原位杂交操作规程

　　（一）仪器设备

　　医用微波炉；水浴锅。

　　（二）试剂

　　0.2mol/LHCl：HCl8.2ml，H20定容0.5L。0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺5.33ml，H20定容0.4L。.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺13.2ml，NaCl5g，浓HCl4ml，H20定容0.98L，醋酸酐（用前加）2.5ml。20×SSC(pH7.0)：NaCl175.3g，枸橼酸钠88.2g，H20定容1L。100×Denhardt's：Ficoll1g，PVP1g，BSA1g，H20定容50ml。杂交液：Formamide5ml，20×SSC2.5ml，Dextransulfate1g，100×Denhardt's0.5ml，10%SDS0.5ml，10g/LspermDNA0.1ml，H201.4L。BufferⅠ（pH7.5）：0.1mol/Lris·Cl，0.15mol/LNaCl。BufferⅢ（pH9.5）：0.1mol/LTris·Cl，0.1mol/LNaCl，0.05mol/LMgCl2。BufferⅣ（pH8.0）：10mmol/LTris·Cl，1mmol/LEDTA。

　　（三）操作流程

　　1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天

　　1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；

　　2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；

　　3）95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；

　　4）PBS清洗3分钟；

　　5）2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；

　　6）PBS清洗10分钟；

　　7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；

　　8）PBS清洗2次，每次3分钟；

　　9）0.2N的HCl孵育30分钟；

　　10）PBS清洗2次，每次3分钟；

　　11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；

　　12）PBS清洗2次，每次5分钟；

　　13）预杂交缓冲液孵育30分钟；

　　14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；

　　15）杂交；第二天

　　16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；

　　17）PBS清洗3分钟；

　　18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟；

　　19）PBS清洗5分钟；

　　20）室温，2×SSC清洗10分钟；

　　21）37℃，1×SSC清洗10分钟；

　　22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；

　　23）缓冲液A孵育10分钟；

　　24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；

　　25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim），37℃孵育3小时；

　　26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；

　　27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；

　　28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；

　　29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；

　　30）固红，脱水以及封片进行核的复染。

　　2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天

　　1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；

　　2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；

　　3）95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；

　　4）PBS清洗5分钟；

　　5）2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；

　　6）PBS清洗5分钟；

　　7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟；

　　8）PBS清洗2次，每次5分钟；

　　9）0.2N的HCl孵育30分钟；

　　10）PBS清洗2次，每次5分钟；

　　11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；

　　12）PBS清洗5分钟；

　　13）预杂交缓冲液孵育30分钟；

　　14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；

　　15）杂交；第二天

　　16）将玻片置于SSC中以去除封片；

　　17）室温，2×SSC清洗10分钟；

　　18）37℃，1×SSC清洗10分钟；

　　19）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；

　　20）缓冲液A孵育10分钟；

　　21）缓冲液A孵育30分钟；

　　22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时；

　　23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；

　　24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；

　　25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；

　　26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；

　　27）固红，脱水以及封片进行核的复染。