细菌药物敏感性试验新检测方法的临床应用价值
众所周知，在抗菌药物敏感性试验（Antimicrobial susceptibility test，AST）方法中，纸片扩散法[1]（K-B）和微量肉汤稀释（Broth microdilution，BMD）方法在日常临床工作应用最广泛。在常用AST自动化仪器中，如凤凰（Becton，Dickinson Phoenix），贝克曼（MicoscanWalkAway）和梅里埃（bioMérieux Vitek 2），都基于BMD是测试药物对细菌的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）。但是，这些方法有一定的局限性，如需要相对大量的活菌、复杂的分析前处理、获得结果的时间和受成本支出等因素的影响。目前，有许多种AST方法（见表1），且每一种都有其长处和短处[2]。下面，我们将简要介绍几种未来有可能替代目前的标准方法（BMD）的抗菌药物敏感性试验技术。
一、AST新的替代方法
1. 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，MALDI-TOF MS）：质谱除了用于快速鉴定临床分离的病原体外，其检测AST的方法也有一定的价值[3]。已报道的方法有:
（1）测抗生素水解酶（如β-内酰胺酶）的活性。例如检测碳青霉烯酶活性，是将细菌悬浮液与作为基质的厄他培南一起孵育，通过MALDI-TOF MS检测厄他培南的变化。产NDM-1或IMP-1的细菌能在1小时内完全水解厄他培南，而其他碳青霉烯酶（IMP-2，VIM-1，VIM-2和KPC-2）水解厄他培南的速度较慢[4]。另外，美罗培南作为NDM-1、VIM-1、KPC-2、KPC-3、OXA-48和OXA-162这些酶的底物也有类似的实验结果[5]。此外，该方法也适用于对广谱β-内酰胺酶进行分类，如在酶底物（如青霉素、氨苄西林和亚胺培南）中添加β-内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸）可以区分AmpC与TEM-1酶[6]。
（2）确认是否存在指示抗药性（例如vanA，mecA或NDM-1）的PCR产物。如Sequenom MassARRAY SNP检测平台（Sequenom，Brisbane，Australia）是结合多重PCR技术、MassARRAY iPLEX单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术（MALDI-TOF）进行分型检测。将包含SNP位点区域的DNA模板通过PCR技术扩增，再使用特异的延伸引物与PCR产物进行单碱基延伸反应。由于多态性位点碱基不同，延伸产物不同的末端碱基将导致延伸后的产物分子量的差异，因此由SNP多态性引起的碱基差异通过分子量的差异而体现，再通过MALDI-TOF检测延伸产物分子量的大小，并应用专用的分析软件通过判断分子量的差异而进行SNP分型。如采用该平台通过MALDI-TOF MS成功鉴定了所有147株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的mecA PCR扩增子[7]。也有报道，引物延伸（PEX）反应与MALDI-TOF相结合，可用于巨细胞病毒（CMV）对更昔洛韦耐药性的检测[8]。与实时PCR和Sanger测序相结合的方法相比较，PEX/MALDI-TOF方法在不降低特异性的情况下能更早地揭示耐药性突变[8]。
（3）是否存在与药敏变化相关的抗菌药物的情况下，观察细菌蛋白质谱的变化。MALDI-TOF MS可以检测不同浓度的抗菌药物对某一病原体作用后的菌体蛋白质谱图，而使蛋白图谱发生明显变化的药物浓度（minimal profile change concentration，MPCC）即最小图谱变化浓度与通过基于CLSI肉汤的参考方法获得的MIC值之间具有很高的一致性。例如MALDI-TOF MS用于评估34种念珠菌和10种曲霉菌中由于fks突变引起的对卡泊芬净耐药性[9]。实验是将菌株暴露于类似BMD格式的浓度越来越高的卡泊芬净以及无药对照孔中，并在MALDI-TOF MS之前孵育15小时。然后，对于每种药物浓度，针对每种菌株计算MPCC。研究发现[9]所有菌株MIC（CLSI折点）或最低有效浓度（MEC）与MPCC结果的基本一致性（essential agreement，EA）为100%，而分类一致性（categorical agreement，CA）为94.1%。
2. 流式细胞仪（Flow cytometry，FC）：流式细胞术是目前一种用于对单个细胞或生物粒子进行快速定量分析和分选的先进技术。流式细胞荧光技术药敏试验（Flow Cytometry Susceptibility Testing，FCST）则是根据FC所检测到的荧光强度来判断经药物处理后的培养液中细菌的存活率，从而预测某种药物对特定病原体感染的治疗效果。
FCST常用的三种荧光染料分别为膜非渗透性、膜渗透性和膜电位敏感性。膜非渗透性，如碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）可被完整的细胞膜排斥在外。当荧光探针通过了被药物破坏的细胞膜，表示细胞对药物敏感。如PI进入细胞后结合至DNA上，FC测得死亡的细胞荧光强度增加。反之，膜渗性染料，如乙酰乙酸荧光素（Fluorescein Diacetate，FDA）可渗透入正常细胞的质膜，被胞内酯酶分解后发出荧光。膜电位敏感染料有：阳离子染料3，3—二戊基氧杂羰花青碘化物[（3，3-dipenty1oxacarbocyanine iodide，DiOC5（3）]和阴离子染料双（1,3-二丁基巴比妥酸）三甲氧肟醇[bis（1,3-dibutylbarbituric acid）trimethine oxonol，DiBAC4（3）]。前者在完整的细胞内荧光强度大，若抗生素的作用使细胞膜去极化可使其结合减少，荧光减弱，而后者则能结合于死细胞上。
在早期研究中，由荧光显微镜构成的初始流式细胞仪用于评估细菌暴露于抗菌药后的细胞形态或DNA，并可以在几个小时内检测到抗菌治疗的效果，这表明AST有望得到应用。较早的研究对于阐明各种染料或固定的组合也很有用，因为这可以通过FC更好地区分细胞活力状态[10]。1997年，碘化丙啶用于经两性霉素B或氟康唑处理过的白色念珠菌，以区分活或死亡细胞，并通过FC对其快速而灵敏地进行定量检测[11]。对于棘白菌素，卡泊芬净和其他唑类抗真菌药物也进行了类似的检测[12]，其AST的结果与其他形式的AST结果一致性为96%～99%，而且AST的检测时间从过夜孵育减少到1～2小时[13]。同样，在1997年，DiBAC4（3）作为细胞膜电位敏感性阴离子荧光染料，被证明非常适合大肠杆菌的AST检测[14]。有人对引起尿路感染的细菌进行AST测试[15]，表明经典纸片扩散法与DiBAC4（3）的FC测试法之间的一致性达到94%。FC也用于结核分枝杆菌的AST检测，如对于吡嗪酰胺敏感性试验，FC法与Bactec MGIT的结果一致为93%，而且FC在24小时内获得结果[16]。FC仪器的设计和性能已经取得了重大进步，但该技术尚未成为AST市场的主要参与者，即使目前已经推出了商业化的检测技术。
3. 振动悬臂称重微生物细胞（Microbial cell weighing by vibrating cantilevers）：悬臂包含有助于微生物通过的小管道，并可以使其不断振动。当细菌通过时，它们的重量（在飞克范围内）将导致悬臂运动的频率发生变化[17]。密度较低的细胞与密度较高的细胞会引起不同的变化。当用抗菌剂处理细菌时，其浮力质量密度会发生变化并可以被测量[18]。使用对氨苄青霉素耐药或敏感的鼠柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）变体已经证明了该方法的原理。另外，研究还显示是否存在氨苄青霉素的情况下，细菌渗透压休克后两种表型的复苏都可以在较短的时间内快速加以区分。悬臂可以使用纳米技术进行多路复用，从而可以同时针对单个生长培养物测试不同浓度的多种抗生素。
目前，开发了一种用于检测细菌生长的快速生物传感器[19]，其共振频率随悬臂梁质量增加而变化的函数是检测方案的基础，并能根据悬臂传感器的机械性能计算得出的质量灵敏度约为50pg/Hz（这个质量相当于大约100个大肠杆菌细胞）。该传感器能够在1小时内检测到大肠杆菌的活跃生长（最初附着悬臂的大肠杆菌平均为1,000个）。此外，可以在添加抗生素后2小时内，记录耐药细菌的非抑制性生长[20]。悬臂技术也被曾用于评估万古霉素与细胞壁前体的结合[21]和测量多粘菌素对铜绿假单胞菌的影响作用[22]。
使用悬浮纳米通道共振器（SNRs）显示溶液中细菌质量的测量甚至是更精确。SNR由带有嵌入式纳米通道的悬臂组成。此外，引入了一种新方法，该方法利用悬臂振动引起的离心力将颗粒捕获在SNR的自由端[23]。这种方法消除了SNR的固有位置相关的误差，并且通过增加每个粒子的平均“存在时间”来提高质量分辨率。另外，这将有利于在（改变）暴露于抗生素期间对有限数量的细菌进行连续质量监测。显然，悬臂系统和精确的重量测量为多路复用AST的开发提供了一个有趣的选择。
4. 等温微量热法（Isothermal microcalorimetry，IMC）：IMC是一种动态技术，可以通过以下方式测量热量的产生：流速（μW /单位时间），或源自活性生长细胞的新陈代谢并随时间的总累计量（焦耳/单位时间）。累积热量的产生通常与传统的生长曲线相平行，即累积热量的斜率和形状与经典的细菌生长的迟缓期、对数期和稳定期相一致。最大热量值代表了一段时间内产生的细胞总数[24]。该方法已经成功适应小体积的培养物（例如，1～3毫升），并且可以与固体或液体培养基结合使用[25]。基于动态热流模式，使用IMC可以鉴定尿液样本中的细菌种类，这甚至包括3小时内细菌计数低的尿标本[26]。当应用于AST时，热量的产生是被动地测量密封的小瓶。该小瓶中含有的细菌、培养基和以两倍浓度稀释的抗菌药物。最小热抑制浓度（Minimal heat inhibition concentration，MHIC）可以定义为抑制总热量产生的50%或导致热流率降低50%的最低药物浓度，这取决于所测试的药物。该过程需要特定的IMC仪器（例如TAM III，TA Instruments，New Castle，DE）来实时测量热量产生（检测极限在0.2μW范围内）。
使用IMC进行药物敏感试验并不是新的方法，已有成功应用于细菌AST的报道[24]。如分枝杆菌，包括结核分枝杆菌[25]，和真菌[27, 28]。当使用一段时间内的净热量作为细菌生长的替代指标时，IMC与BMD方法以及与CLSI和/或EUCAST的折点有良好的相关性。另外，IMC可用于评估抗微生物药物的协同作用。
5. 磁珠旋转（Magnetic bead rotation）：当磁珠进入旋转磁场时，它们会自我组装并呈现特定的旋转自旋。旋转频率可能受分子，病毒或细菌结合的影响。因此，如果磁珠配备有特异捕获细菌细胞的配体，则珠子的旋转在捕获时会发生改变，并可以测量这种变化。如果将肉汤培养物中的所有磁珠与一个或两个细胞配对，则可以通过将配体修饰的磁珠与稀释的细菌悬浮液温育，然后洗涤来完成，它们将恢复恒定的旋转频率。随着细菌开始分裂，旋转频率发生变化。如果由于易感性而使抗菌药物抑制或阻断了细胞分裂，那么这种变化将被阻止。如果细菌对所施加的抗菌剂具有抗性，则再次发生旋转频率的变化。通过这种方式，能够进行抗菌药物的敏感性的定性和被精准地定量。
基于异步磁珠旋转（AMBR）生物传感器的生长抗菌药敏性试验已经被报道[29]。在这个系统中，随着细菌的生长，可以观察到细菌对旋转磁场中自组装磁性微珠簇的旋转和形状的影响。旋转周期（RP）与周围介质（含有细菌，肉汤培养基和各种稀释度的抗菌剂）的阻力系数间接成正比。随着细菌繁殖并附着于细菌特异性抗体包被的磁珠，或者细菌生长培养基的粘度发生变化，RP就会增加，但可以通过增加抗菌剂的浓度防止这种RP随时间而增加的问题。这个过程可以通过发光二极管（LE）或激光照射培养液（以悬滴的形式）来直接观察。悬滴形式可以作为透镜并产生高达100倍的放大率，从而可以在显微镜下或投影到检测器上时，以观察珠粒聚体的结构和旋转速率。将2倍系列稀释的链霉素和庆大霉素添加到Mueller-Hinton肉汤中，而该肉汤含有预先结合在大肠杆菌标准接种物中的抗体致敏磁珠。在振荡磁场作用下，混合物形成了一个悬滴。随时间用显微镜观察RP的变化并记录。正如预期的那样，RP相对于细菌的生长而增加，而含有较高浓度抗生素的溶液显示增加最少。该方法可以小型化为纳升体积的油包水小滴[30]（每滴含50个或更少细菌），而且这样的变化大大减少了测试的持续时间。
6. 微滴中测试（Testing in microdroplets）：微滴或纳米滴可以是用作小型个体反应池。液滴可以是单独操作，并且当它们包含细菌有足够的数量，则细胞的代谢活性和活力可以被监视。一旦液滴乳化过程得到改进并且它的长期稳定性能得到保证，该系统的发展就变得容易[31]。一种由100-nl小滴组成（每小滴含103细菌和不同浓度的抗生素）的系统已经被开发出来[32]。通过使用表面荧光跟踪液滴随时间的变化，可以监测每个药物浓度下的生长曲线。最近，制备了含有单个细菌细胞的液滴[33]。这一技术可以小型化，并且对每个细菌的抗生素测试的数量容易多路复用，而且测试的持续时间可以短到一个或几个细菌复制周期。显然，在将这种方法作为一种常规AST工具进行评估之前，有必要对技术重复性进行评估，并开发足够的参考MIC数据库。
二、AST的未来技术方法
在过去的十几年中，已经设计并提出了几种创新的AST方法（见表1，如长期替代方法），但是大多数方法还没有引入常规的临床微生物学检验中。有些方法，如基于噬菌体的AST，可能比其他方法更接近于临床应用。基于噬菌体的策略已成功地适用于结核分枝杆菌的检测[34]，并通过加入包含荧光素酶基因的重组噬菌体实现了优化[35]。结果表明，荧光素酶测定可以在2天之内以低成本进行[36]，并可以成功地应用于发展中国家的实验室[37]。然而，尽管某些创新方法似乎很有希望，但尚未获得广泛的接受。
实时显微镜是创新技术之一，在不久的将来可能应用于AST。基于高分辨率相机系统的仪器已经商业化，并且显示出很高的效率[38]。该技术已拓展应用于在有或无抗生素的情况下观察微菌落和系列摄影，可为阳性血液培养瓶中的细菌[39]做到“1天AST”。这表明看似简单、老式的检测形式仍然可以改造成能更好地满足患者需求的自动化系统。有人提出了几种现代技术，可以作为临床微生物实验室中当今技术的未来替代方案，这些内容的简要描述见表1。但是，需要注意的是，对于所有AST的未来技术方法，其数据库开发尚未完成，而且这些技术的前景目前仍然不十分明朗。
三、小结
常规AST有其诊断局限性，通常耗时且测试结果滞后,尽管其方法非常可靠和备受推崇，通常也有CE(Conformite Europeenne)和FDA(Food and Drug Administration)认证。AST新技术可以快速和自动化，但任何AST新技术都必须与当前的参考标准方法（Broth microdilution，BMD）相比对，然而，呈现出显著改进的方法目前尚未见报道。但是，正如我们所综述的，未来几种简单、快速、稳定和特异的AST方法可能很快就会出现。
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