血小板计数参考方法测量不确定度的实验研究

                                                    上海市临床检验中心     

                        许蕾，宋颖，李泳，李栋成，朱俊，朱秀兰，金大鸣，陈悦

       摘要：目的  探讨血液学分析中测量不确定度在血小板计数(BPC)方面的应用。方法  参照国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的BPC参考方法计数处理过的全血标本中的血小板(PLT)，并利用相关实验数据和文献资料，按照国际标准化组织(ISO)《测量不确定度表述指南》文件中有关测鼍不确定度的评估方法，采用方差分析法，计算BPC过程中的不确定度。结果  本实验研究评价了影响参考方法BPC的各个分量的不确定度，而所占比例最大因素为天间误差因素，其次是瓶间误差因素，天内误差和仪器校准因素所占比例较小；处理过的全血标本中BPC的扩展不确定度(扩展因子k=2)和95％置信区间为(189．6±5．4)×10⁹／L。结论  在规定了测量过程和分析样品类型时，不确定度能反映多种因素对检测结果的影响，不确定度能适用于该项目的测量值，有利于实验室问结果的可比性。
       关键词：测量不确定度；参考方法；血小板计数

       血小板计数(BPC)是临床最常用的血细胞检测指标之一，根据国际血液学标准化委员会(ICSH)的要求，血细胞计数结果应溯源到参考方法，才能保证结果准确性。2001年ICSH推荐了间接法BPC参考方法，采用流式细胞仪和单克隆荧光抗体，先计数血液中红细胞(RBC)和血小板(PLT)量，然后计算两者比率(RBC：PLT)，再用颗粒计数仪准确计数RBC，最后计算血液中PLT参考值。尽管如此，由于PLT体积很小，直径为2～4um，在体内外很容易被激活变形，实际测定中有许多影响因素，所以准确计数PLT已成为检验医学领域一个迫切需要解决的问题。测量不确定度(Uncertainty)的定义是表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数，它能更客观地评估分析过程的各个影响因素，现正受到越来越多业内人士的重视。由于国内外对BPC参考方法的不确定度研究报道尚少，我们的实验研究旨在识别BPC参考方法所包含的不确定度，初步确定不确定度各分量的组成，以便提高BPC检测结果的准确性和可靠性，更好地为临床服务。

材料和方法

一、材料

       1．制备稳定的全血标本  取经醛化固定后洗涤的全血标本约350 mL，分装入数支清洁无菌离心管内，以3 000 r／min离心10 min，弃去上层血浆液，加入无菌生理盐水(NS)，洗涤3次，最后1次弃去上层NS后，加适量无菌NS，分装于无菌真空管中，每支约3 mL，保存于4～8℃，备用。
       2．制备无菌NS。
       3．制备无菌磷酸盐缓冲液(PBS)。
       4．磷酸盐-牛血清白蛋白缓冲(PBSA) 在上述PBS液中加人牛血清白蛋白(BSA)1．09(浓度为0．1％)，充分颠倒混匀，0．22um滤膜过滤后备用，保存于4～8℃，备用。
       5．荧光染液异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CIMI 和CD61抗体(Beckman CouLter公司产品)。
       6．仪器XL Epics型流式细胞仪(FCM)，Z2颗粒计数仪，使用前分别用原装校准品进行校准；微量移液器(Labsystems公司产品)，使用前经上海计量技术研究院校准；1 000 mLA级容量瓶；Anke TDL-5型水平式离心机。

二、方法

       1．ICSH推荐的BPC国际参考方法(间接法)  (1)临用前，将CD41-FITC和CD61-FITC荧光染液以1：1等量混合，使成混合液，待用；(2)取已充分混匀且处理过的全血标本5uL，加入100uL PBSA中充分轻柔混匀。注意，不能使用振荡器混匀标本。加10uL CD41和CD61抗体混合液，充分混匀，室温18—22℃，避光孵育15min。加885 uL PBSA，充分混匀。取上述反应管内混合液500 uL加到2 000 uL PBSA中，使全血的最终稀释度为1：1 000，充分混匀。在室温避光条件下进行FCM测定；(3)FCM检测方案为：将待检血细胞按细胞大小，细胞内颗粒多少，对激光的前向和侧向散射光的反应强度，以及对特异荧光染料的亲和程度不同，将待检血细胞分设在A—F6个不同的门内，从中收集50 000个RBC信号，其中包括PLT信号至少1000个，然后计算出RBC／PLT比率。
       2．处理过的全血标本经充分颠倒混匀后在经校准的Z2颗粒计数仪上计数RBC。
       3．每天取上述处理过的全血标本2支，分别由2位技术熟练的操作人员在上述仪器上各测1支，每支测2次，连续测15 d，以得出参考方法的PLT计数值。
       4．FCM校准方法为在上述1：1000稀释度的全血标本中加入FCM标准颗粒(flow count)100 uL(Beckman CouLter公司产品，批号为754803，绝对计数为998个/uL)，混匀，在FCM上加1个I 门(标准颗粒门)，和全血标本一样测定，分别计数C门内的RBC，D门内的RBC／PLT重合数，I 门内的标准颗粒数，再用Z2 颗粒计数仪计数该样品中的RBC。计算实测RBC数和理论RBC数的差异值，计算FCM的校准不确定度(Us)在BPC参考方法测定的不确定度中所占的分量大小。
       5．实验数据的统计和分析  (1)参考方法BPC 的计算公式为其中BPC为被测样品中PLT数，P为FCM上计数的PLT数，C_PR为FCM上计数的RBC和PLT重合数，R为FCM上计数的RBC数，RBC为Z2颗粒计数仪或血液分析仪上计数的RBC数；(2)建立BPC参考方法不确定度计算的函数关系式

       总合成标准不确定度Uc，满足下列函数关系式：
       具体计算过程见表1-表3。

       6．BPC参考方法的不确定度的来源  (1)天间因素；(2)瓶间因素；(3)天内因素；(4)仪器校准因素(Us)等。

结 果

       表4显示：天间标准不确定度(U_A)为不确定度最大分量，其次是瓶间标准不确定度(U_B)占最大分量69．3％，天内标准不确定度(U_E)所占比例为最大分量的1／3左右，校准标准不确定度(U_S)所占比例最小。

讨论

       BPC虽然是一个常规检验顼目，但在心血管病、血栓与止血疾病、妇产科学、移植医学、手术治疗、PLT输注治疗中具有重要作用，准确计数PLT已成为一个迫切需要解决的问题，目前国际上尚未见PLT标准品。上海市临床检验中心(以下简称本中心)在上海市卫生局的大力支持下，在上海市开展血液学地区性质量控制计划，在制备血液质控品中积累了一些实践经验，但不同仪器间BPC差异仍然存在，需要通过溯源性研究加以解决。
       临床检验量值溯源的研究处于初始阶段，而BPC溯源性的研究更是刚刚起步，由于仪器、试剂、方法等种类繁多，参考值各异，使各实验室的检验结果可比性欠佳，给临床诊断、治疗带来不利影响。因此，开展这方面的标准化工作，使检验结果具有溯源性和可比性，有助于医疗资源酌共享和互认。
       2001年ICSH推荐了间接法BPC 的国际参考方法，本中心于2002年起进行了BPC参考方法的实验研究，并基本确定上海地区人群RBC和PLT比率的基准值。本次实验研究显示，用方差分析法考虑天间、瓶间、天内、不同操作人员、不同标本、FCM校准等影响因素，得出经处理全血标本用BPC间接参考方法的合成标准不确定度为2．69，扩展不确定度为(189．6 ±5．4)×10⁹／L(k=2)，并且在BPC参考方法不确定度各分量中，u_A为不确定度最大分量，其次是u_B占最大分量69．3％，u_S所占比例为34．9％，校准标准不确定度所占比例最小(17．9％)。本中心宋颖等的实验报道指出容量瓶、去离子水的体积、温度、移液器等实验器材的不确定度计算结果占最大不确定度分量的比例小于30％。在分析不确定度各分量的组成中，比最大不确定度分量小1／3的分量可以忽略不计，所以，本次实验显示天间误差是不确定度分量的主要组成部分。
       对测量不确定度的评估是一个很细致的过程，要注意质量保证，确保检测过程稳定并受控，有合格的操作人员，对仪器和试剂的正确维护和校准，使用经确认的分析方法和文件化的测量程序，使实验室检测结果具有溯源性。
       总之，BPC参考方法不确定度的实验研究，需要有FCM、Z2等较昂贵仪器，更需要时间和经验的积累。通过我们的研究，基本了解了该参考方法不确定度各分量的组成和计算，旨在推动血细胞计数标准化的溯源工作。

                                                                                            编辑：范伟伟