临床微生物实验室的生物安全管理

张鞠玲、曲芬*

解放军第三〇二医院临床检验医学中心

曲芬，解放军第三〇二医院临床检验医学中心主任医师，教授，北京大学医学部、解放军医学院及河北北方学院的硕士研究生导师，公派法国地中海大学访问学者。现任解放军第十届医学科学技术委员会检验医学委员；中国药学会抗生素专业委员会委员；中国研究型医院学会检验医学专业委员会委员；全国卫生产业企业管理协会实验医学专家委员会委员；中国医师协会检验分会精准检测和诊断专业委员会委员；华人药敏委员会（ChiCAST）学术顾问；中国合格评定中心医学实验室主任评审员。主要研究领域是临床微生物的诊断、耐药监测及耐药机制研究。进行新药的体外抗菌活性研究、质谱新技术的临床应用前评估多项。独立承担全军“十二五”重点课题等8项课题；以第一或通讯作者在国内外期刊发表论文200余篇，主编、副主编专著4部。获军队科技成果一等奖1项，军队医疗成果奖二等奖4项，三等奖5项；中华预防医学会科学技术成果二等奖1项。

实验室生物安全（laboratory biosafety）是指实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，可避免实验室人员、来访人员、社区及环境受到不可接受的损害，符合相关法规、标准等对实验室生物安全责任的要求【1】。微生物实验室工作人员由于有更多机会接触病原微生物而经常处于感染传染病的风险之中，更应高度重视。近年来由病原微生物引起的实验室感染事件不断增多，包括SARS冠状病毒、丙肝病毒、霍乱弧菌、布氏杆菌、出血性大肠埃希菌等感染均有发生【2-6】，并有可能扩散传播，加强防控更加关键。各国政府对实验室生物安全高度关注，分别制定相应的指南和策略【7-10】，我国也出台了相关的条例和准则【11-13】，强调每个实验室应根据自身的特点设计生物安全管理规划，加强生物安全意识，完善相关的硬件设施和仪器设备，从临床微生物实验室的设计、管理、监督、培训、应急处理等方面全方位提高生物安全管理水平，保护实验室工作人员和公众的健康。

1. 生物安全定位：临床微生物实验室多为生物安全防护二级实验室，适用于操作能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物；但不能从事高致病性病原微生物（炭疽芽孢杆菌、布鲁氏菌属、鼻疽伯克菌、伯氏考克斯体、土拉热弗朗西斯菌、牛型分枝杆菌、结核分枝杆菌、立克次体属和鼠疫耶尔森氏菌）的实验活动【11】。临床微生物实验室每天都要处理大量来自临床患者或健康体检者的生物样品包括血液、尿液、粪便等，可能含有潜在的生物风险因子包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等，常因在标本收集、运输、检测及废物处理过程中，因操作不当通过直接接触、污染或暴露、注射、搅拌、溢出、吸取、震荡等操作程序造成的生物性飞沫、气溶胶等引起员工被动感染【14】。如何系统管理来控制生物风险或采取措施将危害控制在最低水平是临床实验室管理的核心任务之一。

2. 环境要求：实验室主入口的门有进入控制措施，放置生物安全柜实验间的门应可自动关闭；实验室整体布局应设置不同的控制区域，明确区分清洁区（包括办公室、休息室，此区域严禁带入检验标本）、疑似污染区（包括清洁区和污染区链接部分，标本交接区域）、污染区（包括病原微生物检测、鉴定、药敏、菌种留取、相关实验等区域）；人流、物流、信息流有效分隔；按检测功能分为：标本处理前区、标本处理中区、标本处理后区；不相容的微生物检测活动如分枝杆菌和真菌检测，应有效分隔，并制定针对性的防护措施及合适的警告。为防止交叉污染，实验室保持整洁操作区台面、地面每日消毒，早上工作前用紫外线照射30min或每天工作后照射60min；微生物室的自然通风对防止气溶胶传播、病原微生物的交叉污染、保护工作人员健康至关重要，必要时应配备抽风机；此外应有足够方便的洗手间、饮水处和储存个人防护装备和衣服的设施【1，11】。

3. 设备需求：生物安全柜、高压消毒灭菌器、紫外灯、应急灯、离心机、洗眼器、高压灭菌器、喷淋等都是临床微生物实验室的必备设备。生物安全柜是实验室生物安全一级防护屏障中最基本的安全防护设备，其放置应远离气流不稳定的地方。二级生物安全柜依照入口气流风速、排气方式和循环方式可分为A1型（气流速度至少为0.38m/s，70%气体通过HEPA过滤器再循环，30%的气体通过排气口过滤排出）、A2型（气流速度至少为0.5m/s，70%气体通过HEPA过滤器再循环，30%的气体通过排气口过滤排出）、B1型（30%的气体通过供气口HEPA过滤器再循环至工作区，70%气体通过排气口HEPA过滤器排除）和B2型（B2型为100%全排型安全柜，无内部循环气流，可同时提供生物性和化学性的安全控制）4个级别，均实现了对环境、操作人员、样品及样品间交叉感染提供安全保护，B2型在上述功能的基础上增加可操作挥发性化学品和挥发性核放射物作为添加剂的微生物实验功能。生物安全柜的高效过滤器、气流、负压等参数需要至少每12个月进行检定或校准。

4. 人员培训：实验室生物安全的保障，人员的意识与执行是核心。工作人员的生物安全防控知识考核合格率在不同的国家及医院差别很大，如美国合格率在90%以上【7】；而巴基斯坦合格率不足50%【15】；波兰调查显示医护人员82%担忧工作中被感染，但不知如何防护，相比较经验丰富的专业人员感染率较低【16】；中国医学院校学生实验室生物安全知识和安全行为总体知晓率偏低,分别为42.65%和41.96%【17】，研究提示临床实验室对生物安全的不同需求。生物安全知识应以宣传、培训、考核等多种方式宣贯和督促，不断提高生物安全性认识水平。传染病及其相关的突发事件的增多，生物实验室工作的人员种类繁多，必须形成良好的职业的生物安全规范，对每个工作人员提供更详细和更全面的指导，贯穿整个工作过程，从防护服穿脱流程、生物安全标示识别、检验操作流程等方面进行监督，并定期评估培训效果[3]。特殊岗位（如操作高压锅）的检测人员还应符合相关规范的要求并取得相应上岗证。使全员关注、共同推广生物安全概念，控制生物风险【7】。

5. 操作过程：生物安全防护应贯穿检验操作的始终，包括检测样品在过程中产生的气溶胶；样品标本在采集、运输、交接、检测及处理过程中有可能直接感染、污染或实验过程中暴露于离心、搅拌、混合、吸取、震荡等操作程序所造成之生物性飞沫等环节。

（1）个人防护：进入二级生物安全实验室进行微生物操作的人员，必须进行个人防护。防护用品穿戴顺序为：洗手→戴帽子→戴医用防护口罩→穿工作衣裤→换工作鞋。可能产生致病微生物气溶胶或出现溅出的操作以及处理高浓度或大容量感染性材料更应谨慎，对特殊高致病性病原还需要穿隔离衣或防护服→戴护目镜/防护面罩→戴手套→穿鞋套。

（2）标本采集与送检：标本采集应严格按照管理条例执行【11】，采集标本时严格防护，应防止标本污染容器外表或随标本的检验单。如果存在潜在的或实际的污染，则应再加一层包装。标本需用

专门防渗漏及防溢出的容器盛放，试管应有螺旋口盖，送检标本人员需要专项培训，铭记来自所有患者的血液、体液和其他标本都被认为是具有传染性的，需加强防护。

（3）操作防护：离心操作如使用密封的离心机转子或安全离心杯，且只在生物安全柜中开闭，样品离心必须等离心机停稳1~2min后方可取出，以防止气溶胶污染；不能在生物安全柜内进行而必须采取外部操作时，为防止感染性材料溅出或雾化危害，必须使用面部保护装置(护目镜、面罩、个体呼吸保护用品或其他防溅出保护设备)。仪器检测废液加入有效氯(最终浓度为0.5％有效氯)以防生物污染。每天在实验室工作结束后，用紫外灯照射室内30min。用紫外线消毒时，灯管离台面不宜超过1米，消毒有效区域为灯管周围1.5-2.0米，每次时间不少于30分钟，以杀灭空气中的微生物。锐器防护：使用注射器和针具时应防止受伤。所有锐利物品在使用后都应放入专用锐器盒内，然后运至处理场所。废弃锐利物品的容器应就近放在便于操作的地方，应在未完全装满前或48小时之内及时更换。菌种保存及销毁： 医院保存菌种仅限于非高致病性病原微生物菌种，并需双人双锁保管，严防菌种意外流失。销毁时应有2人以上参加，并做好销毁记录。对超过规定保存时间的标本、培养物和菌种等应高压灭菌后再交保洁人员进一步处理，并进行交接记录。一旦鉴定出高致病性病原微生物（如布鲁菌、弗朗西斯菌、布氏杆菌等）及法定甲类传染病病原（炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌）时，应按相关法规要求进行上报和处理【18】。

（4）高压灭菌：实验室检测后的所有标本必须高压无害化处理后移出实验室，准备高压灭菌和／或将被处理的废弃标本和培养物应当放置在防漏的容器内。在丢弃到废弃物盛器中以前，顶部要固定好（如采用高压灭菌胶带）。污染物处理，沾有活菌的玻片等污染物品，放置在消毒桶内处理。检验剩余的标本及使用过的带菌平板、试管均须集中地点安全放置，经消毒灭菌处理后再洗涤或丢弃。医用垃圾与生活垃圾严格分开，黑色垃圾袋装生活垃圾，黄色垃圾袋装医用垃圾；装盛垃圾的垃圾桶应用脚踏式，或加盖；固体医疗垃圾套双层垃圾袋，防止泄露，定时或在装满3/4时及时清

理，运送到指定地点，集中焚烧，转运时应有防止锋利物刺破垃圾袋遗洒的防护措施。液体垃圾如病人尿液、胸腹水、呕吐物含氰化物等应倒入专门医用下水道，由医院统一消毒处理。血液标本由科室内专人收集高压灭菌后，交与医院垃圾处理站统一处理。锐利物应及时投入专用锐器盒，在装满前或48小时之内及时更换。压力灭菌器达到121℃ 15min才可以保证多数病原的灭菌效果，应每次使用化学指示剂，每周使用生物指示剂监测灭菌效果【12】。

6. 意外事件处理：发生意外事故时，应针对事故的类型立即进行紧急处理，主要包括：

（1）皮肤针刺伤或切割伤：应立即停止工作，用肥皂和大量流水冲洗，用力捏住受伤部位，向离心方向挤出伤口的血液，不可来回挤压。并用70%乙醇或其它消毒剂消毒伤口。粘膜污染时（如眼部）用大量流水（洗眼器）或生理盐水冲洗污染部位。

（2）污染物泼溅：如果病原微生物泼溅在实验室工作人员的衣服、鞋帽上或实验室桌面、地面，立即选用75%的酒精、碘伏、0.2-0.5%的过氧乙酸、500-10000mg/L有效氯消毒液等进行消毒。如果潜在感染性物质溢出，立即用布或纸巾覆盖，由外围向中心倾倒消毒剂，一定时间（约30分钟）后，清除污染物品，再用消毒剂擦拭。所有操作戴手套。发生大范围污染物泼溅事故时，应立即通知实验室主管领导和安全负责人到达事故现场，查清情况，确定消毒的程序。

（3）实验室发生高致病性病原微生物泄漏、污染：应及时向科主任报告，并立即封闭被污染的实验室或者可能造成病原微生物扩散的场所，防止高致病性病原微生物扩散；对密切接触者进行医学观察；进行现场消毒。发生空气污染：可采用低温蒸汽甲醛气体对空气进行消毒，但甲醛有致癌作用，不宜用于生物安全柜和实验室的常规空气消毒。

（4）突发事件处置：实验室感染最严重的突发事件可谓血源传播的慢病毒感染，包括乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和艾滋病病毒（HIV）感染，而且常为隐匿性的。可疑被HBV阳性血液接触伤口或注射，应边把伤口血液挤出、边用生理盐水清洗，然后立即注射抗乙肝病毒高效价免疫球蛋白和乙肝疫苗，同时检测标本血清学标记物，按照不同病原阳性结果进行相应处理；可疑被HCV阳性血液接触伤口或注射，立即用生理盐水清洗外，将伤口区域血液轻轻挤出，既往不推荐使用长效干扰素进行预防，因为这种方式的HCV感染往往为急性，联合用药临床治愈率几乎100%；但最近有HCV暴露后直接用抗病毒药物预防感染的报道，进一步将进行临床试验和成本效益分析证明干预措施的有效性【19】，同时应尽快做HCV抗体检查，并于4－6周后检测HCV RNA；可疑被艾滋病病毒（HIV）阳性血液接触伤口或注射，立即用生理盐水清洗外，将伤口区域血液轻轻挤出，根据专家意见立即口服抗艾滋病药物进行预防，并尽快检测HIV抗体，然后根据专科医生建议行周期性复查（如6周、12周、6个月等）。在跟踪期间，特别是在最初的6－12周，绝大部分感染者会出现症状，因此在此期间必须注意不要献血、捐赠器官及母乳喂养，过性生活时要用避孕套【20】。

实验室应每年进行生物风险评估，至少包括物理安全、员工安全、信息安全、标本转运及操作安全、意外事故处理的及时有效等，不断总结经验，提高实验室生物安全的整体管理水平【8】。

参考文献

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