核酸检测内参未起，问题到底出在哪里？
IC，英文全称是Internal Control，即内参。内参主要分为“外源性内参”和“内源性内参”两种。为指导各地做好新型冠状病毒肺炎（以下简称新冠肺炎，COVID-19）疫情防控工作，国务院联防联控机制发布了《新型冠状病毒肺炎防控（第九版）》，方案中提及了：“人体样本检测原则上选用含内源性内参的检测试剂”。因此，现在提及的核酸检测中的“IC”通常指的是内源性内参。
《临床分子生物学检验》第三版介绍，PCR常用的内参照一般选用与待测基因序列结构无关的“管家”基因，如B-肌动蛋白（B-actin）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）等，这些基因的含量相对丰富，转录比较稳定。扩增时应在同一个反应管内进行靶基因和内参照基因的同时扩增，以尽可能避免不同反应间由于扩增效率的差异给结果带来的影响。
内源性内参（IC）可以监测核酸检测的全流程，包括样本采集、核酸提取、核酸扩增等环节，是监测核酸检测过程是否有效的一个指标，可减少假阴性结果的出现。我们可以将其理解为一个靶标，但不是病毒的靶标，而是人源基因的靶标。
如果核酸检测的IC无扩增，那么就提示该样本检测结果无效，需要核查检测过程中的每一个环节，包括检验前样本采集、保存、运送；检验中反应体系、提取、扩增及人员操作等环节。对于检测结果无效的样本采取的措施一般建议先对原样本进行复测，如果复测IC无扩增，然后再进行重新采样检测。
如果一个批次的核酸检测过程中，出现单个或几个样本的IC无扩增（图1），大部分样本的内源性内参、未参与提取的阳性质控或弱阳质控（含有内源性基因）内参有扩增，同时阳性质控或弱阳质控的靶标有扩增，提示检测系统中的核酸提取、核酸扩增等环节没有问题，有可能是检验前样本采集、保存、运送，或者人员操作环节样本少加、漏加、误加等原因造成内参无扩增。对于IC无扩增的样本建议先进行复测，如果复测IC仍无扩增，提示样本采集不合格，需要重新采样检测。
图1 样本C10孔的IC无扩增
如果一个批次的核酸检测过程中，一整板样本的IC无扩增（图2），主要见于以下两种情况：
图2 除未参与提取的阳性质控，整板IC无扩增
1. 如果未参与提取的阳性质控或弱阳质控（含有内源性基因）的IC和靶标有扩增，提示检测系统中的核酸扩增环节没有问题，有可能是核酸提取环节，或者人员操作环节样本或模板少加、漏加等原因造成整批样本内参无扩增。
2. 如果未参与提取的阳性质控或弱阳质控（含有内源性基因）内参和靶标均无扩增，提示检测系统中的核酸提取、扩增等环节都有可能存在问题，或者人员操作环节样本或模板少加、漏加等原因造成整批样本内参无扩增。
对于情况1在排除人员操作加样误差环节外，主要是由于核酸提取环节可能存在问题。对于情况2在排除人员操作加样误差环节外，如果未参与提取的阳性质控或弱阳质控（含有内源性基因）的IC和靶标有扩增，主要是由于核酸提取环节可能存在问题；如果未参与提取的阳性质控或弱阳质控（含有内源性基因）内参和靶标仍无扩增，主要是由于核酸扩增环节可能存在问题，这种情况极少出现，除非扩增仪出现故障，需要联系仪器工程师排除问题所在。
对于核酸提取环节可能存在的问题分析如下：
目前获批的核酸提取试剂盒主要采用磁珠法提取核酸。磁珠法提取核酸的原理是，磁珠可以在不同盐浓度和酸碱条件下与核酸特异性吸附或解离，通过转移磁珠法分离裂解细胞中的核酸和其他成分，再通过洗涤和洗脱获取纯净的核酸。不同核酸提取试剂（磁珠法）厂家核酸提取步骤基本一致，主要包括裂解、洗涤和洗脱三个步骤，只是提取程序和试剂成分存在些许差异。
以金麦格核酸提取试剂盒（磁珠法）为例（图3），该试剂主要包括含磁珠的裂解液板、含盐酸胍的洗涤液1板、含乙醇的洗涤液2板、洗脱液板（水）。含磁珠的裂解液板和洗涤液1板中的盐酸胍在提取DNA中的作用是作为提取细胞总RNA实验中的强烈变性剂，盐酸胍溶液可溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，从而让核酸能够摆脱蛋白的缠绕，同时吸附在磁珠上。核酸不溶于乙醇，可以使用含乙醇洗涤液2板对吸附在磁珠上的核酸进行二次洗涤，使残留的杂质溶解于乙醇，并最终去除核酸中的残留杂质（对混杂的RNA无效），最后通过洗脱液洗涤磁珠得到纯净的核酸产物。
图3 金麦格核酸提取试剂盒（磁珠法）
因为核酸提取过程中的每一个试剂都有其独特的作用，尽管包含两个或三个洗涤液板，但每个个洗涤液板的作用完全不一样，如果检测过程中任意一块试剂板放错位置，就可能导致一个批次的核酸检测过程中，一整板样本的IC无扩增，但未参与提取的阳性质控或弱阳质控（含有内源性基因）的IC和靶标会出现扩增。对于磁珠板和洗脱液板如果错放，在核查过程中很容易发现问题所在，如果两个洗涤液板错放，在核查过程中不容易发现问题所在，给检测工作带来不必要的麻烦。
目前自动化核酸提取仪尚无法识别核酸提取具体的试剂成分，需要检验工作人员严格按照仪器程序识别试剂成分并正确摆放试剂位置。由于大规模核酸检测以及检测时限的需求，给检验工作人员带来巨大的工作量和工作压力，人工操作误差在所难免，如果出现一整板样本的IC无扩增的情况，无论未参与提取的阳性质控或弱阳质控（含有内源性基因）的IC和靶标是否出现扩增，均需要核查核酸检测中的每一个环节，建议排除问题所在后，对原标本进行复测。
如今信息科学技术高速发展，在大规模核酸检测的需求下，希望自动化核酸提取仪可以进一步智能化，保障核酸检测顺利进行，从而减少人员操作误差，减轻人员工作压力。
