自动化临床微生物检测系统与质谱鉴定结果的差异及鉴别

一、全自动微生物鉴定仪的结果差异及鉴别

任何微生物鉴定系统都有可鉴定菌种的范围，实验室人员要了解应用系统的鉴定菌谱。

通常全自动微生物鉴定系统能够对大多数临床常见菌株鉴定到种，但对少部分菌株只能鉴定到复合种、群，实验室针对这种情况需要补充鉴别试验才能鉴定到种水平，这关系到药敏试验的敏感性结果解释。VITEK 2操作手册[1]指出了一些菌属、菌群的菌株需要进一步鉴别，以下举例说明。

1. 奥斯陆莫拉菌生理生化鉴定：该菌在营养琼脂及麦康凯平板上不生长，在血平板上生长缓慢，35℃孵育48h菌落细小，湿润，凸起或者扁平，不溶血。为革兰阴性球杆菌，散在或者成对排列，无动力。氧化酶阳性，过氧化氢酶阳性，葡萄糖O/F：不利用。

奥斯陆莫拉菌使用VITEK 2 Compact的GN卡鉴定为莫拉菌群（99%概率，极好的鉴定），用NH卡鉴定为卡他莫拉菌（91%概率，好的鉴定）。莫拉菌属部分菌种生化鉴别特征见表1，鉴别反应及结果图示见图1。

【鉴别要点】（1）使用GN卡鉴定为莫拉菌群，当临床需要时要进一步鉴定到种，鉴别特征见表1。（2）使用NH卡鉴定为卡他莫拉菌，鉴定概率91%，为好的鉴定。此卡以鉴定奈瑟菌属和嗜血杆菌属为主，不能鉴定莫拉菌属，卡他莫拉菌现称作卡他布兰汉菌。根据细菌的菌落形态、菌体特征，这个菌与卡他莫拉菌差别较大，并且，脱氧核糖核酸酶（DNA酶）阴性，可以排除卡他莫拉菌。因此，即使NH卡鉴定率高，也是个错误的鉴定。（3）根据丁酸酯酶阳性、DNA酶阴性可鉴定为奥斯陆莫拉菌。

2. 嗜水气单胞菌鉴定：气单胞菌属细菌在血平板上β-溶血或不溶血。为革兰阴性杆菌，有动力，发酵葡萄糖产酸或产酸产气，氧化酶阳性。本实验室对10株嗜水气单胞菌用VITEK 2 compact鉴定，报告为嗜水/豚鼠气单胞菌（极好的鉴定，98%）,需进一步做鉴别试验确认鉴定结果，鉴别试验见表2，鉴别反应及结果图示见图2。

3. 铅黄肠球菌鉴定（ATCC 700327）：在血平板上35℃孵育48～72h的菌落黄色，α-溶血，为革兰阳性球菌，过氧化氢酶阴性。肉汤培养物链状排列典型，有动力。此菌经VITEK2 compact鉴定，94%概率，低分辨率。因鹑鸡肠球菌也有动力，生化特征相似，二者鉴别试验见表3，表型特征图示见图3。

铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌均对万古霉素天然低水平耐药，而粪肠杆菌和屎肠球菌对万古霉素是获得性耐药，这两类肠球菌的鉴别对临床治疗有重要意义。

二、质谱仪鉴定的结果差异及鉴别

质谱仪比自动化鉴定系统可鉴定的微生物种类和数量有很大扩展，但仍然存在鉴定某些的菌属/种、菌群的细菌时有差异[2]，需要补充试验进一步鉴别，以下举例说明。

1. 阴沟肠杆菌阴沟亚种鉴定：阴沟肠杆菌阴沟亚种经某种质谱仪鉴定结果为：阴沟肠杆菌（置信度33.3%）/神户肠杆菌（置信度33.3%）/阿氏肠杆菌（置信度33.3%），三者都是同一个属的不同种菌，说明该菌的质谱特征图谱不典型，需要进一步鉴别。三种菌的鉴别试验见表4，若VP试验阳性，报告阴沟肠杆菌阴沟亚种。

2. 肺炎链球菌与缓症链球菌群鉴定：肺炎链球菌在血平板上α-溶血，典型菌落为“脐窝状”，如果是产生荚膜多糖的菌株，可见菌落光滑、湿润；少数菌株的菌落与缓症链球菌群菌株无法区别，鉴别特征见表5，鉴别反应及结果图示见图4。

3. 奥斯陆莫拉菌质谱仪鉴定：奥斯陆莫拉菌用不同品牌质谱仪的鉴定结果不同，质谱仪品牌甲报告：侵蚀艾肯菌（置信度99.9%）；质谱仪品牌乙报告：奥斯陆莫拉菌；莫拉菌的鉴别特征见表1，鉴别反应及结果图示见图1。

【鉴别要点】根据过氧化氢酶（3%H2O2）试验阳性，排除侵蚀艾肯菌。

三、自动化微生物鉴定系统与质谱仪间的结果差异及鉴别

通过同一菌株在不同鉴定系统上的比对，大多数菌株的鉴定结果是相符合的，但少数菌株有差异。这种情况会导致实验室间、或者实验室在使用不同的鉴定系统时结果不符合，因此，针对鉴定结果与表型特征明显不符、存疑的菌株，实验室需要补充试验加以鉴别[3, 4, 5, 6, 7]，以下举例说明。

1. 志贺菌属鉴定：目前的质谱仪对志贺菌属的菌株报告为大肠埃希菌，如果临床要求检查志贺菌属，推荐用常规的克氏双糖铁、动力试验的筛查。根据结果再用手工方法或微生物生化鉴定系统做鉴定，如果确定为志贺菌属的菌株，再进一步做志贺菌血清学分型确认试验。

使用VITEK 2 Compact上能够鉴定志贺菌，但质谱仪鉴定为大肠埃希菌，会造成漏检。志贺菌属菌株在不同鉴定系统中的结果差异见表6。

【鉴别要点】 手工或者微生物生化鉴定系统均可明确鉴定志贺菌属，但须经过血清学确认。应注意质谱仪对于来自粪便标本中检出大肠埃希菌的甄别，避免漏检志贺菌。

2. 大肠埃希菌O157：H7的鉴定：血清型O157：H7大肠埃希菌（E.coli O157）在麦康凯平板呈红色菌落（发酵乳糖），山梨醇麦康凯平板呈无色半透明菌落，不发酵山梨醇是E.coli O157与普通E.coli的重要区别，其在显色平板上呈酒红色菌落。动力阳性（80%），O157：NM血清型无动力。在KIA上发酵葡萄糖和乳糖、产酸/产气，氧化酶阴性，MUG（β-葡萄糖醛酸糖苷酶）和山梨醇均阴性。

E.coli O157：H7在VITEK 2 Compact上能够明确鉴定，使用某品牌质谱仪鉴定为E.coli，造成漏检。E.coli O157：H7在不同鉴定系统中的结果差异见表7，鉴别反应及结果图示见图5，血清凝集反应图示见图6。

【鉴别要点】 根据E.coli O157：H7山梨醇和MUG两项试验阴性，或使用E.coli O157显示平板可以快速筛查出来，菌株还需要生化鉴定和血清学或乳胶凝集试验确认。应注意质谱仪对于来自粪便标本中检出的大肠埃希菌的甄别，避免E.coli O157漏检。

该菌在血平板、巧克力平板上生长缓慢，菌落细小，35℃孵3天（空气环境）见针尖样菌落，孵育5天，菌落＜1mm，不溶血。在鲍特菌平板上孵育4天的菌落＞1mm、圆形、凸起、光滑，光照下的菌落水银滴样。为革兰阴性球杆菌，菌体似细砂，着色深。氧化酶和过氧化氢酶阳性，葡萄糖O/F：不利用，尿素酶阴性，硝酸盐还原酶阴性，无动力。与百日咳鲍特菌诊断血清凝集。VITEK 2 compact不能鉴定百日咳鲍特菌，VITEK MS质谱仪鉴定结果：百日咳鲍特菌（置信度50%）/支气管脓毒鲍特菌（置信度50%）；需要对菌株做进一步鉴别，鉴别反应及结果图示见图7。

【鉴别要点】（1）百日咳鲍特菌生长缓慢，菌落细小，不能在麦康凯平板上生长，菌体细小，尿素酶阴性，可用特异性血清学鉴定。（2）支气管脓毒鲍特菌对营养要求不高，在麦康凯平板生长，菌体细长，尿素酶阳性，与百日咳鲍特菌有明显区别。

4. 新洋葱伯克霍尔德菌鉴定：新洋葱伯克霍尔德菌在血平板上35℃孵育24h，菌落细小。延长孵育时间菌落增大，圆形、凸起、光滑、湿润。革兰阴性杆菌、氧化酶阳性、葡萄糖O/F：氧化型。洋葱伯克霍尔德菌群种间的表型特征非常相似，即使补充试验鉴别，菌种的鉴定仍然困难，质谱仪有鉴别优势。新洋葱伯克霍尔德菌在VITEK 2 Compact鉴定结果：洋葱伯克霍尔德菌群（好的鉴定，94%）；VITEK MS质谱仪鉴定结果：新洋葱伯克霍尔德菌（置信度99.9%）。如果需要进一步鉴定到种水平，鉴别特征见表8。

四、显色平板筛选及鉴别

显色平板专为目标菌的快速筛选而研制，是根据微生物特定的酶水解底物显色，且目标菌在此培养基上生长良好，显色快、色素鲜艳而容易识别。虽然显色平板中的抑菌剂会抑制“杂菌”的生长，但是，具有该种酶且能够生长的“杂菌”，会产生类似的色素，因此，不能仅仅根据色素而未经鉴定就直接发出报告，在表型特征不符合时，还需要进行鉴定确认，谨防误报。

1. 在念珠菌显色平板（科玛嘉）上生长绿色菌落的菌株：白念珠菌（ATCC10231）、都柏林念珠菌（质谱仪鉴定：置信度99.9%）在科玛嘉念珠菌显色平板上均形成绿色菌落 ,并且在血清中都产生芽管，容易混淆。因此，对绿色分离菌株需要进一步通过生化试验或自动化仪器鉴别。在念珠菌显色平板上产生绿色色素的不同菌种见图8。

2. 在头孢磺啶-氯苯酚-新生霉素（CIN）显色平板上生长红色菌落的菌株：CIN平板是筛查腹泻致病菌小肠结肠炎耶尔森菌（VITEK 2 Compact好的鉴定，98%）的显色平板，菌落呈红色。但可引起腹泻的气单胞菌属的3个种在这种培养基上也生长良好，菌落也呈红色，由于它们存在于粪便中，容易混淆，需要加以鉴别。在CIN平板上产生红色菌落的不同菌种见图9。

【鉴别要点】小肠结肠炎耶尔森菌氧化酶试验阴性，气单胞菌属氧化酶试验阳性。

3. 在无乳链球菌（科玛嘉）显色平板上生长红色菌落的菌株：除无乳链球菌外，解没食子酸链球菌巴斯德亚种（质谱仪鉴定：置信度99.9%）与表皮葡萄球菌（质谱仪鉴定：置信度99.9%）在无乳链球菌显色平板上生长，也是红色菌落。其中，表皮葡萄球菌对红霉素耐药，菌落小、生长慢。这两种菌株都分离自围产期孕妇阴道分泌物，因此，不能简单地把红色菌落作为无乳链球菌报告，需要进一步鉴别确认，误报无乳链球菌会对孕妇造成过度治疗。无乳链球菌过氧化氢酶阴性，CAMP试验阳性，作为特征性鉴定试验。在无乳链球菌显色平板上产生红色菌落的其他菌种见图10。

【鉴别要点】（1）解没食子酸链球菌巴斯德亚种是链球菌属的一个种，CAMP试验阴性可排除。（2）表皮葡萄球菌菌体排列、过氧化氢酶阳性可鉴别。

4. 在沙门菌（科玛嘉）显色平板上生长红色菌落的菌株：沙门菌产生辛酸酯酶，分解底物产生红色菌落，但粪便中还有其他菌种的细菌生长也呈红色菌落，容易与沙门菌属混淆，需要进一步鉴别。在沙门菌显色平板上产生红色菌落的不同菌种见图11。

【鉴别要点】（1）气单胞菌属与类志贺邻单胞菌氧化酶试验阳性可排除；（2）摩根摩根菌苯丙氨酸脱氨酶试验阳性可排除；（3）大肠埃希菌与志贺菌按常规方法鉴别。

本文仅列举了作者在日常工作中遇到的一些案例，当然，存在鉴定差异的菌株不仅限于此。当系统给出的鉴定结果为低分辨率或低置信度、不能区分的结果或给出多个结果、或对于一些少见菌用不同系统鉴定出现结果不一致等情况时，特别是无菌部位来源的标本、侵袭性方法采集的标本、免疫抑制患者等因素，应根据微生物的形态学、生理生化特性做进一步鉴定到种或亚种水平[2]。为临床报告正确的病原学结果，对临床治疗有重要意义。

参考文献略

注：本文来源于《临床实验室》杂志2020年第10期“感染性疾病”专题