自2019年12月，新型冠状病毒肺炎（coronavirusdisease 19,COVID-19）疫情在全球范围内蔓延，至今以奥密克戎变异株流行为主，其传播速度更快，传染性更强，传播更隐匿[1]。目前COVID-19仍无有效药物预防，快速检测与隔离仍然是最有效的防控手段[2]。由于大规模核酸检测的需求，促使半自动化、自动化的核酸检测系统应运而生。全封闭自动化核酸检测系统的因成本偏高、检测通量偏低，占地面积偏大，其应用存在局限性[3,4]。而半自动化仪器，包括自动分杯机、核酸提取仪、半自动移液工作台等实现了核酸检测单个步骤的自动化，减少了人工操作环节，从而提高了工作效率。
用于分装扩增反应液和模板的半自动移液工作台具有体积小，占地面积小，使用灵活的优点，建议在核酸检测中使用。该仪器在使用过程中也面临了各种各样的问题，比如在最初替换人工操作时，我们发现出现大量扩增异常的曲线（图1）。
图1：异常的扩增曲线（1）
注：1A：N基因扩增原始曲线；1B：手动调节基线后N基因扩增曲线；1C：ORF1ab基因扩增原始曲线；1D：手动调节基线后ORF1ab基因扩增曲线。
半自动移液工作台异常扩增的原始曲线呈不规则状，扩增初始时出现信号的波动；通过人工调节基线后，扩增曲线呈现散射装分布；异常曲线干扰阳性对照曲线解读；偶尔异常曲线呈现类似典型的“S”型曲线（图2）。我们通过对其各种重要参数的优化设置，成功实现了半自动移液工作台替代手工分装扩增反应液和模板的操作环节。
图2：异常的扩增曲线（2）
注：2A：N基因扩增曲线；2B：ORF1ab基因扩增曲线；2C：IC基因扩增曲线；2D：扩增产物。红箭头：样本扩增曲线；蓝箭头：阳性对照扩增曲线；黄箭头：气泡。
为了分析扩增曲线异常原因，我们对整个核酸检测系统进行分析。首先我们推测异常曲线是否由于扩增仪受到干扰所导致：（1）扩增仪在检测收集信号时是否存在光源不稳定的因素？通过对扩增仪光源的评估、仪器的校准、性能验证予以排除仪器光源不稳定的干扰因素[5]。（2）扩增仪在检测时是否因静电吸附灰尘导致的信号干扰？通过实验后对扩增仪清洁、消毒以及避免长时间待机状态予以排除静电吸附灰尘的信号干扰。通过排除以上两项原因后，扩增异常曲线无明显改善。然后在对类似典型的“S”型曲线的扩增产物仔细观察时，发现一个微小气泡（图2D），推测可能由于使用半自动移液工作台加样时造成的气泡，进而导致的曲线异常。用半自动移液工作台预先设置好的参数分装扩增反应液和模板，发现存在很多气泡（图3A）。由于气泡对光存在折射作用，在扩增收集信号的过程中就会出现信号干扰，导致扩增曲线异常。消除扩增体系中的气泡，最常用的方法是使用平板离心机离心。但是，是否可以通过优化半自动移液工作台的参数设置避免气泡的产生？我们通过对半自动移液工作台的参数优化后，分装扩增反应液和模板可以完美的避免气泡产生（图3B）。
图3 半自动移液工作台参数优化前后移液对比
与半自动移液工作台吸液相关的重要参数是：吸液体积、移液偏移、前吸空气、后吸空气等。吸液体积根据我们使用的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂（广州达安，荧光PCR法，批号：2022662）的说明书设置吸液体积，扩增反应液设置20ul，模板设置5ul。移液偏移参考平面Bottom，扩增反应液设置0mm，保证移液枪头位于液面以下不至于吸入空气，同时保证可以吸取全部的液体；模板设置1mm保证移液枪头位于液面以下不至于吸入空气即可。前吸空气设置过大会导致残液量的堆积，设置过小会影响排液量的准确，建议设置2-4mm。后吸空气的设置是保证吸取的液体在机械臂移动过程中不滴落下来，移液的扩增反应液和模板均为微小体积量，设置0即可，否则在排液时容易产生气泡。半自动移液工作台对于吸取扩增反应液和模板优化前后的参数如表1。与半自动移液工作台排液的重要参数是：排液体积、排液偏移、是否排空吸头、是否碰壁等。排液体积相对吸液体积进行设置，为了保证移液量的准确，建议排液量大于吸液体积，小于或等于吸液体积和前吸空气体积。移液偏移和是否排空吸头，是避免产生气泡的关键参数。移液偏移参考平面Bottom，20ul的扩增反应液约4mm高，建议设置3-4mm，保证排液时枪头位于液面位置偏下。是否排空吸头设置，需要避免气泡产生，并且保证残液不倒吸入吸头。是否碰壁的设置，是保证在反复吸取扩增反应液时不会造成残液量在枪头内的堆积形成泡沫。半自动移液工作台对于扩增反应液和模板排液优化后的参数如表1。
表1：半自动移液工作台参数设置的优化
通过对半自动移液工作台的参数优化后，分装扩增反应液和模板可以避免气泡产生，从而减少平板离心机离心这一环节。在核酸检测系统中引入半自动移液工作台，可以实现扩增反应液体和模板移液自动化，进而达到提高工作效率，减少人工操作环节，降低交叉污染的目的。[1]廖康生, 卢洪州. 新型冠状病毒奥密克戎变异株的研究进展：对其科学防控措施的启示[J]. 新发传染病电子杂志, 2022, 7(1): 1-5.[2]潘柏申, 尚红. 检验医学在抗击新型冠状病毒肺炎中的发展[J]. 中华检验医学杂志, 2021, 44(1):1-2.[3]xing Wanli, Liu Yingying, Wang Huili, et al. A high-throughput, multi-index isothermal amplification platform for rapid detection of 19 types of common respiratory viruses including SARS-CoV-2[J]. Engineering, 2020, 6(10): 1130-1140.[4]张亚兵,黄邵祺,戴博,等. 全封闭自动化高致病、高传染病原核酸检测系统的研制[J]. 现代仪器与医疗,2021,27(2):34-39. [5]周丹, 何进才, 李惠贞, 等. 新型冠状病毒核酸检测的性能验证及评价[J]. 检验医学与临床, 2022, 19(3): 324-329.
