血浆DNA监测可用于晚期肺癌患者的个体化化疗吗?

作者:潘世扬 &DDM
2021-12-16


1. 简 介

肺癌是全世界癌症死亡的主要原因,发现时通常已是晚期,整体生存率只有15%而且在过去25年内变化甚微。化疗通常是帮助患者改善生活质量和延长生存期的治疗选择。由于患者的化疗效果各不相同,因此在治疗早期评估肿瘤的治疗效果显得非常重要,为及时调整治疗方案从而获得更好的患者结局提供有价值的指导。常规的影像学技术以及很多分子生物学标志物通常需要通过侵入性手段获取肿瘤标本。相比之下,血浆循环DNA,从患者血液样本中即可获得,可能是更有效的预后工具。


以前的研究表明血浆DNA,又称为循环无细胞DNA,通过细胞溶解、坏死、凋亡和活性DNA释放进入血流。据观察,肺癌患者的血浆DNA浓度高于健康对照。尤其是,血浆DNA水平与肿瘤负荷相关且在化疗后下降。有人认为肿瘤细胞可能主动释放循环DNA。确实,循环DNA在经过有效治疗后相应下降。虽然有研究关注接受放、化疗的癌症患者的循环DNA或其他分子生物标志物,但是很少有研究明确这些检测是否可用于个体化抗癌化疗。

  

在本研究中,我们通过监测连续血样追踪晚期肺癌患者化疗期间血浆DNA水平的动态变化,试图评估血浆DNA浓度与不同化疗效果之间的相关性,以及确定血浆DNA定量检测是否可用于指导个体化抗癌化疗。


2. 方 法

2.1 研究人群

在2007年10月至2010年1月期间,来自南京医科大学第一附属医院肿瘤科、未经过放化疗治疗的88例新诊断肺癌患者参与了本研究。本研究获得了相应伦理委员会的批准。


他们均是不能动手术的晚期肺癌患者。非小细胞肺癌(NSCLC)患者的主要一线化疗方案是吉西他滨联合顺铂(GP)以及多西他赛联合顺铂(DC),小细胞肺癌(SCLC)患者的主要一线化疗方案是伊立替康联合顺铂(IP)。本研究检测了其中85例患者整个化疗期间的血浆DNA浓度。46例患者完成了4-6个周期的一线化疗但没有进行二线化疗;38例患者在一线化疗之后继续二线化疗;1例患者在一线化疗期间中途退出。从诊断日期到死亡日期或最后随访日期计算总生存率。最后获得了84例患者截至2010年11月的生存数据。本研究还包括另外3例患者,只调查首次化疗过程中的血浆DNA水平动态变化。


另外,到南京医科大学第一附属医院进行年度健康体检且根据临床和实验室检查明显健康的共200位志愿者(127位男性和73位女性,中值年龄为64岁)作为健康对照。


2.2 化疗效果

在本研究中,根据实体瘤疗效评价标准(RECIST),每两个化疗周期通过计算机断层扫描(CT)评估肿瘤缓解情况以评价化疗效果。化疗效果分类如下:完全缓解(CR),所有病灶消失;部分缓解(PR),靶病灶最大径之和减少≥30%;疾病稳定(SD),所有测量病灶最大径之和缩小<30%或增大<20%、无新病灶出现;疾病进展(PD),靶病灶最大径之和增大20%或出现新病灶。   


一线化疗之后,本研究根据观察到的最佳缓解情况将84例患者分为3组:44例患者达到PR,22例患者达到SD,18例患者出现PD,没有患者达到CR。


2.3 样本收集、制备和DNA提取

在85例患者开始首次治疗之前(1-7天)和每个化疗周期用药之后(3-5天),以及另外3例患者在首次治疗之前、用药后24小时和第一化疗周期结束之后3-5天,从外周静脉采集血样(2mL)至EDTA管(Becton Dickinson)中。对照静脉血样在200位健康志愿者年度健康体检期间获得。


所有血样均在收集后2小时内进行处理。通过两步离心法从血样中分离出血浆。将5×104个拷贝数量的内标重组质粒DNA加入到200μL无细胞血浆样本中。在进一步处理之前,将包含内标DNA的血浆样本以200μL等份冷冻储存于-70℃。


根据厂商推荐,使用基于磁珠结合原理的BILATEST Viral DNA/RNA Kit(BILATEC,Viernheim,Germany),从200μL包含内标DNA的血浆样本中提取DNA。在55μL TE中洗脱DNA样本供后续分析。


2.4 血浆DNA定量

使用TaKaRa Ex Taq 1 R-PCR Kit版本2.1(TaKaRa,Dalian,China)提供的组件,对同一反应管中总体积为25μL的人β-肌动蛋白基因(看家基因,在我们先前的研究中5000多例血浆样本均未检测到阴性结果)和内标重组质粒DNA进行双重实时PCR。使用两套Applied Biosystems 7500 Sequence Detector(Applied Biosystems,CA,USA)和水空白在96孔反应板中进行DNA扩增。


使用Sequence Detection System Software(版本1.4,Applied Biosystems)分析双重扩增曲线。定量结果计算公式如下,单位为千基因组-当量/升(kilogenome-equivalents/L):

 

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其中,C代表DNA浓度(kilogenome-equivalents/L),E指平均扩增效率,Ct是循环阈值,下标b和p分别代表人β-肌动蛋白基因和线性重组质粒DNA。使用6.6pg DNA/细胞(2-基因组-当量)作为转换因子将浓度单位转换为ng/ml。


2.5 统计分析

使用非参数技术(Kruskal-Wallis和Wilcoxon配对符号秩检验)比较不同化疗效果组之间的检测,分析组间差异。使用X2检验和Fisher精确检验比较按照化疗效果分组的患者特征。使用Kaplan-Meier方法计算患者总生存曲线并与对数秩检验相比较。P<0.05表示结果存在统计学显著差异。所有分析均使用Stata/SE 9.2(Stata Corporation,TX,USA)完成。


3. 结 果

3.1 临床特征

图1表示靶基因(人β-肌动蛋白基因)和内标质粒的双重实时PCR扩增图。在同一反应管内对两者同时进行提取和扩增。

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患者在血浆DNA与年龄、性别或吸烟历史之间没有显著关联。只有组织学类型与血浆DNA浓度相关(P=0.033)。鳞状细胞癌患者的血浆DNA水平低于其他患者(表1)。

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患者在接受化疗之前的血浆DNA定量中值为66.5ng/mL(范围19.0-265.7),显著高于健康对照(22.4ng/mL,范围:7.4-90.7)(P<0.001)。

3.2 化疗效果

经过化疗后,本研究比较了按照不同化疗效果分组的患者基线血浆DNA浓度与其他三个时间点即第一周期之后、第二周期之后和一线化疗完成之后的DNA水平。基线与第一周期之后以及第二周期之后的成对比较没有观察到显著差异。然而,本研究发现一线化疗后PR患者的血浆DNA浓度显著下降,但这种差异在SD或PD患者中未观察到(P=0.322和P=0.528)(图2)。一线化疗后PR患者的血浆DNA水平明显不同于SD和PD患者的水平(P<0.001和P<0.001),与健康对照没有统计学差异(P=0.186)。


3.3 生存率

在本研究中,最后一次随访时,患者的1年生存率为59.5%。


根据我们先前对5042位健康中国成人的队列研究,确定了血浆DNA浓度定量检测的临界值;血浆DNA水平的正常参考区间为0-50ng/mL。根据DNA浓度,使用50ng/mL临界值将本研究中的患者分为两组。通过Kaplan-Meier方法和对数秩检验,化疗之前血浆DNA水平与生存率没有显著关联,但经过第三周期化疗之后高DNA浓度与生存率下降显著相关(P=0.031)(图3)。


3.4 化疗期间血浆DNA的动力学

本研究收集连续血样以调查化疗期间血浆DNA水平的动力学(图4)。将每一位受试者第一化疗周期中用药的最后一天作为时间0,每条垂直线代表化疗周期(用药的最后一天),阴影部分代表血浆DNA水平的正常范围(临界值:ng/mL)。


图4中A-D表示化疗期间从患者队列(84例)中选择的四个代表性患者的血浆DNA水平的动态范围变化。患者1完成了6个周期的一线化疗(图4A)。CT扫描显示肿瘤显著缩小且肿瘤标志物下降,这与血浆DNA浓度进展性降低至正常范围对应。最后一例样本的血浆DNA为9.8ng/mL,甚至低于健康对照的中值(22.4ng/mL)。最后一次随访时,该患者仍然存活且疾病没有进展。相比之下,患者2(图4B)也完成了6个周期的化疗,但病情由于肿瘤转移而恶化。血浆DNA水平在整个治疗期间居高不下。由于肿瘤进展,患者3(图4C)接受了二线化疗;血浆DNA水平高于正常范围且CT扫描显示肿瘤大小与一线化疗结束时相比有所增大。经过3个周期的二线治疗后,CT扫描显示没有进展或转移,但血浆DNA水平显示持续升高而且患者感觉比以前更糟。经过我们建议,临床医生立即将化疗方案从多西他赛改为爱宁达;经过2个周期治疗后血浆DNA水平降至正常范围。随访结束后,该患者还存活了16个多月。另一方面,患者4(图4D)在肿瘤进展后也接受了二线化疗,但由于疾病快速进展,患者4的血浆DNA水平始终较高并于诊断后5个月便去世。


图4中E-G显示了另外3例患者在第一周期一线化疗期间的短期血浆DNA水平波动。这三位患者的变化趋势相同,即在用药后24小时内血浆DNA水平快速升高,停止治疗后下降。

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图2. 按照不同化疗效果分组的一线化疗前后患者的血浆DNA水平。PR代表部分缓解,SD代表疾病稳定,PD代表疾病进展。

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4. 讨 论

化疗对恶性肿瘤的治疗效果是多样化的,即使肿瘤显示出相似的组织病理学来源和临床分期。标准化疗方案优先杀死癌症细胞,但其治疗效果及对正常组织的毒性在不同患者之间各不相同。目前,个体化医疗的概念越来越受关注,有些临床试验表明晚期癌症患者采用个体化化疗方案或个体化药物剂量的治疗效果比采用标准化疗的效果好。因此能否在个体化治疗后短期内预测治疗效果至关重要。个体化治疗需要个体化检测,因此,开发可用于个体化抗癌治疗的准确检测是关键点。


寻求有效、实用的方法或指标来预测疗效和指导个体化用药在癌症研究中始终占据重要地位。在临床应用中,化疗治疗的效果主要通过影像学技术比如螺旋CT来评估。然而,通过CT扫描连续评估癌症进展期间的动态肿瘤变化是不可能的,而且这些传统影像学方法的灵敏度在近年来受到质疑。总血浆DNA定量只需要少量血样但比某些肿瘤特异性血浆DNA的灵敏度明显高得多,比如与肿瘤诊断或预测相关的突变、超甲基化基因或者microRNA遗传变异。因而,在过去几十年内,大家对易于测量的血浆DNA的应用越来越感兴趣。


高血浆DNA水平可见于非恶性疾病患者,包括创伤、肺栓塞、免疫介导疾病或炎症。本研究排除了这些类型的患者。据报道放、化疗可诱导肿瘤细胞和某些正常细胞死亡,表现为细胞凋亡,从而导致DNA释放进入循环。由于人循环DNA的半衰期非常短,异常升高的血浆DNA在48小时内即可从循环中清除。有些研究发现治疗用药后前几天的循环核小体或DNA水平的有所波动。本研究的结果与Kuroi的发现一致,他们发现血浆核小体在24小时达到峰值并在72小时后下降。DNA水平会在有效治疗用药后3-5天下降,因为机体成功清除了大量循环DNA。因此,本研究收集了化疗用药后3-5天的标本以评估化疗效果。


Holdenrieder发现在第二周期开始之前以及第三周期治疗之前核小体值与化疗效果相关,而Trejo-Becerril确定这个时间点为第三周期化疗。本研究发现,前两个或三个周期期间,血浆DNA的变化趋势与化疗效果有关,但显著下降发生在一线化疗结束之后。这表明只有一个或两个周期化疗诱导的肿瘤细胞减少不足以使接受长期化疗的晚期癌症患者的DNA水平显著下降。


有些作者报道血浆DNA浓度与无复发或总生存率无关,但另一些作者报道基线DNA水平或治疗期间的DNA浓度的确与生存率相关。本研究根据第三周期化疗后的血浆DNA水平(采用临界值50ng/mL)进行生存率分析,结果表明明显更长的生存期与较低的DNA浓度相关。这表示如果血浆DNA水平在三个周期化疗后仍高于正常范围,临床医生应考虑调整现行方案以获得更好结局。

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本研究监测了整个化疗期间晚期肺癌患者的血浆DNA浓度的动态变化。部分缓解患者的DNA水平逐渐下降,而疾病稳定或进展的患者的DNA水平仍维持高水平或升高。治疗期间血浆DNA的动态变化与化疗效果是相似的。此外,结果表明血浆DNA水平升高可敏感地反映化疗不当导致某些患者发生微小病变或毒性。最严重的药物毒性可诱导正常细胞连续死亡,从而使血浆DNA水平升高。发生显著临床毒性的患者都与血浆DNA升高有关。在40例死亡患者中,22例患者在死亡之前进行随访时血浆DNA水平持续升高。本研究中的9例患者由于持续较高的血浆DNA水平而改变了治疗方案。改变治疗方案后,血浆DNA水平下降且患者情况显著改善。这9例患者均获得了1年多的生存期。


DNA定量采取的各种提取方法以及标本的长期储存可导致DNA水平每年下降约30%,从而导致结果偏移(bias)。本研究在每份血浆样本中加入已知数量的重组质粒DNA作为内标,消除样本储存、DNA提取和PCR扩增引起的偏差。这就成为一种更可靠的血浆DNA定量测量方法,使长时间监测的标本更具可比性且准确度高。我们的研究团队在先前的研究中使用这种方法成功量化了5042位健康中国成人和地震创伤患者的血浆DNA浓度。


在晚期肺癌患者的治疗中,化疗方案的选择和疗效预测对于延长患者生命至关重要。血浆DNA是一种预测晚期肺癌患者化疗效果的有意义的生物标志物,同时还可用于提示抗癌化疗药物的副作用。化疗期间进行血浆DNA水平监测可指导临床医生修改和调整最适合患者的治疗方案,以实现有效的个体化治疗。