由ACTH假阳性引发的一系列思考
尹逸丛 | 北京协和医院检验科技师
卢琳 | 北京协和医院内分泌科主任医师
库欣综合征又称皮质醇增多症，是由于多种病因引起肾上腺皮质长期分泌过量皮质醇所产生的一组综合征。内源性库欣综合征分为ACTH依赖性和ACTH非依赖性。
原发性色素沉着结节性肾上腺皮质病（PPNAD）是ACTH非依赖性库欣综合征的罕见类型，好发于青年患者，隐匿起病，病情较轻，病程长。
患者为男性，自2016年（11岁）开始出现脸变圆、面部及后背部痤疮，近3年体重增加明显（约15kg），近2年身高增长缓慢（2cm），出现毳毛增多，病程中监测血压间断升高。
2019年8月24日因“生长迟缓”就诊外院，查血常规未见异常，8:00AM血促肾上腺皮质激素（Adrenocorticotropic Hormone，ACTH）<1pg/mL。
2019年8月26日就诊我院，查下丘脑-垂体-肾上腺轴：8:00AM血ACTH 25.4pg/mL（参考范围：0-46pg/mL），24h尿游离皮质醇257.3ug/24h（参考范围：12.3-103.5ug/24h），血皮质醇节律消失，结果如下图所示：
甲状腺功能指标正常，其他垂体前叶功能筛查未见异常。多发性内分泌腺瘤方面筛查未见明显异常。
该患者为青少年男性，隐匿起病。
临床表现：脸变圆、面部及后背部散在痤疮，近2年身高仅增长2cm，但体重增加明显，病程中监测血压间断升高。
入室查体：生命体征平稳，身高154.5cm（＜3th百分位），BMI：32.67kg/m2（＞95th百分位）腰围104.5cm。均匀肥胖，毳毛增多，面部、后背皮肤可见痤疮，颈部、腋下可见黑棘皮征，左眼巩膜可见局部色素沉着。脸偏圆，锁骨上脂肪垫（±），水牛背（±）。
辅助检查：血糖方面，3hOGTT提示胰岛素抵抗；多次查血皮质醇升高同时ACTH水平不低，皮质醇昼夜节律消失，过夜小剂量、大小剂量联合地塞米松抑制试验血皮质醇及24h尿皮质醇均不被抑制，呈现反常性升高。
患者的临床表现和辅助检查结果提示ACTH依赖性库欣综合征。影像学检查提示垂体核磁见垂体柄偏移，垂体增大，内部信号不均；胸腹盆增强CT、生长抑素受体显像未见明确肿瘤；肾上腺CT平扫未见明显异常。
但患者当地医院检查ACTH（<1pg/mL）与我院ACTH（25.4pg/mL）结果差别大。
在库欣综合征的病因鉴别诊断方面如ACTH<10pg/mL提示非ACTH依赖性库欣综合征（通常因肾上腺病变自主分泌皮质醇导致），ACTH>20pg/mL则提示ACTH依赖性库欣综合征（通常因垂体病变或异位内分泌肿瘤分泌ACTH导致）[1]。因此临床医师联系检验科对ACTH不一致的结果提出疑问。
经检验科进行多平台比对和进一步确认，该患者在我院西门子化学发光法平台的ACTH检测受异嗜性抗体干扰，致ACTH假阳性升高，患者的多次测定ACTH<5pg/ml。
基因检测结果提示存在PRKAR1A基因存在致病突变，支持患者诊断为：ACTH非依赖性库欣综合征，原发性色素结节性肾上腺病（PPNAD）。
经过多科讨论后，患者接受右肾上腺切除术，术后恢复良好，皮质醇下降明显，体重逐渐减轻，身高增长速度较前增快。
我院检验科检测ACTH的平台为西门子Immulite2000，接到临床医师的反馈后，进行了以下实验。
1. 核实近一个月ACTH的质控。 2. 连续倍比稀释试验
异嗜性抗体干扰存在的情况下，稀释试验结果通常不呈线性。用西门子平台配套的稀释液将血样分别稀释2倍、4倍、8倍，结果发现倍比稀释回收率较差，尤其在4倍、8倍稀释后，提示ACTH检测受干扰，结果如下图所示。
3. 不同分析平台检测
将样本同时送至罗氏Cobase601、索灵XL及安图LumoA2000平台检测，结果显示在上述平台检测结果一致，均小于定量限。与西门子Immulite2000检测的结果差异大。
4. PEG沉淀试验
异嗜性抗体通常为大分子蛋白，用20%的PEG6000沉淀血浆中的大分子蛋白后检测上清ACTH，结果显示PEG沉淀后患者的ACTH降至定量限下（21pg/mL降至<5pg/mL），而对照样本变化不大（38.4pg/mL降至32pg/mL）。
5. 异嗜性抗体阻断试验
西门子Immulite2000的ACTH检测试剂所用标记抗体来源于小鼠，因此选择针对小鼠的异嗜性抗体阻断剂HBR11、HBR22、HBR26进行试验，结果显示HBR22阻断有效，阻断前后的ACTH由21.1pg/mL降至<5pg/mL。
上述试验提示该患者的ACTH结果在西门子Immulite2000的检测受到异嗜性抗体的干扰，导致ACTH检测结果假阳性，干扰临床诊断。
库欣综合征是一种罕见疾病，在病因的诊断过程中，ACTH是重要的鉴别指标。
如清晨血ACTH<10pg/ml，需要考虑肾上腺病变如腺瘤、腺癌、原发性大结节肾上腺增生和原发性色素结节性肾上腺皮质病导致，考虑为ACTH非依赖性库欣综合征。
如清晨血ACTH>20pg/ml，则需要考虑垂体腺瘤或者异位ACTH综合征，考虑为ACTH非依赖性库欣综合征。
如ACTH在10-20pg/ml则需要仔细鉴别病因。因此ACTH水平决定了下一步的检查方向和治疗。
临床医生对ACTH的波动存在疑问的原因是什么呢？该患者为青少年库欣综合征患者，查体方面观察到巩膜褐色斑，这通常是Carney复合征的表现之一，而PPNAD是Carney复合征的肾上腺功能亢进的表现。
Carney复合征是1985年被命名的一种疾病，主要包括黏液瘤、皮肤黏膜斑点状色素沉着和内分泌功能亢进3项主要表现。而该患者存在巩膜棕色色素沉着斑和高皮质醇血症，确需要考虑Carney复合征的可能。后续进行基因检测也检出了PPKAR1A致病突变。
如考虑Carney复合征，该患者库欣综合征病因是否为PPNAD呢？进一步检查发现在大小剂量地塞米松抑制试验中血皮质醇和24小时尿皮质醇不仅未被抑制，反而进一步升高，这也是PPNAD的地塞米松试验的独特特点，因此该检查进一步支持PPNAD的诊断。
因此，根据患者的查体、生化激素检查和基因检测明确了患者库欣综合征为Carney复合征，PPNAD的诊断，手术切除肾上腺的大体可见肾上腺组织内多发黑色素结节及手术后的良好效果也证实了该诊断。
而ACTH检验波动的原因需要考虑以下方面。
首先因ACTH呈脉冲式分泌并且有昼夜节律性，ACTH的最高水平出现在清晨6AM-8AM，男性和女性的平均脉冲频率分别为18次和10次每24h，平均峰值幅度分别为16.8ng/L和10.3ng/L[2]，临床推荐在清晨8点采集ACTH样本，固定采血时间可以消除昼夜节律对ACTH的检测波动的干扰。
ACTH的采集容器一般为肝素锂或EDTA-K2抗凝的塑料管，ACTH在玻璃容器中易吸附，如必须使用玻璃管，需使用硅化后的玻璃管。
库欣综合征专家共识中推荐[3]为避免ACTH被血浆蛋白酶迅速降解，需用预冷的EDTA试管收集血浆标本，取血后置于冰水中立即送至实验室低温离心检测。
检测过程中因ACTH不稳定，在制备和保存ACTH质控品时应小心谨慎，尽量冷冻干燥保存，若质控品为液体应分为小份储存于-70℃并避免大量储存质控品。当发现ACTH检测结果与临床诊断不符合时，及时与临床医师沟通。
全自动化学发光免疫法通量高，灵敏度高，精密度佳，但免疫法不可避免地会受到非特异性干扰。
ACTH的检测原理是双抗体夹心法，上述案例中，异嗜性抗体伪装成ACTH与试剂中的捕获抗体和标记抗体结合，导致结果的假阳性。
异嗜性抗体的筛查试验有连续倍比稀释试验、更换检测平台、PEG沉淀及异嗜性抗体阻断剂。联合应用上述筛查试验对异嗜性抗体的检出更具有价值。
异嗜性抗体干扰的案例在临床常规中并不少见，除ACTH外，性激素、甲状腺激素、HCG等项目也容易受到干扰，因此要求检验工作者在审核报告时擦亮双眼，增加与临床医师的沟通，为临床及患者出具更加精准的结果。
在库欣综合征的诊断过程中，如果晨起的ACTH>20pg/ml，而MRI未检出可见垂体腺瘤，一般会建议患者行介入检查，双侧下岩窦取样(BIPSS)。虽然BIPSS手术风险较高，费用较高，但它库欣综合征定位诊断的金标准。
在本案例中，患者的ACTH>20pg/ml，垂体未见明显腺瘤，通常情况下要接受BIPSS检查。但我院医师注意到该患者的巩膜处有褐色色素斑，面部散在黑斑，这些特征常出现在Carney综合征，而在ACTH依赖性库欣综合征中相当罕见。Carney综合征常表现在原发性色素结节性肾上腺病（PPNAD）[4]。
PPNAD是非依赖性ACTH库欣综合征中罕见的类型。经过检验科工作人员的最终证实，该患者ACTH水平较低，与其他的临床证据相符，使该患者免于BIPSS检查。基因检测的结果与手术切除也进一步证实了该患者的诊断。
PPNAD好发于青少年患者，是非ACTH依赖性库欣综合征比较罕见的类型，在库欣综合征中所占比例不足1%。迄今为止，国内外对该病报道例数较少，加之病情较轻，部分患者呈亚临床状态，临床多有误诊漏诊，存在延误诊断治疗的情况。 本案例从临床提出ACTH与临床诊疗不符开始，检验科通过标本连续倍比稀释试验、不同分析平台检测、PEG沉淀试验、异嗜性抗体阻断试验等方法确认了异嗜性抗体干扰ACTH检测造成其结果假阳性，从而为临床诊疗提供了可靠的依据。 异嗜性抗体干扰在免疫项目常用方法中比较常见，该案例全面分享了处理异嗜性抗体干扰的方法，为检验人对异嗜性抗体的处理起到了参考作用。 整个案例思路清晰、数据详实、分析严谨、语言流畅，完美展示了检验结果与临床诊疗不符时的分析思路，同时也为检验与临床通力合作起到了示范作用。
相较于睾酮、雌二醇等激素，ACTH干扰临床很少见，国际上报道也相对较少，但后果都更为严重，其中不乏多例行BIPSS，甚至垂体切除的案例。 本例的识别获益于临床医生丰富的经验和敏锐的洞察力，同时我们团队在处理该案例时也积累了新的经验，如“4倍稀释基本呈线性时如何进一步处理？”“PEG沉降中，一个质控品也发生了结果降低如何解释”，“非特异阻断剂（HBT）未成功阻断时如何进一步根据试剂抗体选择特异性阻断抗体类型”等。 我们试验的结果直接指导了临床诊疗，避免了一次可能的IPSS有创检查；同时完善了处理可疑异嗜性抗体干扰的流程，为临床提供了借鉴。用科研的态度解决临床问题，这将成为新时代打造检验工匠精神的核心理念。
鸣谢：
感谢王林杰大夫和张学斌大夫对患者的悉心诊治，感谢胡莹莹老师和赵芳老师对实验的帮助和指导。
【参考文献】
[1]C. Beauregard, G. Dickstein, A. Lacroix, Classic and recent etiologies of Cushing's syndrome: diagnosis and therapy, Treat Endocrinol. 2002;1(2):79-94.
[2]Talbot, J. A., et al. Analytical and clinical aspects of adrenocorticotrophin determination. Ann Clin Biochem, 2011 Apr;164(4):505-12.
[3]中华医学会内分泌学分会.库欣综合征专家共识.中华内分泌代谢杂志, 2012,28(2).
[4] Kamilaris CDC, Faucz FR, Voutetakis A, Stratakis CA. Carney Complex. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2019 Feb;127(2-03):156-164.
来源：检验医学
