蒙了！新冠核酸扩增曲线起始荧光值越过阈值...

疫情反复肆虐加快了新冠核酸检测的发展，为了国人的出行方便，越来越多的检验人员加入了核酸检测的大军，缺乏足够有效的实践，检验人在核酸检测中只能迎难而上，边做边学边实践。

报告一批核酸检测从拆核酸样本到结果的报告需要至少3-4h，若出现质控失控、试剂失效等找寻相应的原因后整批次的结果还必须重新检测，这是我们检测人员最不愿发生的事情。作为初入核酸检测大军中的一员，最怕的就是遇到问题时自己却不知道该怎么去查找原因，怎么去处理。记得刚上核酸那会儿，精神紧张，下班以后根本睡不着觉，总担心会不会哪里操作不规范导致污染影响后续的检测工作等，甚至于睡梦中的自己仍在检测新冠核酸的岗位上。

经过3个多小时的忙碌，一批核酸检测的结果出来了，搭班老师却告诉我，这批次检测的新冠核酸曲线很奇怪，还没有遇到过这样的曲线，较多样本的曲线在检测的一开始荧光值就超过了阈值线，见下图1：

作为初入新冠核酸检测的我看到这曲线，当时就慌了，是什么原因才导致这样的情况呢？科室安排一个班次核酸检测由两名核酸检测人员完成，本次我主要负责新冠核酸样本的处理和提取，搭班的老师负责试剂的配制、上机扩增，由于核酸曲线异常为第一批次核酸的检测，没有找到原因之前，也不敢继续做下一批次。

我努力回想我的操作过程，样本的处理及提取均按说明书要求进行；搭班老师扩增试剂的配制依照说明书复融后配制、正常上机布板。

科室目前使用的初筛试剂有两种，使用两种试剂进行新冠检测的样本处理和提取是相同的，不同的是加入样本的量与扩增试剂的量，如下表1

以往新冠核酸检测采用的为试剂1，由于试剂1已使用完，本次核酸检测采用的是试剂2，从表1中可以看出试剂1中待测样本的使用量较小仅仅只用5ul，而试剂2中样本量增加至20ul，样本量与扩增试剂量的比例也发生了明显的变化，那么本次异常曲线的出现是由于样本量的改变导致的吗？

实时荧光RT-PCR扩增曲线主要分为线性基线期、指数扩增初期、指数期、平台期，在线性基线期时由于为PCR扩增的起始阶段，扩增产物很少，所产生的荧光信号值较低，此时仪器采集的信号为荧光背景本底信号；

进入指数初期，荧光强度开始明显升高，超过阈值，所采集到的荧光信号明显超出荧光背景本底信号；到了指数期后，由于试剂中的dNTP、引物、探针等组分很充足，DNA酶活性很高，PCR的扩增达到最高的效率，荧光值快速增长至平台期；进入平台期，由于dNTP、引物、探针的不断消耗，DNA酶活性随着反应时间延长而逐渐降低，扩增效率下降，荧光信号将增长缓慢或不再增长。

由于本次新冠核酸检测采用的是试剂2，操作时将提取后的20ul样本加入已配制好的扩增试剂的8联管中，用适配的8联管盖子紧盖立即瞬离后交由扩增区老师上机扩增。由于是第一次使用该试剂，并未将样本与扩增试剂在8联管中混匀而直接瞬离上机，因而怀疑可能是扩增试剂与加入提取好的样本未充分混匀，荧光信号不稳。

试剂程序从扩增的第一个循序开始采集荧光，由于样本与扩增试剂未混匀出现了分层，导致实际采集的可能仅仅某一组分（扩增试剂或者样本）的背景信号，而该背景信号相对高，随着扩增循环次数的增加，经过仪器的不断高温加热，样本与扩增扩增试剂开始混匀，荧光反而下降，最终表现为初始扩增10个循环中，荧光强度由强到弱的反常！

为了确定是否是该原因，对核酸样本重新加样提取，在扩增试剂的8联管中加入20ul提取后样本，盖紧8联管，颠倒混匀后再瞬离消除气泡交由扩增区老师上机扩增，扩增曲线并未再出现初始荧光值较高的情况！

对于很多经验丰富的前辈来说，加样量的改变未注意样本与扩增试剂混匀不应该的，但作为初入新冠核酸检测人员，遇到的问题还会很多，每一次的遇到都是我们的一次进步；那遇到问题时一次次的紧张，解决问题后的豁然开朗，终将是我们成长的阶梯。