抗击疫情新武器：MPA技术在新型冠状病毒快速精准核酸检测中的应用价值
全球范围内的感染性疾病中，呼吸道感染最为常见，也是严重威胁人类健康的疾病，能够引起呼吸道感染（肺炎）的病原微生物包括细菌和病毒（部分为真菌感染）。根据世界卫生组织2015年数据，下呼吸道感染导致的死亡人数占全球总死亡数的3.19%，位列全球主要死亡原因的第3位，其中肺炎是全世界儿童因感染导致死亡的主要原因。中国爆发的2019年新型冠状病毒nCoV自1月份确认后，波及20多个国家，并已被世界卫生组织（WHO）宣布为全球紧急事件。截止2020年02月10日13时，在我国已有40239例确诊患者，23589例疑似病例，造成了909例死亡，直接和间接造成的经济损失更是无法估计。
当前，新冠病毒的疫情防控正处于关键时刻，对呼吸道感染的快速筛查和鉴别诊断是指导治疗，控制疫情传播的最重要手段，核酸检测仍是确诊新冠肺炎不可或缺的手段。依据WHO 2019新型冠状病毒指南和中国 第五版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》，都强调针对疑似患者进行实验室检查时，采集上呼吸道和下呼吸道、血液、粪便标本，通过实时聚合酶链反应技术（Real-time PCR）进行nCoV检测，其结果可用于快速识别、确诊或判断是否治愈。基于RT-PCR分子诊断技术对于呼吸道病原体的检测具有精准、即时反应感染情况的优势，得益于分子诊断产品的日益成熟，2019-nCoV疫情的检测手段和确诊速度已远远超过2003年爆发的SARS（非典）疫情。因此，研发和应用优质、快速、准确、成本低、操作简单、通用性好的诊断试剂，不仅对目前2019-nCoV的疫情控制有重要的现实意义，也对整体呼吸道感染类疾病长期监控、分流诊疗有着长远的指导意义。
目前，很多2019-nCoV核酸检测试剂盒（单靶标）已广泛用于新冠病毒检测，为疫情防控发挥了巨大作用，但仍有很多问题亟待解决：
1.目前，诊治的2019-nCoV患者中，存在有其他呼吸道病原体的合并感染，如甲流、乙流、呼吸道合胞病毒等；
2.在使用2019-nCoV核酸检测试剂检测结果为阴性，但伴随着呼吸道临床症状的患者，如何鉴别治疗？
3.未来可能与细菌性呼吸道感染、季节性流感流行期的重合，增加了目前2019-nCoV防疫工作的难度。
上述问题，也为试剂研发人员提出更高要求。如何诊断混合感染，做到更精准的诊断和治疗？如何应对有临床表征但2019-nCoV核酸检测阴性的病例？如何应对可能的2019-nCoV与其他呼吸道感染爆发期重合，包括季节性流感、社区获得性肺炎等？一款试剂盒如果能在检测2019-nCoV的同时，又可筛查常见呼吸道感染病原体的试剂盒，将会更好地解答上述临床“痛点”，更好地助力当前疫情防控，也是未雨绸缪，为未来更复杂的感染情况做好准备。
引起呼吸道感染的常见病原体多达20-30种，而传统的RT-PCR方法在设计上是每一靶标设计一套引物扩增，而且每个荧光通道检测一个目标序列，这样即使最好的荧光PCR仪器平台，同时检测靶标也只能限制在5或6个以内。市场上一些多靶标联合检测试剂则存在诸多缺陷，如需要专用设备，通用性不好，检测通量也不够，并且试剂价格昂贵，很难满足当下一线筛查的需求。广州市宝创生物技术有限公司长期致力于病原微生物的分子诊断技术，利用多重探针扩增（Multiplex Probe Amplification，MPA）的国际专利技术很好地克服了RT-PCR多重检测的限制，突破荧光PCR仪通道数的瓶颈，可允许每个荧光通道分别检测多达六个不同的靶标，从而可以实现在一个PCR反应管中实现多靶标（18重）同时检测。
检测原理：基于MPA原理的分析试剂中预先包含了针对多个靶标核酸序列的特异性PCR引物和荧光探针，经过通常的PCR反应以扩增样本靶标。如果样本中含有待测的靶标目标，则探针与反应产物形成的复合物会产生特征性的熔解曲线峰，应用软件对此熔解曲线峰图谱进行自动判读，即可判断在原始样本中是否存在待测靶标（见图1）。
图1 基于MPA技术的新冠病毒核酸检测过程
宝创公司全体研发人员克服严重疫情的干扰，经过全力攻关，争分夺秒研发出的2019新型冠状病毒核酸检测试剂盒，可在一个PCR反应管中进行3通道多重检测，同时检测和区分2019-nCoV的ORF lab、N基因区域及内源性内标。另一个呼吸道18种病原体核酸分型检测试剂盒（呼吸道病毒联检，RVP）则可同时检测包括2019-nCoV在内的18种呼吸道常见病毒及非典型病原体，包括：2019-NCoV、甲流、乙流、副流感1、副流感2、副流感3、副流感4、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒、偏肺病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43。样本提取后的核酸经单管多重扩增后，使用多重溶解曲线分析，即可在每个荧光通道上判读多个病原体的特征曲线。本系列试剂盒经多批次的临床新冠肺炎患者样本实际验证，结果显示与确诊结果的一致性达100%。另外，同时在研的15种常见呼吸道感染细菌及非典型病原体检测试剂（呼吸道细菌联检，RBP）可一管检测15种常见呼吸道感染细菌及非典型病原体，包括：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎支原体、肺炎衣原体等（见表1 ）。
组合RVP+RBP试剂可构建和实现对常见呼吸道病原体的“1+1”全方位检测模式（见图2 ）。联合检测模式时，可同时检测2019-nCoV及其他32种呼吸道感染病原体，为目前国内外覆盖面最全的检测试剂（mNGS除外），基本涵盖临床上常见的呼吸道感染病原体。单独检测模式时，可根据流行季节和发病情况选择单管（RVP）检测2019-nCoV和其他17种常见呼吸道感染病毒（包括非典型病原体），用以区分2019-nCoV与其他冠状病毒、其他呼吸道感染常见病毒,有效应对合并感染和其他症状相似的非2019-nCoV感染；或选择单管（RBP）检测15种常见呼吸道感染细菌（包括非典型病原体），全面筛查我国社区获得性肺炎的常见流行菌种。
图2 基于MPA技术的常见呼吸道病原体“1+1”全方位检测模式
基于MPA技术开发的常见呼吸道病原体RVP、RBP试剂，创新应用国际专利技术，解决了一直困扰病原微生物检测中单管多靶标联检的问题，实现了以最便捷的检测获得最全面的结果。既可以服务当前疫情防控的大局，也可以应对日渐增加的新挑战，如混合感染、不明症状（发烧、咳嗽）感染。目前国内外未见同等技术水平的类似试剂，填补了国内空白，宝创公司已完成该试剂盒的定型和申报，力争将更多高质、快捷的试剂支援到疫情防控的一线，助力疾控部门、医疗单位高效应对疫情的挑战，夺取最后的胜利。
本技术主要优势：
（1）多重实时荧光PCR：于一次PCR简单反应，即可检测与鉴别 18个靶标，并可为混合感染提供有效的信息；
（2）专利技术：专利的MPA技术配合独特的荧光探针，可保证检测的高敏感度和特异度；
（3）实验快速：从样本提取到获取最终结果仅需90分钟；
（4）平台兼容性：无需昂贵、专一的设备，可使用多种常用的荧光PCR平台（罗氏、ABI、宏石等）；
（5）自动化软件判读：全自动化数据分析软件，并可与LIS（实验室信息管理系统）连接；
（6）内标质控：可监控取样、运输/保存、检测的有效性；
（7）更高的检测通量：节省时间并降低试剂成本，减少对样品进行单独测试的次数可降低污染风险，并可保存珍贵的样品材料。
（8）试剂成本：所有试剂（引物、探针、酶）均为国产或自研，试剂成本低，适合筛查推广。
【背景链接 】广州市宝创生物技术有限公司成立于 2009年，位于广州市科学城国家级高新技术企业孵 化器。是一家以分子诊断技术为主导，专注于个体 化医疗靶标检测，集临床检验试剂和仪器研发、生 产、销售为一体的生物医药高科技企业。公司拥有 两套十万级洁净厂房、万级阳性洁净厂房、万级阳 性洁净检验室、万级微生物限度检验室和标准基因 扩增(PCR)实验室；拥有各种设备，包括：各种微 生物培养箱、高速冷冻离心机、PCR扩增仪、测序 仪等；并建立通过CFDA质量管理体系核查的生产 制造体系；以此为基础，搭建起一个集研发→临床 实验→申请注册→生产→销售→服务的专业平台， 为科研到商品的转化提供一条龙的服务平台。公司 注重产品的研发与服务，不仅与国内外知名大学、 研究所进行合作，获得多项专利技术，而且建立了 强大的研发队伍，从事研发和相关技术创新活动的 科技人员占企业职工总数比例超过50%。目前开发 的技术平台包括全自动化核酸提取平台、胶体金平 台、干化学平台、荧光POCT平台、纳米金可视化平 台、荧光定量平台、快速单链杂交平台、直接杂交 捕获平台等，产品涉及核酸提取、快速诊断、优生 优育、肿瘤个体化、微生物检测、病毒检测、耐药 突变检测、遗传多样性等全方位诊断领域，为精准 化医疗保驾护航。
广州市宝创生物技术有限公司 供稿
收稿日期：2020-02-10
