因分析：软件默认基线设定不准确造成扩增曲线异常。
解决方案：根据检测试剂的要求设定适宜的基线。
03 软件优化造成的异常扩增曲线
曲线特点：软件优化后扩增曲线向斜上方抬起，导致Ct减小，根据优化后扩增曲线会误判为阳性，但原始信号未有明显扩增。
原因分析：根据设定基线，软件在自动优化扩增曲线时会放大微小异常信号。
解决方案：查看原始曲线，对基线稍作调整。
【注】自动优化软件会放大微小的异常信号，可根据原始曲线判断信号真假。
04 多个标本单靶标通道翘尾
曲线特点：多个标本出现单靶标通道的扩增曲线翘尾。
原因分析：
反应液配制后保存不当，如荧光探针断裂。 存在阳性质控污染或者其他荧光物质污染。 扩增试剂/耗材的批间差异导致非特异性扩增增加（如试剂更新后Mg2+浓度过高）。
解决方案：
按照说明书要求保存配制的扩增反应液。 提取得到的核酸应及时进行后续处理，否则及时封盖，避免混入阳性质控或其他干扰物；实验室每天按时清洁消毒以消除潜在的干扰因素。 试剂/耗材批号更换前应进行比对实验验证。
05 靶标通道呈低平S型曲线
曲线特点：标本靶标通道呈低平且非典型S型扩增曲线，标本与弱阳性质控的荧光强度存在显著差异。
原因分析：
标本存在干扰物质。 提取纯化不完全。
解决方案：标本重新检测，必要时可使用不同的检测试剂进行确认。
【注】对疑似标本建议使用不同的检测试剂进行确认。在异常扩增曲线判断时，应根据整批标本的扩增情况（弱阳性质控扩增曲线）综合判断。
06 蒸发引起的异常扩增曲线
曲线特点：反应体系蒸发，终体积减少，荧光强度产生变化导致阴性扩增曲线整体呈斜向上或山域型。
原因分析：
在扩增过程中因热盖导致管盖爆裂/光学膜破裂。 未盖紧管盖/刮紧光学膜。 未使用配套/质量合格的耗材。
解决方案：
定期检查扩增仪状态，确保热盖温度正常。 上机前盖紧管盖/刮紧光学膜。 使用厂商推荐的合格扩增耗材。 调整基线可适当纠正蒸发引起的异常信号，有助于后续的扩增曲线判读。
07 气泡引起的异常扩增曲线
曲线特点：扩增曲线出现剧烈或明显曲折。
原因分析：反应体系内有大气泡形成折射，干扰荧光的采集。
解决方案：
加样时减少气泡的产生，同时上机前可通过离心减少气泡。 调整基线可适当纠正气泡引起的异常信号，有助于后续的扩增曲线判读。
08 锯齿型异常扩增曲线
曲线特点：所有通道的扩增曲线出现锯齿状。
原因分析：扩增仪电压不稳、采光或者滤光片故障。
解决方案：检查扩增仪电压和光路系统，及时排除硬件故障，防止后续检测的异常结果。若扩增仪故障严重影响扩增曲线判读时应重新检测。
总 结
新冠核酸检测过程中每一个环节的操作都有可能产生异常扩增曲线，干扰结果判读。检测人员在上岗前需完成操作培训和考核，在实际工作中严格遵循规范化流程，掌握专业知识，积累实践经验，才能保证新冠核酸的检测质量。
编辑：骆秉涵
